Polimer Microspheres ve Fiber-optik Paketler kullanma İnsan Tükürük Protein Analiz için çoklu Floresan Microarray

Summary

Bu multiplekslenmiş mikroküre bazlı antikor dizileri kullanılarak, tükürük proteinlerini profil için bir prosedür tarif eder. Monoklonal antikorlar, kovalent karbodiimid kimyası kullanılarak floresan boya ile kodlanmış 4,5 um polimer mikro bağlanmıştı. Modifiye mikroküreler floresan sandviç immunoassay'ler kullanılarak tükürük protein seviyelerini ölçmek için fiber-optik mikro oyuk birikmiştir.

Abstract

Burada, aynı zamanda, bir fiber-optik mikroküre bazlı antikor dizisi kullanarak tükürük proteinlerini altı ölçmek için bir protokolü tarif eder. Kullanılan immüno-dizi teknolojisi, floresan mikroskobu kullanımı ile mikroküre bazlı süspansiyon dizi üretim avantajlarını bir araya getirmektedir. Video protokolde tarif edildiği gibi, ticari olarak temin edilebilen 4,5 um, polimer mikrosferleri, fiziksel olarak mikro kürelerin içine sıkışıp iki floresan boyaların konsantrasyonu ile ayırt yedi farklı türde kodlanmış edilmiştir. Yüzey karboksil grupları içeren kodlanmış mikro EDC / NHS birleştirme kimyası ile monoklonal antikorlar ile modifiye edilmiştir. Protein mikrodizi monte etmek için, kodlanmış ve işlevselleştirilmiş mikrosferlerinin farklı karıştırılır ve rasgele kimyasal olarak bir fiber optik demetin yakın ucunda dağlanmıştır 4,5 um olan mikro oyuk, yatırılır. Fiber optik demeti, bir taşıyıcı madde ve hem de m görüntülenmesinde kullanılmıştıricrospheres. Monte edildikten sonra, mikrodizi klinik toplanan tükürük yüzer proteinleri yakalamak için kullanıldı. İzleme, bir streptavidin-konjuge floresan prob, R-fikoeritrin farklı analitler için biyotinile edilmiş antikorların algılama oluşan bir karışımı kullanarak, bir sandviç bağışıklık dayanıyordu. Mikrodizi mikroküre kayıt ve değerlendirme sinyali için biri için üç farklı kanal, iki floresan mikroskop ile görüntülendi. Floresan Mikrograflarda sonra çözülür ve MATLAB bir ev yapımı bir algoritma kullanılarak analiz edildi.

Introduction

Mark Schena ve 1990'ların ortalarında arkadaşları tarafından bildirilen ilk mikroarray beri, bu güçlü araç, biyolojik araştırmaların ^1. birçok alanda kullanılmıştır. Aynı zamanda, kan gibi teşhis sıvıları, birden fazla proteinleri saptayabilen antikor mikrodizileri, klinik teşhis ve biyolojik tarama ^2-10 önemli uygulamaları vardır. Tükürük, kan gibi aynı analitlere birçok içeren, tükürük toplama, güvenli ve noninvaziv çünkü kan bir tercih alternatif olarak kabul edilmiştir, ve minimal-eğitimli tıbbi personel ^11-13 tarafından yapılabilir. Şu anda, tükürük numuneleri kullanılarak çoğaltılmış çok katlı protein analiz hedef analitin ¹⁴ en düşük konsantrasyonu ve farklı biyolojik ¹⁵ arasında geniş bir konsantrasyon aralığı dahil olmak üzere, pek çok önemli faktör tarafından sınırlıdır.

.

Burada, altı proteinlerinin analizi gösterilmektedir: insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), interferon gama-kaynaklı protein 10 (IP-10), interlökin-8 (IL-8), epidermal büyüme faktörü (EGF), matriks metalopeptidaz 9 (MMP-9), ve interlökin-1 beta (IL-1β) . Yöntemin performansı ilk olarak rekombinant proteinleri analit teşkil eden ve bloke edici tampon standart solüsyonları kullanılarak doğrulandı. Farklı kronik solunum yolu hastalıklarının hasta hem de sağlıklı kontrollerden toplanmış gerçek tükürük numuneleri, aynı zamanda tatmin edici bir performans ile test edilmiştir. Protokol diğer protein analit ve diğer mikroküre bazlı deneylere uygulanabilir olmalıdır. Bir ile karşılaştırıldığında, geniş bir dinamik aralık, en az spesifik olmayan etkileşimleri, daha az örnek tüketimi, ve düşük maliyet ile çeşitli proteinlerin düşük konsantrasyonlarda hızlı, doğru ve tekrarlanabilir bir eş zamanlı olarak analiz sağlar Bu platform, Analitik Kimya alan için önemli bir avantaj sunar benzer Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Protocol

Şekil 1. . Tükürük profil için fiber optik mikrosfer antikor dizisi tatbik edilmesi için iş akışı (1) Mikro dahili olarak iki floresan boyalar ile kodlanır, (2) harici olarak şifrelenmiş mikro proteinine özel monoklonal antikorlar ile modifiye edilir, (3) birden fazla mesaj göndermiş mikro karıştırılır, (5) tükürük proteinleri sandviç bağışıklık tahlili ile mikro tarafından yakalanır, ve (6) floresan mikroskobu kullanılarak belirlenmiştir, ve (4) rasgele bir fiber optik demetin yakın ucunda kabartma mikro oyuk yatırılır.

1.. Mikroküreler Kodlama

1. Bir amber cam şişe içinde sodyum öropyum (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrat (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) tartılır ve tetrahidrofuran (THF) içinde bir 200 mM stok solüsyonu hazırlanır. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın; görsel doğrulamakboya tamamen çözülür.
2. Bir amber cam şişe içinde kumarin 30 (C30, MW = 347,41 g / mol) tartılır ve THF içinde bir 12 mM stok solüsyonu hazırlanır. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın, görsel boya tamamen eriyene doğrulayın.
3. Tablo 1'de listelenen nihai konsantrasyon elde etmek üzere stok çözelti ve THF kullanılarak her bir mikroküre tipi için çalışma çözeltisinin 700 ul hazırlayın.
4. Mikro küreler (10% w / v) 'de vorteks yoluyla süspansiyon haline getirildi ve daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne 60 ul süspansiyon transferi olduğundan emin olun.
5. Kürecik süspansiyon 600 ul PBS ekleyin ve 20x pipetleme karıştırın. 3 dakika 10.000 rpm'de santrifüj tüpü ve dikkatlice supernatant çıkarın. Mikroküreler yıkamak için bu işlemi başka 2x tekrarlayın.
6. THF aşama 1.5 edilene benzer bir prosedür kullanılarak topak ile mikrosfer 3 kez yıkayın.
7. 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de mikrosfer / THF süspansiyon santrifüj, süpernatant kaldırmak ve 600 ul pelet yeniden askıyaçalışma çözeltisi, Tablo 1 'de listelenmiştir. yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne karışımın aktarın.
8. Parafilm ile mikrosantrifüj tüpü kapatın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. 3000 rpm'de çalkalanır ve 24 saat boyunca inkübe, alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak setup kaplayarak ışıktan korur.
9. Topak elde etmek için 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de mikrosfer süspansiyon santrifüjleyin.
10. Adım 1.5 'de tarif edildiği gibi yüzer boya çözeltisini çıkarın,% 0.01 Tween-20 ihtiva eden bir 6x 600 ul PBS ile daha sonra mikro 600 ul 6X metanol ile yıkayın.
11. Kullanıma kadar ışıktan korumak 4 ° C'de% 0.01 Tween-20 ihtiva eden 600 ul PBS içinde kodlanmış mikro saklayın.

Kürecik türü adı:	1	2	3	4	5	6	7
Eu-TTA (mM)	100	100	10	100	10
C30 (mM)		1	1	6	6	1	6

Tablo 1. Eu-TTA ve C30 Konsantrasyonları çözümlerini çalışma.

2. Protein-yakalama Mikrokürelerin hazırlanması

1. [- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) 0.1 M,% 0.9 NaCl,% 0.01 SDS, pH 5.7 2] ve PBS / SDS tampon maddesi (0.01 M sodyum fosfat, 0.154 M NaCl,% 0.01 SDS, pH MES tampon hazırlanması 7.4), oda sıcaklığında önceden.
2. Güvenli-Lock 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe (~ 2 mg küreleri içeren) 200 ul kodlanmış mikrosferdir süspansiyonu ekleyin. Bu, aşama 2.6 'de inkübasyon sırasında dökülmesini önlemek için bir mikrosantrifüj tüpüne bu tür kullanım için önemlidir.
3. aşama 1.5 'de tarif edildiği gibi 3 kez 600 ul tampon MES ile mikro yıkayın. Kürecik pelet 700 ul MES ekle ve pipetleme iyice karıştırın.
4. Hazırlama 0.105 g / ml '1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC, MW = 191.7 g / mol) ve 0.163 g / ml sülfo-N-hidroksi-(sülfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) ayrı tüplerde MES tamponu içinde çözeltiler.
5. Taze kürecik süspansiyonu içine damla EDC çözüm damla hazırlanan 150 ul ekleyin. EDC böylece immobilizasyon verimliliği sağlamak için taze yapılmış çözümü kullanmak esastır, çok hızlı bir şekilde hidrolize. Hemen EDC ilave edilmesinden sonra, mikro 150 ul sülfo-NHS çözeltisi eklemek pipetleme ile iyice karıştırın ve süspansiyon, homojen bir kontrol edin.
6. , Tüp Cap Parafilm ile mühür ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. , 4 saat boyunca 1500 rpm'de çalkalanır alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
7. Mikroküre esas asma santrifüjbir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de iyon. Adım 1.5 'de tarif edildiği gibi 500 ul PBS / SDS tamponu 3x mikro yıkayın.
8. , Topağa 200 ul PBS / SDS tampon ekleme de mikro karıştırın ve 60 ug yakalama antikorları ihtiva eden 300 ul PBS / SDS tampon çözeltisi aktarın. İlk olarak mikrosfer pelet askıya alma ve daha sonra antikor çözeltisi içine mikrosfer süspansiyon eklemek için önemlidir.
9. , Bir çalkalayıcı üzerinde 4 saat süre ile 1500 rpm'de sallayarak antikor mikro-karışımı inkübe alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
10. Bir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de mikrosfer süspansiyon santrifüjleyin. 500 ul StartingBlock (TBS) aşama 1.5 'de tarif edildiği gibi, 3 kez tampon engelleme ile mikro yıkayın.
11. Bloke edici tampon TBS 1 ml mikro karıştırın ve bir kutu koy kullanılarak ışıktan korumak, bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat süre ile 1500 rpm'de inkübe mikroAlüminyum folyo ile kırmızı.
12. Bir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 7,000 rpm'de mikrosfer süspansiyon santrifüjleyin. Adım 1.5 'de tarif edildiği gibi 500 ul TBS, bloke edici tampon ile topak 3 kez yıkayın.
13. Bir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 7,000 rpm'de mikrosfer çözeltisi santrifüjleyin. Bloklama tamponu 500 ul TBS ekle ve pipetleme karıştırın.
14. Işıktan korumak, kullanılana kadar 4 ° C 'de modifiye mikrosfer süspansiyon saklayın.
15. Gelen antikorları kullanarak mikroküreler diğer türlerini yapmak için bu işlemi tekrarlayın.

3. Fiber-optik Microarray Meclisi

1. Yeni bir mikro santrifüj tüpüne otoklav içine protein-yakalama mikro her tip 50 ul karıştırın. Santrifüj stok mikroküreler 3 dakika boyunca 7,000 rpm'de havuzu, ve kalan hacim yaklaşık 100 ul böylece süpernatant kaldırmak.
2. Elle kesme fiber optik uzunluk olarak yaklaşık 5 cm ve demetlerisıralı filmler alıştırma 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0.5, ve 0.05 mikron boyutlu elmas kullanarak parlatma makinesi üzerinde iki ucunu lehçe. Her taneciği ayırmak için 2 dakika boyunca iyonu giderilmiş suda cilalı paket sonikasyon.
3. Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine bir küçük manyetik karıştırma çubuğu bir ifadeyle, protein içermeyen PBS içinde 400 ul tampon ve hava kabarcıklarını çıkarmak için 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde karıştırın ekleyin.
4. 150 saniye ^10,16 için bir 0.025 N HCI çözeltisi içinde cilalı elyaf demetinin bir ucu Etch. Hemen daldırın ve 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş suda kazınmış ucunu sonikasyon. Basınçlı hava ile, elyaf demetleri kurutun.
5. Bir fiber tutucuya monte elyaf demetini ve 1 saat boyunca kabarcık içermeyen, protein içermeyen PBS tamponu içinde kazınmış ucunu bloke eder.
6. Fiber optik demetin aşındırılmış ucunda saklı mikroküre süspansiyonu Deposit 1 ul alikosu. Alüminyum folyo ile bir kutu ile ışıktan korumak kurulum ve 15 dakika boyunca bekleyin. Süspansiyonun hacmi olacakbuharlaştırma yoluyla azaltmak ve kazınmış mikro oyuk içine mikroküreler zorlamak. Bu yükleme adımı bir kez daha tekrarlayın.
7. Mikro oyuk içinde sıkışıp değil mikroküreler kaldırmak için numune çözeltisinin doymuş bir bez kullanın. Protein mikroarray artık kullanıma hazırdır. Tükürük analiz için 4.1 adıma hemen gidin.

4. Mikroküreler Mikroarray kullanarak Tükürük Numune Analizi

1. 200 ul örnek çözeltisi (blokaj tamponu. Tükürük yüzer için toplama protokolü daha önce yayınlanmış olan ¹⁰ StartingBlock T20 (PBS) eşit hacmi ile seyreltilmiş 100 ul süpernatan tükürük) eklenir. bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine otoklavlanmıştır. Çözelti içine elyaf yüklenen protein mikrodizisini Dip ve 2 saat boyunca 600 rpm'de çalkalayıcı üzerinde inkübe, alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
2. % 10 Tween-20 19.6 ml PBS, mi içine 200 ul% 10 BSA çözeltisi ve 200 ul eklenmesi ile 20 ml yıkama tamponu hazırlayınx iyi hafifçe sallayarak.
3. 200 ul yıkama tamponu ihtiva eden yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine otoklav protein mikrodizisini Dip ve 2 dakika boyunca 600 rpm'de çalkalanır. Bu yıkama 3x tekrarlayın.
4. Anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9 ve 5 ug / ml ihtiva eden bir saptama antikor kokteylinin 100 ul çözelti içinde inkübe mikrodizi, StartingBlock T20 IL-1β biyotinile algılama antikoru (PBS) blokaj tamponunda 600 rpm karıştırma cihazı üzerinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
5. Adım 4.3 'de tarif edildiği gibi yıkama tamponu ile 3 kez mikrodizi yıkayın.
6. , 10 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde 600 rpm'de, PBS içinde 20 ug / ml streptavidin R-fikoeritrin bağı (SAPE) çözeltisi 200 ul mikrodizisini inkübe alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
7. Adım 4.3 'de tarif edildiği gibi yıkama tamponu ile mikrodizi 5x yıkayın.
8. Lifin uzakta (yani, uç distal ucunu temizlemekküreciklerden) mutlak etanol ile doymuş bir bez ile paket.
9. Basınçlı hava ile, elyafın her iki ucunu kurutun. Fiberin uzak ucundan bir epifluorescent mikroskobu ve görüntü üzerindeki lif monte edin.
10. Eu-TTA, C30 ve SAPE floresan emisyon yoğunluklarına karşılık mikrosferdir görüntü kazanır. Eu-TTA, C30 ve SAPE floresan görüntüleme için optik filtreler setup ve maruz bırakma süreleri, Tablo 2'de gösterilmiştir.

Kanal	Eu-TTA	C30	SAPE
Uyarıcı	365/10x	350/50x	546/10x
Zayiflatıcı	525DCLP	400DCLP	560LP
Emitör	620/60m	460/50m	580/30m
Pozlama süresi	1 sn	0.3 sn	1 sn

Tablo 2. Mikrodizisinin üç floresan görüntü için parametreler.

Results

Fiber optik demeti küçük bir bölümünü gösteren üç kanallardan Floresan görüntüleri, Şekil 2A-C'de gösterilmiştir. (Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi) Bu görüntüler, MATLAB yazılmış bir algoritma kullanılarak analiz edilmiştir. Bu analiz, mikro kodunu çözmek için Eu-TTA kodlayan bir görüntü (Şekil 2A) için bilgiler ve C30 kodlama görüntüyü (Şekil 2B) hem çalışmaktadır, ve bir görüntü sinyalinin (Şekil 2C), farklı mikro-floresan...

Discussion

Araştırmacılar, aşağıdaki adımlara fazla dikkat etmesi gerekir: daha iyi çözme doğruluğu, bu mikro-homojen tüm kuluçkalama içerisinde süspanse edildi doğrulamak ve mikro kodlama işlemi sırasında yıkama aşamaları için gereklidir. Buna ek olarak, kodlanmış mikrosferler, tüm deney boyunca ışıktan korunması gerekir. Uygun kodlama ve depolama prosedürleri takiben, biz genel olarak çözme doğruluk% 99 üstünde olduğunu öğrendim. Kodlanmış mikro-C donma önlemek ve ışıktan korumak 4 ° C'de depolanmalı...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eu-TTA boya	Fisher Scientific	AC42319-0010
THF	Sigma-Aldrich	34865-100ML
Amber cam şişe	Fisher Scientific	03-339-23B
Kumarin 30 boya	Sigma-Aldrich	546127-100MG
Mikroküreler	Bangslabs	PC05N/6698
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri	Fisher Scientific	05-408-129
PBS 10x konsantre	Sigma-Aldrich	P5493-1L
Su	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20	Sigma-Aldrich	P7949-100 ml
BupH MES tamponlu tuzlu	su Thermo Scientific	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
NaOH çözeltisi	Fisher Scientific	SS256-500
Güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpü	VWR laboratuvar atölyesi	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
İnsan VEGF yakalama antikoru	R& D Systems	MAB293
İnsan IP-10 yakalama antikoru	Ar-Ge D Systems	MAB266
İnsan IL-8 yakalama antikoru	R& D Systems	MAB208
İnsan EGF yakalama antikoru	Ar-Ge D Systems	MAB636
İnsan MMP-9 yakalama antikoru	R& D Sistemleri	MAB936
İnsan IL-1 ve beta; antikor	Ar-Ge yakala D Sistemleri	MAB601
Fare IgG1 izotip kontrol antikoru	R& D Systems	MAB002
StartingBlock (TBS) tamponu	Thermo Scientific	37542
HCl standart çözelti 1.0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml
0.5 ml mikrosantrifüj tüpleri	Fisher Scientific	05-408-120
Protein içermeyen (PBS) tampon	Thermo Scientific	37572
Rekombinant insan VEGF 165	Ar-Ge D Systems	293-VE
Rekombinant insan IP-10	Ar-Ge D Systems	266-IP
Rekombinant insan IL-8	R& D Systems	208-IL
Rekombinant insan EGF	Ar-Ge D Systems	236-EG
Rekombinant insan MMP-9	Ar-Ge D Sistemleri	911-MP
Rekombinant insan IL-1 ve beta;	Ar-Ge D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) tamponu	Thermo Scientific	37539
Bloker BSA	Thermo Scientific	37525
Biyotinillenmiş VEGF tespit antikoru	R& D Systems	BAF293
Biyotinillenmiş IP-10 tespit antikoru	R& D Systems	BAF266
Biyotinillenmiş IL-8 tespit antikoru	R& D Systems	BAF208
Biyotinillenmiş EGF tespit antikoru	R& D Systems	BAF236
Biyotinillenmiş MMP-9 tespit antikoru	R& D Sistemleri	BAF911
Biyotinillenmiş IL-1 ve beta; tespit antikoru	R& D Sistemleri	BAF201
Streptavidin, R-fikoeritrin	Invitrogen	S-21388
Etanol (200 kanıt)	Sigma-Aldrich	E7023-500ML