Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

Özet

İnsan hepatositlerinin izole edilmesi için bir modifiye edilmiş iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer memeli karaciğerinden uygulanabilir. Izole hepatositler onları böyle karaciğer rejenerasyonu, farmakokinetik ve toksikoloji gibi alanlarda bilimsel araştırmalar için uygun bir model yapma, yüksek verim ve canlılığı mevcuttur.

Özet

Karaciğer, istisnai bir rejenerasyon kapasitesine sahip bir organ, örneğin detoks, metabolizma ve homeostasis gibi işlevleri geniş bir yelpazede, yürütmektedir. Gibi, hepatositler araştırma soruları büyük bir çeşitlilik için önemli bir model vardır. Özellikle, insan hepatosit kullanımı farmakokinetik, toksikoloji, karaciğer rejenerasyonu ve translasyonel araştırma alanlarında özellikle önemlidir. Bu yüzden, bu yöntem, Seglen ¹ tarafından tarif edildiği gibi hepatositleri izole etmek için iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedürünün modifiye edilmiş bir versiyonunu göstermektedir.

Daha önce, hepatositler, mekanik yöntemlerle izole edilmiştir. Bununla birlikte, enzimatik yöntemler hepatosit izolasyonundan sonra, yapısal bütünlüğü ve işlevi muhafaza üstün olduğu gösterilmiştir. Burada yer Bu yöntem, 77 ±% 10 arasında bir canlılığı ile hepatosit büyük bir verimle insan karaciğer parçaları ve sonuçlar sıçan karaciğer için daha önce tasarlanmış yöntemini uyarlar. AnaBu prosedürde fark kan damarlarının kanülasyon işlemidir. Bundan başka, burada tarif edilen yöntem, ayrıca, karaciğer karşılaştırılabilir veya kan damarı boyutları ile diğer türlerden elde edilen karaciğer uygulanabilir.

Giriş

Bir karaciğer hücre süspansiyonu, mekanik ya da enzimatik yöntemlerle karaciğer hazırlanabilir. Bütün karaciğer hücreleri hazırlamak için kullanılan mekanik yöntemler, tülbentten ² vasıtasıyla karaciğeri zorlayan bir Kahn çalkalayıcı ³ cam boncuklar ile bir karaciğer parçası sallayarak, yılda vb gevşek havan elleri ^4,5 ile cam homohenizatörlerin kullanarak dahil, mekanik yöntemler dışına düşmüş nedeniyle hücre zarlarına hasar ve izole edilmiş hepatositlerin ^6,7 fonksiyon kaybına lehine. Sonuç olarak, bir enzimatik yöntem şu anda kullanımı hepatositlerin izolasyonu için ana yöntem.

Berry ve Friend ⁸ sıçanlarda portal ven aracılığıyla karaciğerden kolajenaz ve hiyalüronidaz perfüze zaman, bir enzimatik yöntem ile hepatositlerin izolasyonu büyük ölçüde geliştirilmiştir. Bu perfüzyon işlemi yol açan, enzimler, hücrelerin çoğunluğu ile yakın temas için izin vermek üzere damarsal kullanılanhepatositlerin ⁸ veriminde 6-katlık bir artış. Bundan başka, bu yöntem, hemen hemen izole vezikülleri içine endoplazmik retikulum hiçbir dönüşüm ve hiçbir zarar mitokondriyal ^8, yapısal bütünlüğünü muhafaza hücreleri elde edildi.

Bu yöntem, karaciğer hücre izolasyonu için iki aşamalı bir prosedür perfüzyon öncülük Seglen ^1, modifiye edilmiştir. Bu prosedürde, sıçan karaciğer Ca ^{2 + 1} ihtiva eden bir kolajenaz perfüzyon tampon maddesi ile, ardından bir ^{Ca2 +} serbest tamponu ile perfüze edilmiştir. Ikinci aşamada Ca ^{2 +} eklenmesinin uygun kolajenaz aktivitesi ^1.9 için gerekli iken, birinci aşamada Ca ^{2 +} kaldırılması, dezmozomlar bozmak için yardımcı olur.

Yukarıda tarif edilen yayınlanmış çalışma sıçanlarda gerçekleştirildi olduğu göz önüne alındığında, bu makalede yüksek uğultu canlılığı ile hepatositlerin izolasyonu için kullanılabilecek modifiye edilmiş bir prosedürü ortaya koymayı amaçlamaktadırBir ciğeri. İnsan hepatositlerinin kullanılması translasyonel araştırma için ve hayvan modelleri kullanılarak deneyler doğrulamak için önemli olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada kullanılan insan karaciğer parçaları İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı, bir devlet kontrolündeki kâr amacı gütmeyen vakfın ¹⁰ ile yönetişim için rıza ile elde edildi. Bir patolog tanı için gerekli ne uzaklaştırıldıktan sonra, karaciğer parçaları ve geri kalan dokulardan toplanmıştır. Patolog tarafından kapalı kesitli doku morfolojik karaciğer rezeksiyonu sonrası rezeksiyon marjları elde edilen sağlıklı doku oldu.

Protokol

1.. Perfüzyon ve Yalıtım Çözümleri hazırlanması

1. Karaciğer parçası ve Tablo 1 'e göre hepatositlerin izolasyon perfüzyon için gerekli olan çözümler hazırlayın. Çözümler, kullanılana kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. Steril filtre 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm çözümler.
3. Karaciğer ile temas eden bütün çözeltiler steril olmalıdır.

2. Perfüzyon Ekipman ve Çözümleri hazırlanması

1. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, karaciğer parçanın perfüzyon için donatım kadar ayarlanmalıdır.
2. Su banyosu her bir deneysel kurulum farklıdır uygun bir sıcaklıkta, en ayarlanmalıdır da karaciğer parça ulaştıklarında çözeltiler 37 ° C sıcaklıkta şekildedir. Bu durumda, su banyosu Çözümleri 1, 2 ve 3 ile kaplanmış cam soğutucu ısınmaya 41 ° C'de ayarlanır. Çözüm 4 ısındı edilmelidirKollajenaz aktivite kaybını azaltmak için kullanım için ayrı bir su banyosu içinde 37 ° C.
3. Kısa bir süre karaciğer perfüzyon önce,% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ oksijenlenme aparatı (Şekil 1E) gaz içeren gaz tankı regülatör açın.

3. Karaciğer Perfüzyon

1. Sadece 1 kesme yüzeyi ile ideal mümkün ve olduğunca sağlam Glisson kapsülü ile bir karaciğer parçası perfüzyon için bir patolog elde edilmelidir.
2. Delikli bir filtre diski (Şekil 1 B) içeren bir Büchner hunisi üzerinde, bu parça karaciğer yerleştirin.
3. Perfüzyon sistemi Çözüm 1 ile astarlanmalıdır.
4. Düşük bir akış oranı ile, zeytin uçları eğri bir sulama kanüller karaciğer parçasının kesme yüzeyi üzerinde daha büyük kan damarlarının içine yerleştirilmelidir. Kan karaciğerden dışarı basması gibi, doku perfüzyonu iyi olan yerlerde hafif olur. Çeşitli boyutlarda için kullanılan kanül sayısıkaraciğerinin Şekil 2A'da gösterilmiştir. Seçilen göstergesi boyutu yerinde kanüller yapacak oturması sonuçlanmalıdır. Küçük kan damarları, karaciğer parçasının dışarı boşaltmak için perfüzyon tamponu için açık bırakılmalıdır.
5. Karaciğer (Şekil 2B) büyüklüğüne bağlı olarak, ml / dak 110-460 arasına peristaltik pompa ile ilgili akış hızını artırır. Bu, 44 ± 16 arasında bir ortalama akış oranında ml / dak kanül başına (Şekil 2C) ile sonuçlanır. Seçilen hızı karaciğer parça bağlıdır ve karaciğer parçasının hafif plumping kadar sonuçlanmalıdır. Bazı durumlarda, yukarıda bahsedilen hafif plumping elde etmek için mikro vasküler kıskaçlar ile açık kapların bir kapalı sıkıştırılması için gerekli olabilir. Karaciğer parçası boyunca açık renk olduğunda iyi bir perfüzyon görülebilir.
6. Fizyolojik ile ıslatılmış gazlı bez parçası ile kaplayıp perfüzyon sırasında nemli karaciğer parçasını tutun.
7. Herhangi r dışarı atılması için Çözüm 1 1 L serpmekkaraciğer parça kan emaining.
8. Çözüm 2 perfüzyon sıvısı değiştirin ve 10 dakika boyunca perfüze.
9. Çözüm 3 perfüzyon sıvısı açın ve 0,5 L. ile serpmek
10. Kollajenaz (Tablo 2) 0.1-0.15% içerir Çözüm 4'e perfüzyon sıvısını değiştirin.
11. Karaciğer yeterli sindirilir kadar bu adım için, perfüzyon 9-12 dakika boyunca, bir devri daim şekilde gerçekleştirilebilir veya olmalıdır; karaciğer dokusu Glisson kapsülü altında ayrı hafif kırmak ve bir de kör tarafı ile problanmıştır zaman yumuşatılmış hissetmek görünmelidir neşter.

4. Hepatositlerin izolasyonu

1. Peristaltik pompayı kapatın ve karaciğer parça kanüller kaldırın.
2. Çözüm 5 100-200 ml ihtiva eden bir kristalizasyon çanağında karaciğer parça yerleştirin.
3. Dikkatle Glisson kapsülü kaldırın ve yavaşça hücreleri silkelemek. De perfüze olmayan bölgeler yoksa, bir neşter kesmek için kullanılabilirBu bölgeler içinde bulunan hücreleri serbest bırakmak için. Gibi sürecinde ihtiyaç duyulan daha Çözüm 5 ekleyin.
4. 500 ml'lik bir nihai hacim elde edilene kadar daha fazla Çözüm 5 ekleyin.
5. Iki hücre süspansiyonu filtre, ilk önce bir 70 mikron naylon elek, ardından bir 210 um naylon elekle. Daha sonra, 200 ml santrifüj tüplerine hücre süspansiyonu dökün.
6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 72 g hücre süspansiyonu santrifüj Aspire edilen süpernatan ve yavaşça Çözüm 5 200 ml yavaşça tekrar süspansiyon hücre topağı.
7. Yıkama adım numarasını 4.6 üç kez tekrarlayın. Son santrifüj adım, soğuk depolama çözümü tekrar süspansiyon hücreleri (malzemelerin listesine bakınız). Hücreler, bir hemositometre tabanlı bir tripan mavi dışlama tahlili kullanılarak verim ve canlılığı değerlendirilmesi için mililitre başına yaklaşık 2-5000000 hepatositler olmalıdır.
8. Bir tripan mavi dışlama tahlili gerçekleştirmek için, tripan mavi soluti, 0.5 ml ihtiva eden bir mikrofüj tüpüne (≈ 2-5000000 / ml), uygun şekilde seyreltilmiş 0.1 ml hücre eklemekon (% 0.4 tripan mavi fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde çözülmüş) ve 0.4 ml PBS. İyice karıştırdıktan sonra hücre süspansiyonu, süspansiyon ile bir hemasitometre yük ve 100X büyütme ile mikroskop altında incelenmiştir. Canlı hücreler boyanmamış görünür iken mikroskobu altında, ölü hücreleri mavi boyanmış olacaktır. Menositometrede işaretli 1 mm ² bloğun her birinde canlı ve toplam hücre sayısını. Canlılık (%), canlı hücre verimi (ml soğuk depolama çözümü (CSS) başına milyon hepatositler veya g karaciğer başına milyon hepatositler) aşağıdaki formüller kullanılarak hesaplanabilir.

Not: Bu durumda, tripan mavi seyreltme faktörü 10 ve hemositometre faktör 10.000 'dir.

Sonuçlar

Perfüzyon Kur

Karaciğer perfüzyon için gerekli ekipman, Şekil 1'e göre ayarlanmış olmalıdır.

Canlılık ve İzole İnsan Hepatositlerin Verim

Izole edilmiş insan hepatositlerinin ortalama canlılığı, 77 ±% 10 ve hepatositlerin ortalama verim ± standart sapma olarak ifade edilen değerler ile, 13 ± 11000000 hepatositler / g karaciğer idi. Hepatosit izolasyonların sayısı bu ortalama 648 izolasyonların Aralık 2012 Ocak 1999 yürütüle...

Tartışma

Bu protokol, yüksek sağlamlık ve saflıkta insan hepatositlerinin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu sonuçları elde etmek için, bu karaciğer uygun bir parça ile başlamak önemlidir. Karaciğer parçası 1 kesme yüzeyi hariç tüm yüzeylerde bozulmadan Glisson kapsülü olmalıdır. Bir diğer önemli faktör farklı partisi sindirim ¹¹ sonra hepatositlerin canlılığında belirgin farklılıklara neden olabilir olarak, kullanılan kolajenazın belirli bir küme olduğu. Bu nedenle, kolajenaz, farklı gruplar halinde test edilmelidir ve en...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kabarcık tuzağı	Gaß ner Glastechnik
Cam kılıflı kondenser	Gaß ner Glastechnik
41 & derece; C Su banyosu	Julabo	35723-H24/EG&	nbsp;
37 & derece; C Su banyosu	GFL	1083
Basınçlı gaz tüpü (% 95 O2< / sub> / 5 % CO2< / sub>)	Linde
Gaz geçirgen boru	Neolab	2-4440&	nbsp;
Peristaltik pompa	Ismatec	IP65
Neşter	Tüyü	320010
Forseps	Omnilab	5171014
Erlenler 1 L	Schott Duran	2121654
Konik şişeler 5 L	Schott Duran	2121673
Beherler	Schott Duran	2110654
200 ml santrifüj tüpleri	Becton Dickinson	352075
Kristalize kap	Omnilab	5144063
Bilyalı uçlu kavisli sulama kanülleri	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Mikro vasküler klempler	Ernst Kratz GmbH
Bü chner hunisi	Carl Roth	HT38.1
Naylon ağ 210 & mu; m	Neolab	4-1413
Naylon ağ 70 & mu; m	Neolab	4-1419
0.22 μ m steril filtreler	Peske	99505
500 ml şişelerde	Schott Duran	2180144
1 L şişe	Schott Duran	2180154
Hemositometre	Peske	06-0001
1.5 ml tüpler	Eppendorf	0030 120,086
50 ml konik tüpler	BD Biosciences	352070
Buz kovası	Neolab	1508454
Steril Pastör pipetleri	Marka	747715
Motorlu pipet doldurucu (Pipette boy acu)	Integra	155017
Buzdolabına uygun santrifüj	Eppendorf	5810R
Laminer akış	Kendro	Hera safe-KS9
Aspiratör (Düşük akışlı cerrahi emiş pompası)	Atmos	C361
Laboratuvar Gaz Brülörü	Integra	Fire Boy eco
Tek kullanımlık laboratuvar önlüğü	Paperlynen GmbH	MD0202414
Siperlikli cerrahi maske	Kimberly-Clark	48247
Cerrahi başlık	Bariyer	42072
Lateks eldiven	Semper Care	CE0321
Kollajenaz (Parti numarası NB 4G)	Serva	17465
Kalsiyum klorür dihidrat	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodyum klorür	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potasyum klorür	Serva	26868
Albümin	Biomol	01400-2&	nbsp;
Glikoz	Serva	22700
Sodyum hidrojen karbonat	Serva	30180
% 0.4 Tripan mavisi çözeltisi	Lonza	17-942E
Soğuk hava deposu çözümü	Hepacult GmbH