Yöntem makalesi

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model

7.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50766

⸱

10 Aralık 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

Bu makalede

Özet

İnsan solunum sinsityal virüsü (HRSV) küçük bebeklerde ciddi bronşiyolite neden olabilir. Şiddetli HRSV hastalığının patogenezinin bir kısmı, konakçı immün yanıtından kaynaklanır. Primer insan bağışıklık hücrelerinin HRSV ile uyarılması, enflamatuar yolların ve enfeksiyonun aktivasyonunu incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir model sistem sağlar.

Özet

İnsan solunum sinsityal virüsü (HRSV) enfeksiyonları, hafif enfeksiyonlardan yaşamı tehdit eden bronşiolite kadar geniş bir hastalık şiddeti spektrumu sunar. Şiddetli hastalık patogenezinin önemli bir kısmı, immünopatolojiye yol açan artmış bir immün yanıttır.

Burada, insan bağışıklık hücrelerinin bir HRSV enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için kullanılan bir protokolü açıklıyoruz. İlk olarak, HRSV'nin kültürlenmesi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için kullanılan yöntemleri açıklıyoruz. Daha sonra, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) canlı HRSV ile uyarıldığı bir insan in vitro modelini tarif ediyoruz. Bu model sistem, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkisi de dahil olmak üzere hastalık şiddetine katkıda bulunabilecek birden fazla parametreyi incelemek için kullanılabilir. Bu yanıtlar transkripsiyonel ve translasyonel düzeyde ölçülebilir. Ayrıca, hücrelerin viral enfeksiyonu, akış sitometrisi kullanılarak kolayca ölçülebilir. Birlikte ele alındığında, PBMC'nin canlı HRSV ile uyarılması, HRSV'nin neden olduğu hastalıkta yer alan mekanizmaları incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir model sistem sağlar.

Giriş

Human Respiratory Syncytyal Virüs (HRSV), çocuklarda alt solunum yolu enfeksiyonlarının en sık nedenidir. Her yıl, beş yaşın altındaki 33 milyondan fazla çocuk HRSV ile enfekte olmakta ve bu da üç milyondan fazla hastaneye yatışa ve yaklaşık 200.000 ölüme yol açmaktadır1. Giderek artan sayıda kanıt, HRSV'nin altta yatan kronik hastalıkları olan yaşlılar ve yetişkinler için de önemli bir tehdit oluşturduğunu göstermektedir2.

Küçük çocuklarda HRSV enfeksiyonlarının çoğu, soğuk algınlığı ile karşılaştırılabilir hafif semptomlarla ortaya çıkar ve klinik müdahale gerektirmez. Bununla birlikte, hastaların küçük bir kısmı şiddetli bronşiolit nedeniyle hastaneye yatış ve mekanik ventilasyon gerektirir.

HRSV hastalığının patogenezinin bir kısmı, konakçının enfeksiyona karşı aşırı coşkulu ve yetersiz bağışıklık tepkisidir3,4. Bu, birkaç gözlemle gösterilmiştir. Maksimal hastalık periyodu genellikle viral enfeksiyonun zirvesinden önce gelir ve enfekte dokuların hücresel infiltrasyonu ve enflamatuar sitokinlerinsalınması ile daha iyi çakışır 3. Başka bir kanıt dizisi, 1960'larda formalin inaktive edilmiş HRSV (FI-RSV) denemelerinden geliyor. Aşı, küçük bebeklerde koruma sağlamak yerine, abartılı bir bağışıklık tepkisi ile sonuçlandı ve bu da solunum yolu hastalığının artmasına ve daha yüksek morbidite ve mortalite ile sonuçlandı.

HRSV enfeksiyonlarının patogenezini incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiştir. HEp-2 ve A549 gibi sürekli hücre hatları, HRSV enfeksiyonunu in vitro olarak incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Epitel hücreleri, HRSV enfeksiyonunun5 birincil hedefleridir, bu nedenle bu hücre tiplerine çok fazla odaklanılmıştır. Bununla birlikte, in vivo durum çok daha karmaşıktır ve bir hücre tipi ile sınırlı değildir. Bu karmaşık etkileşimleri incelemek için, HRSV patogenezini incelemek için çeşitli hayvan enfeksiyon modelleri geliştirilmiştir. Şimdiye kadar, hem heterolog (insan olmayan) modellere hem de aynı kökenli konak-pnömovirüs modellerine odaklanan iki farklı strateji kullanılmıştır. HRSV için heterolog modellere örnek olarak şempanzeler, koyunlar, pamuk fareleri ve fareler verilebilir. Doğal konakçıda RSV enfeksiyonu, sığır RSV ve pnömovirüs kullanılarak sığırlarda ve farelerde incelenmiştir.

Bu modellerin her biri hastalık patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlamış olsa da, HRSV insanlara yüksek oranda uyarlanmıştır. Bu nedenle, şu anda kullanılan hücre hatlarına ve hayvan modellerine ek olarak, insan birincil PBMC'lerini HRSV ile stimülasyon için bir model olarak kullanmayı öneriyoruz. İnsan PBMC'leri, küçük çocuklar6, bağışıklığı baskılanmış bireyler ve sağlıklı yetişkinler7 veya yaşlı bireyler8 dahil olmak üzere belirli araştırma sorularını ele almak için bir dizi kişiden elde edilebilir. PBMC'ler, enfeksiyonun doğuştan gelen yönlerini ve virüse adaptif yanıtı incelemek için kullanılabilir. HRSV hastalığının patogenezi için önemli olan aktive edilmiş inflamatuar yolaklar mRNA ve protein düzeyinde incelenebilir. Ayrıca, bağışıklık hücrelerinin (alt kümelerinin) viral enfeksiyonu akış sitometrisi ile belirlenebilir. Bu modeli daha önce HRSV enfeksiyonunun bakteriyel ligand muramil dipeptit (MDP) ile birlikte proinflamatuar sitokinlerin indüksiyonu üzerindeki sinerjik etkilerini belirlemek için kullandık7. HRSV hastalığının patogenezinde rol oynayan inflamatuar yolakları incelemek için insan primer PBMC'lerinin HRSV stimülasyonunu sağlam, kolay ve hızlı bir in vitro model olarak kullanmayı öneriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not:

HRSV ile yapılan deneyler, biyogüvenlik seviyesi 2 olan bir laboratuvarda, biyolojik güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirilmelidir. Biyolojik tehlikeler nedeniyle, tüm viral atıklar ve virüsle temas etmiş materyaller uygun şekilde bertaraf edilmek üzere toplayınız.

Potansiyel olarak enfekte insan kanı kullanılırken özel önlemler alınmalıdır.

Tüm protokoller boyunca endotoksin içermeyen reaktiflerin kullanılması kritik önem taşımaktadır.

1. HRSV A2 Kültürleme

  1. HeLa veya HEp-2 hücrelerini, yaklaşık %50 konfluense ulaşana kadar 175 cm2 kültür flaskında DMEM medyum + %10 fetal calf serum (FCS) + %1 penisilin/streptomisin (P/S) içerisinde kültürleyin.
  2. Hücreleri oda sıcaklığındaki fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın.
  3. HRSV ekim stok virüsü içeren bir viyali 37 °C'lik su banyosunda çözdürün. MOI'yi 0,1 veya altında tutacak şekilde virüs stoğunu seyreltin. Bu işlem, defektif interferans parçacıklarının (DIPs) oluşumunu önleyecektir. Virüs stoğunu flask başına 4 ml enfeksiyon medyumunda (DMEM + %1 P/S) seyreltin ve HeLa veya HEp-2 hücrelerine ekleyin. Hücrelerin kurumasına neden olmayacak şekilde bu hacmi mümkün olduğunca düşük tutun. Hacim ne kadar düşük olursa enfeksiyon oranı o kadar yüksek olacaktır.
  4. 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 2-4 saat inkübe edin. Medyumu yeniden dağıtmak için flaskı her 15 dakikada bir çalkalayın.
  5. İnokülumu uzaklaştırın ve PBS ile bir kez yıkayın.
  6. 15 ml kültür medyumu (DMEM + %10FCS + %1 P/S) ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 3-5 gün inkübe edin. Hücreleri, virüs kaynaklı sitopatolojik değişiklikler, örneğin sinsitya oluşumu, ölüm ve yüzen hücreler açısından normal parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin.
  7. Sitopatoloji ortaya çıktığında, hücreleri sıyırarak HRSV'yi hasat edin ve virüs süspansiyonunu steril 50 ml'lik bir tüpte toplayın. Hücre süspansiyonunu vorteksleyin. Hücrelerin sıyırılması ve vortekslemesi daha fazla viral parçacığın salınmasını sağlar.
  8. Hücre kalıntılarını çöktürmek için virüs süspansiyonunu oda sıcaklığında 1.800 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatandaki HRSV bu hızda çökelmez ve süpernatant, birden fazla 175 cm2 flaskı enfekte etmek için doğrudan kullanılabilir veya gelecekteki kullanımlar için 1 ml'lik alikotlar halinde -80 °C'de ekim stoğu olarak saklanabilir. Enfeksiyöz virüs parçacıklarının kaybını önlemek için HRSV'yi daima sıvı azot ile şok dondurun.
  9. Yukarıda belirtildiği gibi, yukarıdaki protokolle hazırlanan ekim stoğu birden fazla 175 cm2 kültür flaskını enfekte etmek için kullanılır. Purifikasyon için daha fazla virüs üretmek üzere aynı protokolü tekrarlayın. Bir ultrasantrifügasyon döngüsünde 180 ml'ye kadar virüs süspansiyonunu purifiye edin.
  10. Sitopatoloji ortaya çıktığında, hücreleri sıyırarak HRSV'yi hasat edin ve süpernatantı toplayın. Virüs süspansiyonunu vorteksleyin. Hücre kalıntılarını çöktürmek için oda sıcaklığında 1.800 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatandaki HRSV bu hızda çökelmez ve süpernatant, 50 ml'lik tüplere 15 ml şeklinde alikotlanır. Şok dondurun ve purifikasyona kadar -80 °C'de saklayın.

2. HRSV'nin Saflaştırılması

Not: Bir ultrasantrifüj kullanmadan önce, bunun potansiyel olarak tehlikeli bir ekipman olduğunun farkında olun. Kullanım kılavuzlarını okuyun ve ilk ultrasantrifüjleme işlemini deneyimli birinin gözetimi altında gerçekleştirin.

  1. Ultrasantrifüj kovalarını %70 etanol ile temizleyin ve biyolojik güvenlik kabininde kurumaya bırakın.
  2. Her kovaya steril bir santrifüj tüpü yerleştirin.
  3. PBS çözeltisi içinde %30 (w/v) sükroz hazırlayın, filtre sterilizasyonundan geçirin (0,2 μm filtre) ve her santrifüj tüpünün dibine 5 ml ekleyin. Daha hızlı bir protokol için, sükroz çözeltili tüpler dondurulabilir. Steril olduklarından emin olun.
  4. Sükroz çözeltisi dondurulmadıysa, bu sükroz çözeltisinin üzerine 30 ml HRSV çözeltisini çok dikkatli bir şekilde ekleyin. Sükroz çözeltisini bozmamak için yavaşça pipetleyin. Net bir ayrım çizgisi koruyun. Tüpler dondurulduysa, viral süspansiyonu donmuş sükroz çözeltisinin üzerine dökün ve ardından çözünmeye bırakın.
  5. Altı ultrasantrifüj kovasını steril PBS ile çok dikkatli bir şekilde dengeleyin. Her şeyi steril tutmak için teraziyi bir akış kabinine yerleştirin. Tüpleri kenarın 3-5 mm altına kadar doldurun, aksi takdirde santrifüj tüpleri çökebilir. Kovaları 0,1 g hassasiyetle dengeleyin ve kapakların mükemmel şekilde eşleşmeme ihtimaline karşı vidalı kapağı da dahil edin.
  6. Ultrasantrifüjde 1,5 saat boyunca, 4 °C'de 20.000 rcf'de santrifüjleyin.
  7. Santrifüj tüpünü steril pensler kullanarak kovadan dikkatlice çıkarın. Virüs partikülleri sükroz tabakasından geçmiş olacak ve bir pelet oluşturacaktır. Buna karşılık, hücre tarafından salgılanan çözünür faktörler (örneğin sitokinler) çözelti içinde kalacaktır. Tüm sıvıyı boşaltmak için santrifüj tüpünü eğin. Kuruması için steril bir yüzey üzerine, örneğin bir kültür plağına ters şekilde bırakın ancak peletin tamamen kurumasını önleyin.
  8. Pelete dikkatlice 1 ml Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ekleyin ve HBSS'yi boşaltmak için santrifüj tüpünü eğin. Tüpü tekrar steril bir yüzey üzerinde ters şekilde kurumaya bırakın. Peletin tamamen kurumasını önleyin.
  9. Peleti 1 ml HBSS içinde 40 kez yukarı-aşağı pipetleyerek yeniden süspande edin. Virüsü yok edebileceği için hava kabarcığı oluşumunu önlemeye çalışın.
  10. Virüsü alikotlayın, sıvı azot içinde şok dondurun ve daha sonra kullanana kadar -80 °C'de saklayın. Tekrarlanan dondurma-çözme işlemleri enfeksiyöz titreyi düşüreceği için her deneyde yeni bir virüs alikotu kullanın. Çözerken, HRSV -20 ve 15 °C arasında daha az stabil olduğundan, virüsü her zaman 37 °C'de çözün.

3. HRSV'nin Nicelemesi

Not: Verilerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için nicelleştirmeyi en az 3 kez duble olarak tekrarlayın.

3.1. A549 hücrelerinin enfeksiyonu

  1. A549 hücrelerini 24 kuyucuklu plakada konfluens olana kadar kültüre edin.
  2. A549 hücrelerini oda sıcaklığında 1 ml PBS ile iki kez yıkayın.
  3. Reduced Serum Medium içerisinde HRSV'nin 5 katlı seri dilüsyonlarını hazırlayın. Her iki kuyucuğa 100 μl dilüye edilmiş virüs ekleyin. En az 4 dilüsyon yapın (örneğin 4, 20, 100 ve 500 kat). İzotip kontrolü için kullanılacak, en yüksek dozda virüs ile enfekte edilmiş iki ekstra kuyucuk ve iki adet yalancı (mock) enfekte kuyucuk ekleyin.
  4. Hücreleri %5 CO2, 37 °C'de 2 saat boyunca inkübe edin. Kurumayı önlemek için 24 kuyucuklu plakaları her 15 dakikada bir sallayın.
  5. Virüs süspansiyonunu uzaklaştırın ve hücreleri oda sıcaklığında 1 ml PBS ile 1 kez yıkayın.
  6. Reduced Serum Medium içerisinde %4 (w/v) sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. Filtre sterilizasyonu (0,2 μm filtre) yapın ve her kuyucuğa 500 μl ekleyin.
  7. %5 CO2, 37 °C'de 22 saat boyunca inkübe edin.

3.2. FACS için Hazırlık

  1. Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez 1 ml oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.
  2. Her kuyucuğa 200 μl önceden ısıtılmış trypsin (37 °C) ekleyin ve 37 °C, %5 CO2 ortamında 10 dk inkube edin.
  3. Hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını mikroskop altında kontrol edin. Hücreler ayrıldıysa, trypsin'i nötralize etmek için 800 μl DMEM + %10 FCS + %1 P/S ekleyin. Hücreleri yeniden süspande edin.
  4. Hücreleri konik, doku kültürü işlem görmemiş 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Oda sıcaklığında 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Peletleri 200 μl soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.
  5. 4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.
  6. 4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 150 μl %80 buz gibi soğuk aseton içinde yeniden süspande edin.
  7. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dk fiksasyon işlemine tabi tutun.
  8. 4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS + %0,1 BSA içinde yeniden süspande edin.
  9. 4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 50 μl anti-NP-RSV-FITC (PBS + %1 BSA içinde 1:50 seyreltilmiş) veya 50 μl IgG2 anti mouse-FITC (bu bir izotip kontrolüdür; bu nedenle aynı antikor konsantrasyonunu kullanın) içinde yeniden süspande edin.
  10. Protokolün geri kalanı boyunca tüpleri karanlıkta tutun. 4 °C'de en az 1 saat inkube edin; bu süre gece boyuna kadar uzatılabilir.
  11. 150 μl soğuk PBS + %0,1 BSA ekleyin.
  12. 4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS + %0,1 BSA içinde yeniden süspande edin.
  13. 4 °C'de 400 x g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve 200 μl soğuk PBS + %0,1 BSA içinde yeniden süspande edin. Plaka, FACS ölçümüne kadar buz üzerinde ve karanlıkta tutulmalıdır.
  14. Enfekte hücreleri bir akış sitometresinde ölçün.

3.3. FITC-50 hesaplaması

  1. Negatif kontrolü (izotip kontrolü) kullanarak eşik değerini belirlemek için bir akış sitometrisi analiz programı kullanın. Pseudocolor grafik tipini seçin. Pozitif hücrelerin Q3 alanında yer aldığı bir kuadrant kapısı (quadrant gate) çizin. Her iki izotip kontrolünde de yanlış pozitiflerin yüzdesi %0,2'nin altında olmalıdır.
  2. Verileri bir hesap tablosu programına aktarın ve her dilüsyon için FITC+ hücrelerin yüzdesini içeren bir tablo hazırlayın. Her deney için her değerden, izotip kontrolü ile belirlenen yanlış pozitiflerin ortalama değerini çıkarın.
  3. Bir istatistik programında yeni bir dosya (XY scatter, Single X and multiple Y columns) açın. Verileri bu programa kopyalayın: X = dilüsyon, Y = % enfekte hücreler, n = 3; her dilüsyon için iki ölçümün ortalamasını kullanın. Doğrusal olmayan regresyon, tek fazlı eksponansiyel azalma (one-phase exponential decay) istatistiksel analizi gerçekleştirin. Eğrinin veri noktalarına uyup uymadığını kontrol edin; uymuyorsa farklı bir istatistiksel analiz seçin.
  4. Eğriye ait denklemi ve denklem değerlerini bir hesap tablosu programına kopyalayın. Y = %50 için X değerini hesaplayın. Buna göre, %50 enfeksiyonun gerçekleştiği dilüsyondaki FITC ile tespit edilen Enfeksiyöz Partikül/ml (FIP/ml) değerini aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayarak FITC-50 değerini belirleyin:
    FITC50 hesaplama formülü; floresans yoğunluğu ölçüm denklemini gösteren diyagram.
    A = kuyuk başına ortalama A549 hücresi sayısı
    B = enfeksiyon için kuyuk başına kullanılan μl virüs
    C = %50 enfeksiyonun gerçekleştiği dilüsyon

4. Sağlıklı Gönüllü Kanından Periferik Kan Mononükleer Hücre (PBMC) İzolasyonu

  1. Bilgilendirilmiş onamyla sağlıklı gönüllülerden 10 ml'lik EDTA tüplerine venöz kan alın. 10 ml kan hacmi yaklaşık 107 PBMC sağlayacaktır.
  2. Bundan sonraki aşamalarda, steril bir laminar akış kabininde çalışın.
  3. Kanı, 50 ml'lik bir tüpte oda sıcaklığındaki PBS ile 2 kat seyreltin. 50 ml'lik tüp başına maksimum 35 ml seyreltilmiş kan toplam hacmi kullanılabilir.
  4. 50 ml'lik steril bir şırınga alın ve sterilize edilmiş bir Luer lock iğne takın. Şırıngaya yoğunluk gradyanı medyumu çekin. İğneyi, seyreltilmiş kan bulunan tüpün tabanına yerleştirin ve 15 ml yoğunluk gradyanı medyumunu seyreltilmiş kanın altına dikkatlice pipetleyin. Yoğunluk gradyanı medyumu ile kan arasında net bir sınır olduğundan emin olun.
  5. Oda sıcaklığında, 800 x g hızda, 9 (maksimum) hızlanma ile ve fren kapalı şekilde 20 dakika santrifüjleyin. Kullanımdan sonra santrifüj sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.
  6. Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu sonucunda birden fazla katman oluşacaktır. Tabanda, üzerinde nötrofilleri içeren gümüşümsü bir katmanla birlikte eritrositlerden oluşan bir pelet bulunur. Bu peletin üzerindeki berrak katman, yoğunluk gradyanı medyumunu içerir. Yoğunluk gradyanı medyumu ile üstteki kan plazma katmanı arasındaki ince katman ise PBMC'leri içerir.
  7. PBMC'leri bir Pasteur pipetiyle dikkatlice toplayın ve hücreleri yeni bir 50 ml'lik tüpe aktarın. Bundan sonra PBMC'leri buz üzerinde tutun ve buz gibi soğuk PBS kullanın. Hacim 50 ml olana kadar buz gibi soğuk PBS ekleyin ve 4 °C'de, 400 x g hızda 10 dakika santrifüjleyin (fren 9'a ayarlı).
  8. Süpernatantı aspirasyon yoluyla atın, peleti 50 ml buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin ve 4 °C'de, 400 x g hızda 10 dakika santrifüjleyin; bu işlemi 2 kez tekrarlayın.
  9. Süpernatantı attıktan sonra, 1 ml buz gibi soğuk medyum (RPMI + %1 P/S) ekleyin ve hücreleri bir sayım odası kullanarak sayın.
  10. Hücre konsantrasyonunu 5 x 106 PBMC/ml olacak şekilde ayarlayın.

5. PBMC'lerin Canlı HRSV ile Stimülasyonu

  1. Deney düzeneğini hazırlayın; her koşul için deneysel tekrarlar ekleyin.
  2. Gerekli tüm stimülanları besiyeri (RPMI + %1 P/S) ile seyreltin. Kuyucuk başına nihai hacmin 200 μl olacağını unutmayın. 50 μl stimülan ekleneceği için 4x konsantrasyonunda stimülasyon stokları hazırlayın.
  3. Yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa, yukarıda belirtilen hücre süspansiyonundan 100 μl ekleyin (kuyucuk başına 5 x 105 PBMC).
  4. Her kuyucuğa 50 μl seyreltilmiş stimülan ekleyin. Toplam hacmi 200 μl yapacak şekilde iki farklı stimülan eklemek mümkündür. Yalnızca tek bir stimülan gerekiyorsa, hacmi besiyeri ile 200 μl'ye tamamlayın.
  5. 96 kuyucuklu plakayı, %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de gerekli inkübasyon süresi boyunca bekletin. Çoğu sitokin için 24 saatlik inkübasyon yeterli olacaktır.

6. Stimülasyonun Okunması

  1. İnkübasyon süresinin ardından, hücreleri tabana çöktürmek için 96 kuyucuklu plakayı oda sıcaklığında 450 x g hızında 5 dk boyunca santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı toplayın (maksimum 180 μl hacminde alın) ve sonraki sitokin analizi (-20 °C) veya virüs üretimi (-80 °C) için saklayın.
  3. Pellette bulunan stimüle edilmiş PBK'lar, lizis tamponu eklenerek qPCR/Western blot ile analiz edilebilir veya alternatif olarak, akış sitometrisi analizi için boyanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan HRSV A2 kültürü ve saflaştırma yöntemi, ml başına 2 x 107 ile 2 x 108 arasında miktarlanan FITC-50 enfeksiyöz viral partikül verimi sağlayacaktır. FITC ile boyanmış enfekte hücrelerin sayıldığı mikroskobik analiz sonuçları (sonuçlar gösterilmemiştir), FACS ile yapılan miktar belirleme sonuçları ile karşılaştırılmıştır (Şekil 1). Her iki yöntem benzer titrelere yol açmış olsa da, FACS yöntemi farklı deneyler arasında çok daha düşük bir standart sapmaya sahipti ve dah...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, PBMC'nin HRSV ile enfeksiyonunun, inflamatuar yolakların çalışılabileceği hızlı ve güvenilir bir model sistem olduğunu gösterdik. PBMC'leri teşvik etmek için bir HRSV stoğunun hazırlanması ve miktarının belirlenmesi gerekir.

Çoklu hücre hatları HRSV enfeksiyonuna duyarlıdır. HRSV kültürü için en çok kullanılan hücre hatları HEp-2, HeLa ve Vero hücreleridir. Bununla birlikte, HRSV'nin kültürlenmesi için Vero hücrelerinin kullanılmasını önermiyoruz çünkü Vero hücrelerinde HRSV'nin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Teşekkürler

RSV A2, Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda) tarafından nazikçe sağlanmıştır. MV ve GF, Hollanda hükümetinin FES0908 numaralı projesi tarafından finanse edilen Virgo konsorsiyumu ve 050-060-452 numaralı Hollanda Genomik Girişimi (NGI) proje numarası tarafından desteklenmektedir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reagent
PBSLonzaBE17-516FCa2+ Mg2+ veya fenol kırmızısı
olmayan PBSSInvitrogen14025-100HBSS, Kalsiyum, Magnezyum, Fenol Kırmızısı
yok DMEMInvitrogen31966-047DMEM, Yüksek Glikoz, GlutaMAX, Pirüvat
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Orta, GlutaMAX, HEPES
Azaltılmış Serum Ortamı (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (Fetal Sığır Serumu)
BSASigma AldrichA7030Sığır serumundan albümin
P / SInvitrogen15140-122Penisilin-Streptomisin, sıvı
Tripsinİnvitrojen25300-054%0.05 Tripsin-EDTA (1x), Fenol Kırmızı
HeLa hücreleriATCCCCL-2
A549 hücreleriATCCCCL-185
SükrozSigma AldrichS7903Sükroz BioXtra, &; % 99,5
IgG2 anti-fare-FITCBD Pharmingen555057Ms IgG2b K FITC izotip kontrolü
Anti-NP-RSV-FITCAbcamab25849Anti-Solunum Sinsityal Virüs antikoru [671] (FITC)
Yoğunluk gradyan ortamı (Lymphoprep)Eksen-Kalkan1114545
EDTA tüpleriBD Biosciences367525
AsetonMerck Analiz
Malzeme
>Santrifüj TüpleriBeckman Coulter326823İnce Duvar, Poliallomer, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm
SureSpin 630 Rotor, 36 ml kovalı Sorvall79368Sallanan kova titanyum rotor
Sorvall WX80 UltrasantrifüjSorvall46900
CB 150l CO2 İnkübatörBağlayıcı
için Millipore 1000141000 Aseton

Kaynaklar

  1. Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).
  3. Openshaw, P. J. Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).
  4. Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection. Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).
  5. Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).
  6. Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide. J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).
  7. Vissers, M., Remijn, T., et al. Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells. Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).
  8. Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein. Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).
  9. Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands. Vaccine. 30, 597-606 (2012).
  10. Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans. J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).
  11. Treuhaft, M. W., Beem, M. O. Defective interfering particles of respiratory syncytial virus. Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).
  12. Korns Johnson, D., Homann, D. Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry. PLoS One. 7 (5), e37337(2012).
  13. Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity. J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).
  14. Kimpen, J. L. Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).
  15. Wang, S. Z., Forsyth, K. D. The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection. Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).
  16. San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells. J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).
  17. Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10. Plos One. 8 (1), e53641(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RSV Safla t rmaUltrasantrif jasyonYo unluk Santrif jasyonuAk SitometrisiqPCR AnaliziSitokin Ekspresyonumm n Yan tViral Enfeksiyon

İlgili makaleler