Yöntem makalesi

Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

DOI:

10.3791/50853

⸱

6 Kasım 2013

 ,  ,  , 
1Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, USDA

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Süpürücüleri hastalıksız bölgelere kendi dışkılarıyla bulaşıcı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati prionları translokasyonunda potansiyele sahiptir. Biz fare adapte skrapi prıonlar Amerikan kargalar sindirim sisteminde (Corvus brachyrhynchos), ölü hayvanların ortak bir tüketici olsa geçtikten sonra bulaşıcı kalırsa belirlemek için kullanılan ayrıntı yöntemleri.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulaşıcı prion (PrP Res) malzeme olasılıkla ölümcül, nörodejeneratif Bulaşıcı süngerimsi ensefalopati (TSE) hastalıklar 1 nedenidir. Bu tür kronik halsizlik hastalığı (CWD) ve TSE hastalıkları, Transmission, hayvan 2,3 hayvana hem de çevresel kaynaklarından 4-6 olduğu tahmin edilmektedir. Süpürücüleri ve etobur tüketim ve CWD kirlenmiş leş boşaltım yoluyla PrP Res malzemeyi translokasyonunda potansiyele sahiptir. Son çalışma Amerikan kargalar sindirim sistemi (Corvus brachyrhynchos), ortak bir Kuzey Amerika çöpçü 7 ile PrP Res malzemenin geçişini belgelemiştir.

Biz Amerikan kargalar aracılığıyla PrP Res malzemenin geçişini belgelemek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Kargalar RML-deformasyon fare adapte skrapili zorla ağız yolundan ve onların dışkı 4 saat sonrası sonda toplandı. Crow dışkı içine daha sonra bir araya getirilmiş ve periton içine enjekte edildiC57BL / 6 fareleri. Bu fare skrapinin klinik belirtileri ifade edilmiş ve daha sonra kurban edilmiştir kadar Fareler, günlük olarak izlendi. Asemptomatik fareler 365 gün Aşıdan kadar takip edildi. Western Blot analizi hastalık durumunu teyit etmek için yapılmıştır. Sonuçlar prionların testi farelerde hastalığa neden kargalar sindirim sistemi yoluyla seyahat sonra bulaşıcı kalır ve dışkı mevcut olduğunu ortaya çıkarmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati (TSE) yaban hayatı etkileyen ölümcül bulaşıcı nörodejeneratif hastalıklar, evcil hayvanlar ve insanlar vardır. TSE hastalıkları, bulaşıcı madde prion proteinlerinin 1 yanlış katlanmış veya patojenik izoformu (PrP S) olduğu görülmektedir. Koyun ve keçilerde scrapie;; sığır süngersi ensefalopati (TSE Hayvan hastalıkları karaca (Odocoileus hemionus), beyaz kuyruklu geyik (Odocoileus virginianus), geyik (Cervus elaphus) ve geyik (Alces alces) kronik israf hastalığı (CWD) içerir yerli sığırlarda BSE); Yetiştirilmiş vizon transmissible vizon ensefalopati; kedilerde feline süngerimsi ensefalopati; primatlarla 8 ve süngerimsi ensefalopati; egzotik hayvanat bahçesinde egzotik toynaklı süngerimsi ensefalopati aile Bovidae ruminates. Tek bir insan TSE hastalığı, Creutzfeldt-Jakob hastalığı, nadir ve PrP Res-Kirlenmiş alıcı tarafından satın alınması için düşünülmüşated gıda 9. Kontamine sığır 10 tüketilen Benzer şekilde, eğer BSE insanları enfekte edebilir. Tüm TSE hastalıkları, scrapie ve CWD hayvandan hayvana 2,3,11 yanı sıra çevresel kaynaklardan 4-6 olduğu tahmin edilmektedir kendini idame ettiren ve salgın enfeksiyon kaynakları ile sadece iki tanesi. Araştırma çoğu TSE hastalıkları klinik bulguların tezahürü PrP Res malzemenin doğal maruz olaylardan önemli uzun kuluçka dönemleri gerektiren 2-4,6,8 ve belirgin tür engelleri en aza indirmek, ancak, türler arası iletim 12-14 potansiyelini ortadan kaldırmak olmadığını göstermektedir .

Bulaşıcı prion (PrP Res) malzeme yayılması için mekanizmalar belirlenmesi TSE hastalıkları manzara karşısında nasıl hareket hakkında soruları yanıtlayan için son derece önemlidir. Deneysel araştırmalar 15,16, kümes hayvanları ve domuz 17, ve Amerikan kargaları (Corvus eşyaları böcekler düşündürmektedirhyrhynchos) 7,18 PrP Res malzemenin pasif taşıyıcılar veya dağıtıcılar bulunmaktadır. Karga sindirim sistemi yoluyla PrP Res malzemenin geçişi geçenlerde TSE hastalıkları 7 dağılması oynayabileceği rolü göstererek, belgelenmiştir. Bu sonuçlar, kargalar, bir çöpçü, karşılaşma olabilir o akla yatkın hale tüketmek, ve hastalıksız bölgelere, dışkı biriktirme yoluyla bulaşıcı malzeme taşımak.

Burada göstermek prosedürler kargalar sindirim sistemi yoluyla PrP Res malzemenin geçişini belgelemek için kullanılan ve büyük ölçüde gelecekteki ilgili araştırmalarda diğer çöpçü ve etobur türe özgü modeller için bu yöntemlerin uygulanmasını kolaylaştıracaktır. Bu çalışmada, geleneksel yöntemler PrP Res malzemenin yayılması ve genel yüküne katkıda bulunabilecek PrP ​​Res malzeme kaçakçılığı bir alışılmamış araçlar araştırmak için kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim protokol daha önce 7 yayınlanmış bir uyarlanmıştır. Hayvanları içeren tüm işlemler Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA), Hayvan ve Bitki Sağlığı Denetim Servisi (Aphis), Yaban Hayatı Hizmetleri (WS), Ulusal Yaban Hayatı Araştırma Merkezi (NWRC) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1.. Crow Gavaging

  1. Amerikan karga sindirim sistemi yoluyla 'sahte beyin malzemenin' geçişi zamanı tahmin.
    1. Pişmiş ve (Şekil 1) gavaj iğne bir 2 kullanarak mavi boya ve sonda 1 karga ile tam pişmiş yumurta 5 ml karıştırın.
    2. Mavi / yeşil-lekeli dışkı atılır ediliyor artık kadar Crow her 30 dakikada bir kontrol edin.
  2. Bulaşmamış ve ölümcül hasta RML (Chandler suşu) enfekte C57BL / 6 fare beyinleri edinin.
  3. 1x bir kurşun blender homojenleştiricide normal bir% 20 ağırlık / hacim ve enfekte fare beyin Homojenat oluşturmakfosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve cam boncuklar, daha sonra daha büyük bir parçacık maddenin ayrılması için 1 dakika için 3000 x g 'de santrifüj. Süpernatantı ve steril PBS içinde bir% 10 ağırlık / hacim üretmek için 1x PBS eşit hacmi ile seyreltilir. Ihtiyaç kadar -80 ° C'de dondurun.
  4. Önce sonda 17 saat karga kalemler dışında, su değil gıda kaldırmak, ancak.
  5. , Tedavi gruplarına rastgele tahsis karga ve oral gavaj iğnesi bir 2 kullanılarak, normal ya da enfekte ya da fare beyin homojenatının, 5 ml her karga sonda.
  6. Transferi bireysel kafeslere kargalar ve 4 saat sonrası gavaj (Şekil 2) için her bir kafes içinde tüm dışkısını toplamak ve havuz.
  7. Homojen bir doku elde edene kadar cam boncuk ile bir mermi blender homojenleştiricisinde her karga için toplandı dışkı homojenize. * Crow dışkı daha çok sıvı ve kolayca karıştırılabilir.
  8. Her karga için, 10 ml'lik toplam hacim 9.5 ml 1 x PBS içine dışkı homojenat 500 ul seyreltik.
  9. Fekal homogena santrifüj1,400 x g'de 15 dakika boyunca te ve süpernatant ekstrakte edin.
  10. , Ikinci bir mikrobiyal enfeksiyon tehlikesini en aza indirmek homojenat 100 ul başına 100 birim 1 ul / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin (Invitrogen, NY) ile tedavi edilmesi için daha sonra süpernatant azaltmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında, UV ışığı altında yer viral ve bakteriyel kontaminasyon riski. UV maruz kaldıktan sonra, herhangi bir geri kalan mikropların membran bozulması için 30 saniye boyunca 70 ayar bir 3000 Mp sonikatör sonikasyon örnekleri.

2. Fare aşılama

  1. Şu tedavi gruplarında (Tablo 1) için fareler tahsis:
    1. Grup 1 - Tedavi ile farenin ağızdan 5 ml enfekte Fare beyinleri ile zorla ağız yolundan verilmiştir karga dışkı homojenat, 1 ml (IP) intraperitonal olarak aşılandı.
    2. Grup 2 - negatif bir tedavi farenin ağızdan 5 ml normal fare beyinleri ile zorla ağız yolundan verilmiştir karga dışkı Homojenat 1 ml IP aşılandı.
    3. Enfeksiyonlandı sulandırmak1:100 w / v 1x PBS için Grup 3 ve 4 için d ve normal fare beyni homojenatı.
    4. Grup 3 - pozitif kontrol fareleri enfekte fare beyni homojenatından 1 ml IP olarak aşılanmıştır.
    5. Grup 4 - Negatif kontrol fareleri, normal fare beyni homojenatından 1 ml IP olarak aşılanmıştır.
Tedavi Grubu Hayvanların sayısı
Grup 1 Scrapie + Crow Dışkı 100
Grup 2 Scrapie - Crow Dışkı 25
Grup 3 Scrapie + Fare Beyin 10
Grup 4 Scrapie - Fare Beyin 5

. Tablo 1 Scrapie inokülumunun durumu (negatif pozitif +, -) ve hayvan sayısı 7 kullanılır.

  1. Periton fareyi aşılamak:
    1. Nazikçe Scruff başparmak ve işaret parmağı ile sırt boyun kürk fare ve ventral yüzü ortaya çıkarmak için döndürün.
    2. Kafası biraz daha düşük, bu nedenle fare arka ucunu yükseltin.
    3. 1 cm deri, orta hatta 1 cm lateraline aracılığıyla 25 G iğne yerleştirin ve 1-2 cm anterior sakroiliak eklem iğne kilitleme şırınga kullanarak.
    4. 1 ml fare vücut boşluğuna yavaş inoküle enjekte edilir.

3. Fare İzleme

  1. Onlar fare skrapinin klinik belirtilerini ifade kadar günlük fareler izleyin. Klinik bulgular içerebilir: kifoz, ataksi, sert kuyruk, bakım eksikliği, zayıflatma, ve uyuşukluk.
  2. 0 görünür = yok, 1 = orta, 2 = şiddetli nerede görünür işaretler, belirgin olduğunda 6 klinik bulguların her biri için fareler skor.
  3. Her oturum için günlük toplam puanları için 1 gün ≥ 8 ulaştığınızda fareler Euthanize, ≥ 6 sürekli olarak 3 gün boyunca, ya da 365 gün aşılama (dpi) göndermek.
  4. Hasat beyinleri hemen aşağıdaki euthan-70 ° C'de asya ve mağaza
  5. , Bir scrapie teşhisi doğrulamak aşağıdaki gibi seyreltilmiş proteinaz-K çözeltisi (PK) içindeki bir 50 ug / ml 'lik 3 ul beyin örnekleri sindirimi için: 3.1. PK ul, 500 mM EDTA, 12.5 ul, pH 8, 45 ° C'de 30 dakika boyunca 1x PBS 109,39 ul, daha sonra 8 ul yükleme tamponu ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edilerek örnekleri PK etkisiz hale getirirler. Bir% 12 SDS-PAGE jeli, Electrophorese ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içerisinde% 0.2 Tween-20 içerisinde Immobilon PVDF membran ve% 5 yağsız süt ile bloğuna transfer üzerine yük örnekleri. Daha sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca Superblock içerisinde seyreltilmiş Horseradish peroksidaz, konjuge edilmiş anti-PrP Bar224 monoklonal antikoru ile prob. PBS-% 0.2 Tween 20 ile, 1 saat boyunca membran durulayın. , Görselleştirmek bir G-box jel dokümantasyon sistemi üzerinde kemolüminesans ve görüntü ile Western Blot 5 dakika inkübe.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanılan prosedürler karga sindirim sistemi scrapie beyin homojenatı 7 arasında oral gavaj sonrası PrP Res enfekte 4 saat ortadan etmediğini göstermektedir. PrP Res malzeme ile zorla ağız yolundan verilmiştir olan tüm yirmi karga, daha sonra farelere dışkı yoluyla PrP Res malzeme aktarılır. Hastalıklı farelerin fare klinik işaretler ve scrapie hastalık onay Western blot analizi ile tamamlandı tezahürü ile belirlenmiştir.

Karga tarafından yutulur ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz karga sindirim sistemi yoluyla PrP Res malzemenin geçişini belgelemek için bir prosedür ortaya koymaktadır. Biz kargalar hastalıksız coğrafi bölgelere PrP Res malzeme translokasyonunda yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek için geleneksel yöntemleri kullanılır. Diğerleri bunu ortadan kaldırmak için başarısız ikisi de 19-21 ve kemirgen 22,23 sindirim sıvıları, geviş PrP Res direncini değerlendirdik. Onlar da potansiyel leş PrP Res malzeme karşıla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu çalışmada ve USDA kullanılan kargalar sağlamak için S. Werner teşekkür etmek istiyorum, APHIS, hayvan bakımı ve izlenmesi için WS, NWRC hayvan bakım personeli. Mansiyon veya bir ürünün kullanımı USDA onaylandığı anlamına gelmez. Bu çalışma için fon USDA, APHIS, Veteriner Hizmetleri tarafından sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RML Chandler suşu fareye uyarlanmış scrapieRocky Mountain Laboratories
RC57BL / 6 farelerHilltop Lab Hayvanları
Amerikan kargalarıvahşi yakalandı
Kalem / StrepInvitrogen15140-122
Fosfat tamponlu SalinInvitrogen70011-044
SonikatörMisonix
Proteinaz-K çözeltisiRoche3115887001
Yükleme tamponuInvitrogenNP0007 ve 0009
Bis-tris SDS SAYFA% 12 jelInvitrogenNP0342
Immobilon PVDF membranMillipore1SEQ00010
Tween 20Sigma AldrichP2287
Bullet blender homojenizatörBraintree ScientificBBX24B
2.3 mm Zirkonya/silika boncukBioSpec Ürünler11079125Z
Bar224 anti-PrP monoklonal antikorCayman Chemical10009035
SuperblockThermo Scientific37517
kemilüminesan substratMillipore WBKLS0500
G-box jel dokümantasyon sistemiSyngene

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).
  3. Miller, M. W., Williams, E. S. Horizontal prion transmission in mule deer. Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).
  4. Sigurdson, C. J., Adriano, A. Chronic Wasting Disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).
  5. Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. Environmental sources of prion transmission in mule deer. Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).
  6. Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure. PLoS ONE. 4 (6), e5916(2009).
  7. VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos). PLoS ONE. 7 (10), e45774(2012).
  8. Imran, M., Mahmood, S. An overview of animal prion diseases. Virology Journal. 8 (493), (2011).
  9. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion disease. PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26(2006).
  10. Bruce, M. E., et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).
  11. Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).
  12. Collinge, J. The risk of prion zoonoses. Science. 335 (6067), 411-413 (2012).
  13. Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. Prion agent diversity and species barrier. Veterinary Research. 39 (47), (2008).
  14. Harrington, R. D., Baszler, T., et al. A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison). The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).
  15. Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. Mites as vectors for scrapie. Lancet. 347 (9008), 1114(1996).
  16. Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. Fly larvae and pupae as vectors for scrapie. Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).
  17. Matthews, D., Cooke, B. C. The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish. Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).
  18. Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease. Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).
  19. Scherbel, C., Pichner, R., et al. Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle. Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).
  20. Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep. Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).
  21. Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels. Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).
  22. Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models. Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).
  23. Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Veterinary Research. 40 (1), 4(2009).
  24. Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  25. Bjorndal, K. A. Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate. Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).
  26. Clark, R. G., Gentle, G. C. Estimates of grain passage time in captive mallards. Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).
  27. Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity. Primates. 33 (3), 399-405 (1992).
  28. Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer. Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).
  29. Pulford, B., Spraker, T. A., et al. Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification. Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).
  30. Hicks, R. E. Guano deposition in an Oklahoma crow roost. Condor. 81 (3), 247-250 (1979).
  31. Aldous, S. E. Winter habits of crows in Oklahoma. Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PrPRes MateryaliSindirim Sistemi Ge i iAmerikan KargalarFekal Toplamantraperitonal EnjeksiyonFare BiyoanaliziWestern Blot AnaliziKlinik Belirtilerin zlenmesiProteinaz K Sindirimi

İlgili makaleler