Yöntem makalesi

Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

DOI:

10.3791/50842

⸱

26 Ağustos 2013

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yüzeylerde BMP-2 etkin hareketsiz hale getirmeye yönelik bir metodu tarif etmektedir. Yaklaşımımız serbest amin kalıntısı ile BMP-2 bağlanması kovalent elde etmek için bir kendi kendine monte tek tabaka oluşumuna dayanır. Bu yöntem, hücre membranında sinyalini incelemek için yararlı bir araçtır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), kemik dokusunun hücre dışı matris içinde gömülü bir büyüme faktörüdür. Bu şekilde iyileşme ve de novo kemik oluşumunu stimüle osteoblastlar içine mezenkimal hücre farklılaşmasının tetikleyici olarak BMP-2 davranır. Iskeleleri ile birlikte rekombinant insan BMP-2 (rhBMP-2) klinik kullanımı sunum moduna göre, son tartışmalar yükseltti ve miktarı teslim edilecek. Burada sunulan protokol hücreler üzerinde in vitro çalışmalar için BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır. Bir heterobifonksiyonel bağlayıcının bir öz monte tek tabaka oluşturmak üzere nasıl tarif ve rhBMP-2 kovalent immobilizasyon elde etmek için daha sonraki bağlanma aşamasını göstermektedir. Bu yaklaşımla, bu proteinin biyolojik aktivitesini muhafaza ederken, BMP-2 sürekli bir sunum elde etmek mümkündür. Aslında, BMP-2 yüzey hareketsiz spesifik reklamlar önleyerek hedef inceleme sağlar:orption, büyüme faktörü miktarının azaltılması ve süre, en önemlisi de, yüzeyden kontrolsüz salınmasını engellemektedir. Hücreler, kovalent olarak hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 sunulması yüzeylere maruz kaldıkları zaman, BMP-2 tetiklediği hem kısa hem de uzun süreli sinyal olaylarının BMP-2 ile uyarılması, hücre tepkileri ile ilgili in vitro çalışmalar için bu yaklaşım uygun hale yer alıyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), transforme edici büyüme faktörü (TGF-β) ailesi ve de novo kemik oluşumunun indükleyici hem de embriyonik gelişim ve yetişkin sırasında çeşitli dokuların düzenleyicisi olarak işlev görür 1-3 homeostasis bir üyesidir. Biyolojik olarak etkin olan homodimerik BMP-2 proteininin her bir monomer son derece tüm BMP 4 korunan bir "sistein düğüm" motifi içerir. Yedinci sistein iki monomer 5,6 arasında moleküller arası bir bağ oluşturan, dimerizasyon katılır ise yedi sistein kalıntılarının altı, her bir monomerin kararlı moleküller arası disülfid bağı oluşturur. Bu yüksek ölçüde korunmuş sistein düğüm BMP-2 proteininin üç boyutlu yapısını tanımlar ve bu ısı, denatüranlar ve asidik pH 7-9 karşı direnç gibi eşsiz özelliklerini belirler. BMP-2, böylece sinyal iletiminin uyarılması, serin / treonin kinaz zar reseptörlerine bağlanan 10-12. Reseptör oligomerizasyon moduna bağlı olarak, farklı bir sinyal yollar aktive edilir: a Smad-bağımlı yolu Smad karmaşık nükleer translokasyonu ve transkripsiyon aktivasyonu reseptör fosforilasyon ile aktif hale sonuçları ise bir Smad-bağımsız bir sinyal kaskadı, p38 aracılığı ile sinyalizasyon alkalin fosfataz, indüklenmesine yol açacaktır gibi farklılaşma inhibitörü (Id) 12-14 gibi belirli hedef genler,.

Kemik, BMP-2, böylece iyileşmesi ve kemik de novo oluşumunu teşvik edici, osteoblastlar içine mezenkimal kök hücrelerin farklılaşmasını indükler. Şu anda, rekombinant BMP-2 sitelerinin kırık iyileşmesini artırmak için klinik olarak uygulanır ifade edilmiştir. Kemik doku mühendisliğinde yaygın bir strateji, lokal verme sistemleri ile karşılaştırıldığında daha az invaziv bir enjekte edilebilir büyüme faktörleri, kullanılmasıdır. Bununla birlikte, in vivo çalışmalarda ve klinik uygulamalar göstermiştir ki, sahip olduğu kısa biyolojik yarı-ömür, spesifik olmayan locAdalet ve Hafıza ve BMP-2 hızlı lokal temizleme çeşitli lokal ve sistemik sorunlara ektopik 15 yol açabilir. Bu nedenle, etkili bir sunum, malzeme içinde veya üzerinde BMP-2'nin sürüklenmesini veya immobilizasyon elde etmek için, hedef bölgede, yerel ve sürekli uygulama için de gereklidir. Sürekli teslim gibi fiziksel olarak yakalanmalarında, adsorpsiyon ya da iyon kompleks 16 gibi kovalent olmayan bir tutma yaklaşımlar ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bilinen bu moleküllerin 17 denatürasyonda yüzeylerine proteinlerin spesifik olmayan adsorpsiyon olabilir neden olur. Büyüme faktörlerinin bağlanması kovalent için, desteklerin farklı son on yıl içinde geliştirilmiştir. Örneğin, proteinin amino ya da karboksil grupları hedefleyen iki işlevli bağlama moleküllerinin kullanılması, zorunlu olarak hareketsiz hale elde etmek için protein modifikasyonu gerektirmeyen yaklaşımın bir türüdür. Aslında, ise protein modifikasyonu, protein yönünü kontrol etme avantajını sunmaktadıryapay etki, peptit etiketleri ve bölgeye özgü zincirlerinin giriş büyüme biyolojik aktivitesi 17 faktörleri değiştirebilir. Bu durumda, bağlı destek malzemesi ile etkileşim için denatürasyon aşmak için, yüzeyler istenilen faktörü 18 bağlanması ve ardından bir bağlayıcı molekülün bir kendi kendine monte tek tabaka (SAM) ile, örneğin, önceden işlevselleştirilebilir. Bu serbest amin kalıntıları hedefleyerek kovalent bir yüzey üzerine BMP-2 kılınması için bir SAM tabanlı bir yaklaşım kullandık ve hareketsizleştirilmiş protein kısa ve uzun süreli biyolojik aktiviteye 19 hem de muhafaza göstermiştir. Bu protokol, hücre membranında meydana gelir ve osteojenik sinyalizasyon sorumlu hücre içi sinyal düzenleyen mekanizmaları üzerinde in vitro çalışmalar için hücrelere BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroksisüksinimid ester (MU-NHS) sentezi

  1. Oda sıcaklığında (RT) 40 ml diklorometan (pa), 10 ml aseton (PA) (dimetilamino) piridin 1 g 11-mercaptoundecanoic asit - bir 500 mg N-hidroksisüksinimid çözeltisi ve 30 mg 4 damla damla ilave edildi.
  2. 0 ° C'ye soğutun ve reaksiyon, damla damla 1.1 g N, (azot atmosferi altında) 10 ml diklorometan içinde N '-disikloheksilkarbodiimid ekleyin. 1 saat boyunca düşük ısıda reaksiyonu Ol ve daha sonra gece boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
  3. Çökeltiyi filtre edin ve indirgenmiş basınç altında kurutun. 1:1 'lik bir oranda petrol benzen ve etil asetat (pa) ile flaş kromatografisi ile ürünü saflaştırmak.

2. Homojen Altın Katmanlar hazırlanması

  1. Hassas mendil ile ve etil asetat (pa) ve metanol (pa) 1:1 'lik bir karışımını içeren bir çözelti içinde 5 dakika boyunca ses dalgalarına maruz bunları temiz cam lameller. Rinse, metanol ile alt-tabakalar ve azot akışı altında kurutulur.
  2. Püskürtmeli kaplama cihazı içinde temiz yüzeylerde yerleştirin. Odasını boşaltın. 60 saniye için püskürtme ile krom hedeften en üst krom oksit katmanı kaldırın. Metal kiriş ve bir 40 nm altın tabakası ile kaplanması, ardından bir 10 nm krom tabaka ile kaplama, onları altında numuneler.

3. BMP-2 yüzey immobilizasyonu

  1. Yaklaşık 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar N, MU-NHS, N-dimethlyformamide (DMF) içinde eritin ve azot atmosferi altında 4 saat boyunca oda sıcaklığında MU-NHS çözeltisi içinde altın substratlar inkübe edin.
  2. 2 dakika boyunca DMF içinde sonikasyon yüzeyler, DMF ve MeOH ile durulayın ve azot akışı altında kurutulur.
  3. 100 ug / ml (-80 ° C'de saklayın alikotları) 'lik bir konsantrasyonda steril 4 mM HCI rhBMP-2'ye ait bir stok çözelti hazırlayın. Çalışma seyreltileri (3.5 ug / ml) için, PBS / NaCl (PBS, 1 M NaCl ihtiva eden) ve bir de stok solüsyonu seyreltikkullanımdan hemen önce pH 8.5 'e djust.
  4. Gece boyunca 4 ° C'de rhBMP-2 çalışma çözeltisi içinde MU-NHS işlevselleştirilmiş yüzeyleri inkübe edin. Kuluçka Süpernatantı. Sonikasyon 2 dakika boyunca PBS / NaCI yüzeyler ve steril PBS / NaCI ile 3 kez yıkayın.

4. Yüzey Karakterizasyonu

  1. Antikorun spesifik olmayan bir şekilde emilmesi bloke etmek için,% 5 BSA ile inkübe yüzeyleri (w / v) bir anti-BMP-2 antikoru (1:100 içinde% 1 (ağırlık / hacim ile inkübasyon ve ardından oda sıcaklığında 1 saat için PBS solüsyonunda oda sıcaklığında 1 saat için) BSA / PBS çözeltisi). PBS ve 30 saniye süreyle sonikasyon ile iki kez yüzeyleri yıkayın.
  2. Daha sonra PBS ile iki kere yıkayın, oda sıcaklığında 30 dakika için HRP ile konjüge edilmiş sekonder antikor (1:1000 içinde% 1 (w / v) BSA / PBS çözeltisi) ile alt-tabakaların inkübe edin.
  3. Bir levha okuyucu ile 570 nm de HRP enzimatik aktivitesinin ölçülmesi için Ampliflu kırmızı deneyi kullanarak.

5. Biyolojik Aktivite Analizi

  1. 6-çukurlu pl içinde göz başına 1 x 10 tohum 5 fare C2C12 miyoblastlardır% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 37 ° C /% 5 CO2 seviyesinde 24 saat boyunca inkübe ile takviye piruvat içeren yüksek glukoz DMEM oluşan büyüme ortamı içinde Ateş,.
  2. Hareketsiz BMP-2 dekore yüzeylere tohumlanmasından önce 3-5 saat boyunca serumsuz DMEM hücreleri açlıktan.
  3. Kısa süreli sinyal indüksiyon araştırılması için, 200 ul taze serum içermeyen DMEM ile orta yerine ve hücreler üzerinde hareketsizleştirilmiş BMP-2 yüzeyleri yerleştirin. Yüzeyi çizmemek için ince uçlu cımbız ile ele alınmalıdır.
  4. Yumuşak yüzeyleri çıkarın ve bir pipet ile ortam aspire, PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücre yanıtlarının analizi geçin.
  5. Uzun süreli biyolojik aktivite, levha hücrelerin analizi için üzerine, altı gün boyunca düşük serum koşullarına (% 2 FBS) içinde 37 ° C /% 5 CO2 ile yüzeyler ve kültür onları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir biyolojik belirsiz fakat kimyasal akort sistemi sağlar beri bizim kurulum, altın yardımcı madde olarak seçildi. Dahası, kendi kendine bir araya tek katmanlarının uygulanması pek çok avantaj içerir: bunların fonksiyonel uç-gruplar ayrıca modifiye edilebilir ise SAMs kendiliğinden, metaller ve az kusurları ile bir şekilde tek tabakaları üzerinde kendi "baş grupları" ile adsorbe. Böylece kontrollü ama son derece uyarlanabilir şekilde 20 arabirimi özelliklerini uyarlamak için bir platform sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, biyoaktif rhBMP-2 ile fonksiyonelleştirilmiş yüzeylerin hazırlanmasını tarif etmektedir. , RhBMP-2 protein 2) kovalent immobilizasyon altın yüzeyi üzerinde bir çift fonksiyonlu bağlayıcı, kendi kendine bir araya tek tabaka (SAM) 1) başlangıç ​​sistemi: Bu yaklaşım, iki adım içermektedir. Önceki çalışmada, iki fonksiyonlu linker ile büyüme faktörü bağlayıcı etkili doğrulanmış ve yüzey hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 biyolojik aktivitesini muhafaza 19 olduğunu gösterdi. Immobilize bir formda sunulm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz onun tür destek için Prof JP Spatz (Biyofizik Kimya Bölümü, Heidelberg Üniversitesi ve Yeni Malzemeler Biyosistem Bölümü, Akıllı Sistemler Max Planck Enstitüsü, Stuttgart) teşekkür ederim. Max-Planck-Gesellschaft ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (EAC-A DFG SFB/TR79.) Gelen mali destek de büyük ölçüde kabul edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
N-hidroksisüksinimidSigma-Aldrich130672 
4- (dimetilamino) piridinSigma-Aldrich522805 
AsetonAppliChemA2282 
11-merkaptoundekanoik asitSigma-Aldrich674427 
DiklormetanMerck106050 
N, N'-disikloheksilkarbodiimidSigma-AldrichD80002 
Petrol benzenMerck 
Cam lamellerCarl RothM 875 
EthylacetateAppliChemA3550 
MetanolCarl Roth4627 
N, N< / em>-dimetilformamidCarl RothT921ve nbsp;
rhBMP-2Ar-Ge D Sistemleri355-BMTaşıyıcısız; E.coli
PBSPAAH15-002 
NaClCarl RothHN00.2 
Poli (dimetil siloksan) (PDMS)Dow Corning 
Sylgard 184 silikon elastomer kitiDow Corning 
Anti-rhBMP-2SigmaB9553ve nbsp;
Keçi anti-fare IgG-HRPSanta Cruzsc-2005İkincil antikor
Ampliflu Kırmızı testSigma90101 
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) (1x), sıvıGibco41966Yüksek glikozlu
Fetal Sığır Serumu (FBS)SigmaF7524Steril filtreli, hücre kültürü test edilmiş
Kalem / StrepGibco15140 
Tripsin% 0.05 (1x) EDTA 4NaGibco25300ile  
Glisin (0.1 M)Riedel-de Haë n33226 
IGEPAL CA-630 (% 1)SigmaI8896Lizis tamponu (ALP testi) 19< / sup>
Magnezyum klorür (MgCl2< / sub>) (1 mM)Carl RothHNO3.2 
Çinko klorür (ZnCl2) (1 mM)Carl Roth3533.1 
p-nitrofenilfosfat (pNPP)SigmaS0942Fosfataz substrat
Anti-misin ağır zincir (MHC)Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası, Iowa ÜniversitesiMF20Monoklonal antikor
Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgGInvitrogenA11001 
DAPISigmaD9542 
Equipment
Ultrsonic banyosu (Sonorex Super RK 102H), Frekans 35 kHzBANDELIN electronic GmbH Co. KG 
MED 020 Sputtercoating sistemiBAL-TEC AGKaplama koşulları
Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sn
Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sn
Tecan Infinite M200 Plaka okuyucuTecan 
olarak ifade edilir;

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9(2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BMP 2 Covalent BindingSelf assembled MonolayerGold Substrate PreparationM U N H S LinkerBMP 2 ImmobilizationAntibody Binding AssaySMAD 1 5 8 PhosphorylationAlkaline Phosphatase ActivityMyosin Heavy Chain StainingFluorescence Microscopy

İlgili makaleler