İnsan hepatositlerinin izole edilmesi için bir modifiye edilmiş iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer memeli karaciğerinden uygulanabilir. Izole hepatositler onları böyle karaciğer rejenerasyonu, farmakokinetik ve toksikoloji gibi alanlarda bilimsel araştırmalar için uygun bir model yapma, yüksek verim ve canlılığı mevcuttur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Karaciğer, istisnai bir rejenerasyon kapasitesine sahip bir organ, örneğin detoks, metabolizma ve homeostasis gibi işlevleri geniş bir yelpazede, yürütmektedir. Gibi, hepatositler araştırma soruları büyük bir çeşitlilik için önemli bir model vardır. Özellikle, insan hepatosit kullanımı farmakokinetik, toksikoloji, karaciğer rejenerasyonu ve translasyonel araştırma alanlarında özellikle önemlidir. Bu yüzden, bu yöntem, Seglen 1 tarafından tarif edildiği gibi hepatositleri izole etmek için iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedürünün modifiye edilmiş bir versiyonunu göstermektedir.
Daha önce, hepatositler, mekanik yöntemlerle izole edilmiştir. Bununla birlikte, enzimatik yöntemler hepatosit izolasyonundan sonra, yapısal bütünlüğü ve işlevi muhafaza üstün olduğu gösterilmiştir. Burada yer Bu yöntem, 77 ±% 10 arasında bir canlılığı ile hepatosit büyük bir verimle insan karaciğer parçaları ve sonuçlar sıçan karaciğer için daha önce tasarlanmış yöntemini uyarlar. AnaBu prosedürde fark kan damarlarının kanülasyon işlemidir. Bundan başka, burada tarif edilen yöntem, ayrıca, karaciğer karşılaştırılabilir veya kan damarı boyutları ile diğer türlerden elde edilen karaciğer uygulanabilir.
Giriş
Bir karaciğer hücre süspansiyonu, mekanik ya da enzimatik yöntemlerle karaciğer hazırlanabilir. Bütün karaciğer hücreleri hazırlamak için kullanılan mekanik yöntemler, tülbentten 2 vasıtasıyla karaciğeri zorlayan bir Kahn çalkalayıcı 3 cam boncuklar ile bir karaciğer parçası sallayarak, yılda vb gevşek havan elleri 4,5 ile cam homohenizatörlerin kullanarak dahil, mekanik yöntemler dışına düşmüş nedeniyle hücre zarlarına hasar ve izole edilmiş hepatositlerin 6,7 fonksiyon kaybına lehine. Sonuç olarak, bir enzimatik yöntem şu anda kullanımı hepatositlerin izolasyonu için ana yöntem.
Berry....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Perfüzyon ve Yalıtım Çözümleri hazırlanması
- Karaciğer parçası ve Tablo 1 'e göre hepatositlerin izolasyon perfüzyon için gerekli olan çözümler hazırlayın. Çözümler, kullanılana kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Steril filtre 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm çözümler.
- Karaciğer ile temas eden bütün çözeltiler steril olmalıdır.
2. Perfüzyon Ekipman ve Çözümleri hazırlanması
- Şekil 1 'de gösterildiği gibi, karaciğer parçanın perfüzyon için donatım kadar ayarlanmalıdır.
- Su banyosu her bir deneysel kurulum farklıdır uygun bir sıcaklı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Perfüzyon Kur
Karaciğer perfüzyon için gerekli ekipman, Şekil 1'e göre ayarlanmış olmalıdır.
Canlılık ve İzole İnsan Hepatositlerin Verim
Izole edilmiş insan hepatositlerinin ortalama canlılığı, 77 ±% 10 ve hepatositlerin ortalama verim ± standart sapma olarak ifade edilen değerler ile, 13 ± 11000000 hepatositler / g karaciğer idi. Hepatosit izolasyonların sayısı bu ortalama 648 izolasyonların Aralık 2012 Ocak 1999 yürü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, yüksek sağlamlık ve saflıkta insan hepatositlerinin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu sonuçları elde etmek için, bu karaciğer uygun bir parça ile başlamak önemlidir. Karaciğer parçası 1 kesme yüzeyi hariç tüm yüzeylerde bozulmadan Glisson kapsülü olmalıdır. Bir diğer önemli faktör farklı partisi sindirim 11 sonra hepatositlerin canlılığında belirgin farklılıklara neden olabilir olarak, kullanılan kolajenazın belirli bir küme olduğu. Bu nedenle, kolajenaz, farklı gruplar halinde test edilmelidir ve en.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu protokolün optimizasyonu kısmen Hepacult GmbH bir hibe ile finanse edildi. Dr Wolfgang THASLER Hepacult GmbH kurucularından biri olan ve bu şirkette yönetim kurulu üyelerinden biri olmaya devam etmektedir. Maresa Demmel istihdam Hepacult tarafından kısmen. Maria Hauner Hepacult GmbH tarafından istihdam edilmektedir. Hepacult rızası ve araştırma amaçlı açık erişimli insan hepatositleri sunmaktadır Üniversitesi'nden bir spin-off biyoteknolojik firmadır.
Teşekkürler
Bu çalışma araştırma için insan dokuları kullanılabilir hale İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı tarafından mümkün olmuştur. Ve Hepacult GmbH bu iş için finansal destek Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (: Sanal Karaciğer Ağ, hibe sayısı 0.315.759 hibe adı) alındı. Bizim sayesinde de karaciğer perfüzyon ve hepatosit izolasyonu yapılması için karaciğer örnekleri ve Hücre İzolasyon Çekirdek Tesisinden teknik asistanların koleksiyonu için Grosshadern Hastanesi Doku bankası teknik asistanlar gidin. Özellikle, biz video Bu prosedürü göstermek için Natalja Löwen teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, videonun şematik genel Şekil 1 için illüstrasyonlar v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kabarcık tuzağı | Gaß ner Glastechnik | ||
| Cam kılıflı kondenser | Gaß ner Glastechnik | ||
| 41 & derece; C Su banyosu | Julabo | 35723-H24/EG& | nbsp; |
| 37 & derece; C Su banyosu | GFL | 1083 | |
| Basınçlı gaz tüpü (% 95 O2< / sub> / 5 % CO2< / sub>) | Linde | ||
| Gaz geçirgen boru | Neolab | 2-4440& | nbsp; |
| Peristaltik pompa | Ismatec | IP65 | |
| Neşter | Tüyü | 320010 | |
| Forseps | Omnilab | 5171014 | |
| Erlenler 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Konik şişeler 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beherler | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml santrifüj tüpleri | Becton Dickinson | 352075 | |
| Kristalize kap | Omnilab | 5144063 | |
| Bilyalı uçlu kavisli sulama kanülleri | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Mikro vasküler klempler | Ernst Kratz GmbH | ||
| Bü chner hunisi | Carl Roth | HT38.1 | |
| Naylon ağ 210 & mu; m | Neolab | 4-1413 | |
| Naylon ağ 70 & mu; m | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μ m steril filtreler | Peske | 99505 | |
| 500 ml şişelerde | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L şişe | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemositometre | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tüpler | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml konik tüpler | BD Biosciences | 352070 | |
| Buz kovası | Neolab | 1508454 | |
| Steril Pastör pipetleri | Marka | 747715 | |
| Motorlu pipet doldurucu (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Buzdolabına uygun santrifüj | Eppendorf | 5810R | |
| Laminer akış | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspiratör (Düşük akışlı cerrahi emiş pompası) | Atmos | C361 | |
| Laboratuvar Gaz Brülörü | Integra | Fire Boy eco | |
| Tek kullanımlık laboratuvar önlüğü | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Siperlikli cerrahi maske | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Cerrahi başlık | Bariyer | 42072 | |
| Lateks eldiven | Semper Care | CE0321 | |
| Kollajenaz (Parti numarası NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Kalsiyum klorür dihidrat | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodyum klorür | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potasyum klorür | Serva | 26868 | |
| Albümin | Biomol | 01400-2& | nbsp; |
| Glikoz | Serva | 22700 | |
| Sodyum hidrojen karbonat | Serva | 30180 | |
| % 0.4 Tripan mavisi çözeltisi | Lonza | 17-942E | |
| Soğuk hava deposu çözümü | Hepacult GmbH |
Kaynaklar
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
