Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi

Özet

Monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2'nin floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla hücre yüzeyi antijenlerinin kombine tespiti için pozitif seçim kullanılarak canlı insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) tanımlanması ve zenginleştirilmesi ve ayrıca hESC'lerin karışık hücre popülasyonundan arındırılması için negatif seçimin kullanılmasını açıklıyoruz.

Özet

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) süresiz in vitroolarak kendini yenileyebilir ve uygun ipuçları ile potansiyel olarak tüm somatik hücre soylarına farklılaşmak için indüklenebilir. Farklılaştırılmış hESC türevleri, çeşitli hücre dejeneratif hastalıkların tedavisinde transplantasyon tedavilerinde potansiyel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, hESC farklılaşma protokolleri genellikle farklılaştırılmış hedef ve hedef dışı hücre tiplerinin yanı sıra artık farklılaşmamış hücrelerin bir karışımını verir. Farklılaştırılmış hESC türevlerinin laboratuvardan kliniğe çevirisi için, farklılaşmamış (pluripotent) ve farklılaştırılmış hücreler arasında ayrım yapabilmek ve bu popülasyonları ayırmak için yöntemler üretebilmek önemlidir. HESC türevi somatik hücre tiplerinin güvenli uygulaması ancak pluripotent kök hücre içermeyen popülasyonlarla gerçekleştirilebilir, çünkü artık hESC'ler transplantasyondan sonra teratom olarak bilinen tümörlere neden olabilir. Bu amaçla, burada pluripotent TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESC'lerin pozitif seçim kullanılarak tanımlanması için floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2 ile ilişkili hücre yüzey antijenlerini tespit etmek için bir metodoloji açıklıyoruz. TG30/GCTM-2 FACS metodolojimiz ile negatif seçim kullanarak, çok erken evre farklılaşma geçiren popülasyonlarda farklılaşmamış hESC'leri tespit edebildik ve temizleyebildik (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Daha sonraki bir çalışmada, TG30/GCTM-2 FACS protokolümüz kullanılarak seçilen farklılaştırılmış TG30^Neg-GCTM-2^Neg hücrelerinin pluripotent kök hücre içermeyen örnekleri, bağışıklık sistemi zayıf farelere nakledildikten sonra teratom oluşturmadı ve protokolümüzün sağlamlığını destekledi. Öte yandan, TG30/GCTM-2 FACS aracılı ardışık zenginleştirilmiş pluripotent TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESC'ler in vitro veya içsel pluripotency kendi kendini yenileme yeteneklerini etkilemedi. Bu nedenle, TG30/GCTM-2 FACS metodolojimizin özellikleri, farklılaşma tahlilleri için girdiler olarak yüksek oranda zenginleştirilmiş hPSC popülasyonları elde etmek ve potansiyel olarak tümörojenik (veya artık) hESC'yi türev hücre popülasyonlarından kurtarmak için hassas bir test sağlar.

Giriş

HPSC (hPSC) insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (hIPSC) içerir. HPSC, "pluripotency" olarak bilinen yeteneklerini kaybetmeden uygun kültür koşullarında süresiz olarak kendini yenileyebilir. Pluripotency, bir hücrenin üç embriyonik mikrop hücre katmanının her birinin hücrelerini temsil etmesi de dahil olmak üzere esasen herhangi bir somatik hücre soyuna farklılaşma potansiyeli olarak tanımlanır. hPSC'nin dikkat çekici potansiyeli, terapötik seçenekler de dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tabanlı uygulamalar için bir araç sağlar. Örneğin, kalp yetmezliği, omurga yaralanmaları, diyabet, Parkinson hastalığı, bazı kanserler ve diğer klinik patolojilerde olduğu gibi, insan vücudundaki hücrelerin normal işlevselliğinin tehlikeye girdiği hücre ölümü ve dejenerasyon içeren bozukluklar vardır. Bu durumlara maruz kalan hastalar, laboratuvarda hPSC'den elde edilen sağlıklı ve fonksiyonel somatik hücrelerin nakledilmesiyle potansiyel olarak tedavi edilebilir. Bununla birlikte, mevcut hPSC farklılaşma protokolleri% 100 verimli değildir ve farklılaştırılmış hedef ve hedef dışı hücre türlerinin yanı sıra farklılaşmaya uğramamış artık hPSC'lerin bir karışımını verir, bunun yerine kendi kendini yenilemeye devam eder^1-3. Hastalara nakli amaçlanan hPSC türevli somatik hücrelerin bir örneğinde az sayıda hPSC'nin bile bulunması, bu hücrelerin doğası gereği üç embriyonik mikrop tabakasının dokularını oluşturmak için ciddi bir klinik risk oluşturmaktadır, potansiyel olarak teratoma olarak bilinen bir tümör türü oluşturabilir. Bu nedenle hastalara nakil için sadece pluripotent kök hücre içermeyen olduğu belirlenen hedef hücre popülasyonları güvenli olarak kabul edilebilir. Farklılaşmadan sonra artık hPSC'lerin temizlenmesini potansiyel olarak gerçekleştirmek için bildirilen çeşitli yaklaşımlar vardır (inceleme için bkz: Polanco ve Laslett^4). Daha önce pluripotent kök hücreleri tanımlamak ve hESC hatlarının kültürlerinde erken farklılaşma aşamasına geçen hücrelerden ayırt etmek için floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile birleştirilmiş monoklonal antikorların TG30 (CD9) ve GCTM-2'nin kullanımını bildirdik^5-7.

Hücre yüzeyi antijenlerini tespit etmek için antikor kullanmanın bir avantajı, hedef hücrelerin genellikle antikor bağlama ve/ veya etiketlemeden sonra uygulanabilir olmasıdır. Bu nedenle, hedef hücreler antikor etiketlemesinden sonra toplanabilir ve transplantasyondan önce genişleme ve daha fazla uygulama için yeniden şekillendirilebilir. HPSC'de ifade edilen hücre yüzeyi antijenleri için bir uyarı, pluripotent evreye özel olmadıkları ve çoğu durumda gelişim sırasında zamansal olarak yeniden ifade edildikleri ve bu nedenle bazı farklılaştırılmış hücre tiplerinde tespit edilecekleridir. Bu nedenle, amaç insan pluripotent hücrelerini tespit etmek ve hPSC türevi hücrelerin bir örneğinden temizlemek için antikor kullanmaksa, seçilen antikorlar da transplantasyon için amaçlanan spesifik farklılaştırılmış hücre tipleri üzerinde antijenlerle reaksiyona almamalıdır. Ne yazık ki, canlı hPSC ^4'tehücre yüzeyi işaretleyicilerini tespit eden sınırlı sayıda antikor vardır. Ek olarak, birkaç çalışma, tek bir hücre-yüzey işaretleyicisinin tespitinin tüm hPSC'yi ortadan kaldırmak için yeterli olmadığına işaret etti, tüm hPSC pluripotent subpopulations ortadan kaldırmaya yönelik herhangi bir girişimin, hPSC ^9-10tarafından ifade edilen farklı epitopları tespit eden iki veya daha fazla antikor kullanan yöntemlere dayanması gerektiğini öne sürdü. Yukarıda bahsedildiği gibi, insan nakli için sadece pluripotent kök hücre içermeyen hücre popülasyonları olarak belirlenebilecek hPSC türevi hücreler uygundur. Antikor aracılı hücre sıralama teknolojisinden tek bir geçişle bu katılık seviyesine ulaşmak sağlanamayabilir. Pluripotent kök hücre içermeyen örnekleri kesin olarak elde etmek için farklılaştırılmış hedef hücrelerin zenginleştirilmiş popülasyonunun yeniden şekillendirilmesi ve sonraki hücre sıralama turları gerekebilir.

Laboratuvarımızda, canlı pluripotent hücrelerin tespiti için TG30 (CD9) ve GCTM-2 olmak üzere iki hES hücre yüzeyi antikorlarını kapsamlı bir şekilde karakterize ettik. Çalışmalarımız, hem TG30 hem de GCTM-2'nin kombine tespitinin hESC hatlarında kanonik pluripotency ile ilişkili genlerin ekspresyonu ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir ^5-7. TG30/GCTM-2 FACS immünprofiling sürekli olarak hESC kültürlerinin TG30/GCTM-2 ekspresyonunun nicel sürekli gradyanını oluşturduğunu göstermiştir ^5-7. Bu TG30/GCTM-2 gradyanın içinde keyfi olarak dört hücre popülasyonu (P) oluşturduk: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (T)G30^Düşük-GCTM-2^Düşük), P6 (TG30^Orta-GCTM-2^Orta)ve P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Merhaba) ^5-7. Bu P4, P5, P6 ve P7 hücre popülasyonlarını karakterize etmek, P6 ve P7 alt ihlallerinin çok sayıda pluripotency ile ilişkili geni ifade ettiğini ve FACS ^2-3sonrası yeniden şekillendirildiğinde etkili bir şekilde kök benzeri koloniler oluşturduğunu göstermiştir. Öte yandan, P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücreleri çok sayıda farklılaşma işaretleyicisini ifade eder ve tipik olarak hESC hatlarının ^5-6kültürlerinin genişlemesinde meydana gelen kendiliğinden farklılaşmış hücre tiplerini oluşturur. Erken evre farklılaşmasından sonra artık hPSC'lerin seçici olarak ortadan kaldırılması ve ayrıca pluripotent kök hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için TG30/GCTM-2 FACS'imizin potansiyelini test etmeye karar verdik. Aşağıda açıklanan protokol, pluripotent P7'nin (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)temizlenmesini gerçekleştirmek için FACS sonrası farklılaştırılmış P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücrelerinin nasıl toplandığını ve yeniden şekillendirildiğini göstermektedir. Ayrıca, pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerinin, daha sonra farklılaşma testlerinin verimliliğini ve tutarlılığını potansiyel olarak artırmak için tanımlanmış bir girdi popülasyonu olarak kullanılabilecek zenginleştirilmiş bir pluripotent hücre kültürü elde etmek için toplanması ve yeniden şekillendirilmesini de açıklıyoruz.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Monash Üniversitesi'ndeki (Melbourne) StemCore tesisi tarafından sağlanan hESC-MEL1¹¹ standart toplu kültürler kullanılarak gerçekleştirildi. Bu hücre hattı rutin olarak bFGF destekli hESC /KOSR ortam^7'deki mitotik olarak inaktive fare embriyonik fibroblastlar (MEF' ler) tabakası üzerinde kültürlenmiştir ve her 5-7 gün⁸gün enzimatik ayrışma (Kollajenaz) ile korunur. 75 cm² (T75) şişelerde ~%80 izdiahgaha kadar yetişen hESC kültürleri bu protokol için giriş popülasyonu olarak kullanılmaktadır. Aşağıda açıklanan tüm hücre manipülasyon prosedürleri HEPA filtreli sınıf II biyo-güvenlik kabininde aseptik koşullar altında yapılmalıdır.

Bir TG30/GCTM-2 FACS tahlilini gerçekleştirmeden iki gün önce, FACS sonrası kurtarılan hücrelerin yeniden şekillendirilmesi için kullanılacak T75 kültür plakalarını (bölüm 1'de açıklanmıştır) hazırlayın (bölüm 4'te açıklanmıştır).

1. MEF'lerin Tohumlama ve MEF Şartlı Orta Hazırlanması

1.1 GÜN -2: MEF'lerin T75 şişelerine kaplaması

1. Pipet her T75 şişesine 10 ml% 0.1 w / v jelatin ve yüzeyi eşit şekilde kaplamak için eğilin.
2. Biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Aspirat jelatin çözeltisi.
4. Şişeye 20 ml MEF-orta ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca 37 °C/% 5 CO_2'ye ön denge ekleyin.
5. Plaka, mef'leri aşağıdaki yoğunluklarda hazırlanan şişelere mitottik olarak inaktive etti. 1/3 MEF yoğunluklu tohum için 1,4 x 10⁴ hücre/cm² (T75= 1 x 10⁶ MEF). Tam yoğunluklu MEF tohumu için 5,3 x 10⁴ hücre/cm² (T75 = 4 x 10⁶ MEF).

Not: γ ışınlama ile mitotik olarak inaktive edilmiş MEF'leri rutin olarak kullanıyoruz. γ ışınlanmış MF'lerin hazırlanması için bir protokol Michalska¹²'de bulunabilir.

6. Kuluçka, mef kültürlerini bir gecede %37 °C/5 CO_2'de ışınladı. 1/3 şişeler MEF-orta değişim olmadan 1-4 gün kuluçkaya yatırılabilir. Bu şişeler FACS sonrası hücrelerin yeniden sıçraması için kullanılır (protokol 4'te olduğu gibi). Tam MEF şişeleri, 1.2 adımında aşağıdaki gibi CM oluşturmak için bir gecede inkübe edilir.

1.2 GÜN -1: MEF şartlandırılmış ortamın hazırlanması (CM)

1. Tam MEF T75 şişelerinden MEF-medium'u aspire edin.
2. T75 şişe başına 5 ng/ml insan FGF-2 ile desteklenmiş önceden dengelenmiş 25 ml hESC/KOSR ortamı ekleyin. 24 saat boyunca %37 °C/%5 CO_2'de kuluçkaya yatır.
3. MEF şartlandırılmış ortamı (CM) steril bir doku kültürü tüpüne toplayın, 10 ng/ml insan FGF-2 ile taze takviye CM ve 0,22 μm poliethersülfon filtre kullanarak filtreleyin.
4. Ek CM üretmek için, aynı MEF kültüründe her gün 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını bir hafta boyunca yineleyin.

Bir TG30/GCTM-2 tahlilinin yapıldığı gün, 1/3 MEF T75 şişelerindeki MEF-medium'u CM ile değiştirin ve aşağıda açıklandığı gibi prosedürden kurtarılan hESC veya hESC türev hücrelerinin tohumlanından önce en az 30 dakika boyunca ön aşındırın. CM taze olarak kullanılır veya 2 haftaya kadar 4 °C'de saklanır. CM, elimizde olduğu gibi bu protokolde de kullanılır ve facs sonrası hücrelerin uygulanabilirliğini koşulsuz ortamlara göre arttırır (sonuçlar gösterilmez).

2. TG30/GCTM-2 FACS Tahlilinin Gerçekleştirilmesi: hESC Toplu Kültürlerinin Tek Hücreye Ayrıştırması

Not: 4 °C'de Önseziye %20 FBS/DMEM-F12 ortamı.

1. hESC/KOSR medyasını kültürlü bir hESC hattına sahip iki T75 şişesinden epire edin.
2. Her T75'teki hücreleri 10 ml DPBS ile durulayın ve çıkarmaya hazırlayın.
3. Her T75 şişesine 3 ml TrypLE Express ayrıştırma çözeltisi ekleyin. 5 dakika boyunca %37 °C/%5 CO_2'de kuluçkaya yatır.
4. Hücrelerin tamamen yerindenmasını sağlamak için şişelerin yan tarafını çarpın. Mikroskop altında kontrol edin. Hücreler kolayca yerinden çıkarmazsa, 37 °C/5% CO 2'de 2-3 dakika daha kuluçkaya_yaslanın.
5. Her T75 şişesine 10 ml%20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de tutulur) ekleyin. Steril bir 10 ml pipet kullanarak, ayrışmış hücreleri şişe duvarına karşı birkaç kez hafifçe üçleerek ağırlıklı olarak tek hücreli süspansiyon elde edin.
6. 50 ml steril polipropilen tüp üzerine 70 μm hücre süzgeç yerleştirin. İki T75 şişesinden birikmiş hESC tek hücreli süspansiyonları süzgeçten geçirmek için steril 10 ml pipet kullanın.
7. Hücre süzgecini atın, tüp kapağını değiştirin ve havuza alınan hESC süspansiyonunu 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.
8. Süpernatantı atın ve peleti % 10 ml 20 FBS/ DMEM-F12'de (4 °C'de ön-önseziye) hafifçe yeniden dirilterek hücreleri yıkayın.
9. 2 dakika boyunca 1.000 x g'da ikinci bir santrifüj gerçekleştirin.
10. Süpernatantı atın, %10 ml 20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de önlük) ekleyin ve hücreleri yeniden canlandırmak için hafifçe üçleme ekleyin. 50 ml'lik tüpü buza yerleştirin. Bu tüp aşağıda açıklanan Sort Sample immünostaining prosedürü için kullanılacaktır.
11. Hemotositometre kullanarak hücre sayısı sayımı için hESC tek hücreli süspansiyonun 20 μl'sini (adım 2.10) alın. T75 şişesi başına 10-15 milyon hücre verimi beklemelisiniz.

Not: FBS, protokolün bu bölümünde FACS sonrası hücre canlılığını artırmak için kullanılır.

3. Hücre Yüzey Antijenlerinin İmmünofluoresan Boyanma TG30 ve GCTM-2

1. 1,5 ml'lik altı mikrosantrifüj tüpünün her birine hESC tek hücreli süspansiyonun (adım 2,11'den) Aliquot 150 μl (~100,000 hücre). Bu altı aliquot, FACS makinesindeki tahlilleri kalibre etmek için gereken boyama kontrolleri için kullanılacaktır. Kalan ~9 ml hücre süspansiyonu, Tablo 1 ve 2'yegöre, TG30 ve GCTM-2'nin tespiti için ayrışmış kültürün koine edileceğini Sıralama Örneğiniz olacaktır.
2. %20 FBS/DMEM-F12'de primer antikorların bağlama reaksiyonlarını gerçekleştirin. Son reaksiyon hacimleri Sıralama Örneği için ~9 ml ve kontroller için 200 μl olmalıdır. birincil antikorlar olarak izotip kontrollerini dahil edin. Tüpleri yatay olarak buza yerleştirin ve sallanan bir platformda 30 dakika hafifçe karıştırın.
3. Santrifüj birincil antikor reaksiyonları 2 dakika boyunca 1.000 x g'da.
4. Üstnatantı atın ve peleti Sıralama Örneği için %20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de önlüklü) ve kontroller için 200 μl olarak yeniden oluşturarak hücreleri yıkayın.
5. 2 dakika boyunca 1.000 x g'da ikinci bir dönüş gerçekleştirin.
6. %20 FBS/DMEM-F12'de sekonder antikorların bağlama reaksiyonlarını gerçekleştirin. Son reaksiyon hacimleri Sıralama Örneği için 2,5 ml ve kontroller için 200 μl olmalıdır. Pe-anti-mouse CD90.2 reaksiyon tüpünü bu aşamada hazırlayın. Tüpleri yatay olarak buza yerleştirin ve sallanan bir platformda 30 dakika hafifçe karıştırın.

Not: Bu kuluçka süresi boyunca, CM toplamak ve bölüm 1.2'de olduğu gibi CM ile 1/3 MEF T75 şişeleri hazırlamak uygundur.

7. Santrifüj sekonder antikor reaksiyonları 2 dakika boyunca 1.000 x g'da.
8. Üstnatantı atın ve peleti Sıralama Örneği için %20 FBS/DMEM-F12 (4 °C'de önlüklü) ve kontroller için 200 μl olarak yeniden oluşturarak hücreleri İkİ KEZ yıkayın.
9. Her yıkamayı takiben 2 dakika boyunca 1.000 x g'da bir dönüş yapın ve tüpleri buza yerleştirin.
10. 0,3 μg/ml'de propidium iyodür (PI) ile desteklenmiş %20 FBS/DMEM-F12'de süpernatantları atın ve hücre peletlerini yeniden depolayın. Sıralama Örneği için 2-3 ml ve kontroller için 300 μl kullanın.

Not: Kontrol tüpüne lekesiz hücrelerle PI EKLEMEYİn.

11. Her bir hücre süspansiyonunu 5 ml tüp polistiren yuvarlak alt test tüpleriyle birleştirilmiş 35 μm kapaklı hücre süzgecinden geçirmek için bir P1000 mikropipette kullanın.
12. Süzgeç kapaklarındaki artık hücre süspansiyonunu zorlamak için 50 g/dk'da santrifüj.
13. Tüplerin kenarlarına dokunarak her bir hücre süspansiyonu yeniden dirsin ve buza yerleştirin. Hücreleriniz artık FACS için hazır. Lütfen hemen devam edin.

4. 75 cm² (T75) Şişelerde TG30/GCTM-2 Alt Kırılma Hücrelerinin FACS Sonrası Kültürü

1. Daha önce TG30/ GCTM-2 immünprofiling⁷için bir FACS makinesinin nasıl kurulacağı hakkında rapor verdik. Prosedür, UYGULANABILIR tek hESC'lerin, MEF'lerden arındırılmış ve P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)ve P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)kapılarında kurtarılmasınısağlar - bkz. Daha sonra kullanılacak hücre alt ihlallerini kurtarmak için önceki raporumuzda olduğu gibi TG30/GCTM-2 FACS için FACS makinesini kurun.
2. FACS makinesinden hücre toplamadan önce iki adet 5 ml polistiren yuvarlak alt test tüpünün her birine 1,2 adımda olduğu gibi hazırlanan 1 ml CM ekleyin. Buzun üzerine koy.
3. TG30/GCTM-2 FACS kullanarak farklılaştırılmış P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)ve pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücre alt ihlallerinden her biri 400.000 hücreyi kurtarın.
4. Toplama tüplerini 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.
5. Üstleri aspire edin. Bir P1000 mikroppetörü kullanarak her hücre peletini yeniden kullanmak için 1 ml önkoşüllü 37 °C/5% CO₂ CM ekleyin. Her kesir için hücreleri CM ile önceden dengelenmiş 1/3 MEF T75 şişesine tohumlayın (adım 1.2'ye göre hazırlanır)
6. Bir hücre kültürü inkübatöründe₂₄ saat boyunca %37 °C/5 CO 2'de kültür.
7. CM'yi günlük olarak aspire edin ve yaklaşık iki hafta boyunca yeni hazırlanmış CM (adım 1.2'de olduğu gibi) ile değiştirin. Pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerinin kültürleri bir hafta sonra insan sapı benzeri kolonileri gösterir ve 9-11 günde ~% 80 izdiah eder. P4 kültürleri (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücreleri çoğunlukla 11-13 günde izdiah eden fibroblast benzeri bir hücre çimi olarak büyür. Bu aşamada, gerekirse, P4 ve P7 hücre kültürleri, P4 veya P7 alt ihlallerinin ardışık yeniden şekillendirilmesine aracılık eden TG30/GCTM-2 FACS için kullanılabilir (Bkz. Şekil 2 ve 3).

Sonuçlar

Pluripotent kök hücre içermeyen hESC türevleri P4 (TG30 Neg -GCTM-2^Neg)alt ihlalinden hücrelerin ardışık olarak^geçmesiyleelde edilebilir.

Önceki raporlar, hESC standart kültürlerinde, pluripotency^5,6,13ile ilişkili genlerin bir ifade gradyanını sergileyen bir alt nüfus karışımının bir arada bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. TG30 (CD9) ve GCTM-2 gibi hücre yüzeyi antijenlerinin kombine tespiti, kök hücre belirteçleri ve soyuna özgü transkripsiyon faktörlerinin ifade edilmesiyle belirtildiği gibi, pluripotent aşamada ve erken farklılaşmanın çeşitli aşamalarında bir dizi hücre alt kümesinin ayırt edilmesine izin verir^5,6,13. Önceki raporlara uygun olarak, bu çalışma için kullanılan hESC-MEL1 hattında P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)ve P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerini ayırt edebildik (Şekil 1). Bu sonuçla, aşağıda açıklanan çalışmalarda daha fazla kültür için farklılaştırılmış P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücreleri ve pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerini toplamaya devam ettik.

Olumsuz bir seçim yaklaşımı kullanarak, farklılaşmamış HESC'leri çok erken evre farklılaşma geçiren hücre popülasyonlarından arındırıp temizleyemeyeceğimizi araştırdık (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Yaklaşık iki hafta boyunca facs sonrası ardışık olarak kültürlenen ve her pasajda sıçramadan önce TG30/GCTM-2 FACS kullanılarak yeniden analiz edilen tanımlanmış sayıda P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücresi kullandık. Sonuçlar, TG30^Neg-GCTM-2^Neg için zenginleştirilmiş P4 alt ihlalinin ardışık geçişten sonra hücre tiplerini farklıleştirdiğini ve ilk pasajda P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) hücrelerinin küçük bir varlığının(Şekil 2A, Pasaj 1) daha fazla geçtikten sonra kaybolduğunu ve pluripotent kök hücre içermeyen örnekler haline geldiğini göstermiştir (Şekil 2A, Geçiş 3).

Pluripotent hESC hücrelerinin zenginleştirilmesi, TG30^Hi-GCTM-2^Hi hücrelerinin toplanması ile elde edilebilir.

Bu tahlil kullanılarak yapılan önceki gözlemlere dayanarak, hESC kolonileri oluşturması gereken P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerini toplayarak pluripotent hESC'lerin zenginleştirilmesini beklerdik. Bu nedenle, pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerinin TG30/GCTM-2 FACS aracılı ardışık geçişini de araştırdık. Bu P7 kültürlerinde her pasajda hücrelerin yeniden sıçramadan önce TG30/GCTM-2 FACS immünprofilingi yapıldı ve sadece P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücreleri yeniden şekillendirildi. Bu şekilde, hücrelerin çoğunluğunun pluripotency (P6 ve P7) ile ilişkili subfractions'ta bulunduğunu gözlemledik, bu da P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücrelerinin küçük bir yüzdesini ayırt etme ve üretme kapasitesini koruyan pluripotent hücrelerin zenginleştirilmesini gösteriyor (Şekil 3A). Ayrıca, P7 hücrelerinin kültürleri pas geçme sırasında çok sayıda hESC benzeri koloni göstermiştir (Şekil 3B), ayrıca pluripotency durumunun korunmasını gösterir.

Şekil 1. TG30/GCTM-2 FACS alt ihlallerini elde etmek için temsili sıralama stratejisi. (A): Ayrışmış hES hücre süspansiyonları tek hücreli olarak sıralanır ve potansiyel kümeler veya çiftler yükseklik ve alan (FSC-H ve FSC-A) için ileri dağılım ile kaplanır. (B): Olası döküntüler FSC-A ve SSC-A ile kaldırılır ve yalnızca sağlam hücreler daha fazla sıralanır. (C): Dayanılmaz hücreler propidiyum iyodür (PI) floresan (FSC-A ve FL3-A) temel alınarak dışlanır. (D): MEF besleyici hücreler, fare CD90.2-PE (FL2-A ve SSC-A) ifadesine göre negatif seçimle kapatıldı. (E): MEF besleyicilerden arındırılmış izole edilebilir hESC fraksiyonu nihayet P4 (TG30 Neg -GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)ve P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)celplerine kesirlenir. Negatif kapı (TG30^Neg-GCTM-2^Neg, P4 olarak adlandırılır) etkilenmemiş hücreler için arka plan otoflüoresansına ve ayrıca izotip kontrollerine göre ayarlanmıştır. (F): TG30/GCTM-2 akış sitometri analizine özgü farklı kapılı alt nüfusların yüzdeleri. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 2. HESC-MEL1 hattından kendiliğinden farklılaştırılmış P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücrelerinin ardışık kültürlerini temsil eder. (A): TG30 ve GCTM-2 hücre yüzey belirteçlerinin algılanan ifade düzeyine göre ayırt edilen hücrelerin (P4, P5, P6 ve P7) kapılı alt kümelerini gösteren temsili TG30/GCTM-2 FACS çizimleri. P4 (TG30 Neg -GCTM-2^Neg)immünprofiling sergileyen 400.000 hESC türevinin ilk popülasyonu hESC-MEL1 hattının toplu kültürlerinden toplanır. Bu P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücreleri, T75 şişelerinde hESC yenilenmesini destekleyen koşullarda, izdiliğe ulaşana kadar (11-13 gün) facs sonrası ardışık olarak geçilir. Her pasajdan önce, TG30/GCTM-2 FACS sadece P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)farklılaştırılmış hücre tiplerini toplamak ve yeniden şekillendirmek için gerçekleştirilir. (B): 14 gün sonra farklılaştırılmış P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)hücrelerinin çimlerinin tipik morfolojisi. (C): Sadece 1. geçitteki P4 (TG30 Neg -GCTM-2^Neg)hücrelerinin çimleriyle içiçe geçen 14 gün sonra görülen sporadik hESC benzeri koloniler, büyük olasılıkla P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerinin kirlenmesiyle oluşur. Ölçek çubuğu = 200 μm. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 3. hESC hatlarından türetilen P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücreleri, içsel pluripotent özelliklerini kaybetmeden FACS sonrası ardışık olarak geçiş yapılabilir. TG30 ve GCTM-2 ifade düzeyine göre hücrelerin (P4, P5, P6 ve P7) ayırt edilmiş alt kümelerini gösteren farklı ardışık pasajların temsili TG30/GCTM-2 FACS immünprofilizasyonu. (A): P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)özelliklerini gösteren 400.000 hücreden oluşan başlangıç popülasyonu, hESC-MEL1 hattının toplu kültürlerinden alınır. Pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)

Tartışma

Klinik bağlamda, farklılaştırılmış somatik hücre tipleri transplantasyon ve terapötik uygulamalar için son istenen ürün olup, hPSC bu somatik hücreleri veya laboratuvardaki atalarını üretmek için kendi kendini yenileyen ve ölçeklenebilir bir kaynaktır. Teratoma oluşumu için doğal bir potansiyele sahip artık farklılaşmamış hESC'lerin varlığı, hastalara nakil için hESC türevi somatik hücreler düşünüldüğünde bir güvenlik riskidir. Bu ve hücre tedavisi ile ilgili diğer risklerin gözden geçirilmesi için lütfen Sharpe ve ark. ¹⁶ Bu nedenle, bu tür uygulamaları gerçekleştirmek için, araştırmacıların aynı zamanda pluripotent kök hücre içermeyen hedef hücre popülasyonları oluşturmayı hedeflemeleri zorunludur. Bu amaçla, burada TG30/GCTM-2 FACS metodolojimizi kullanarak, farklılaşan bir hücre popülasyonunda pluripotent hücrelerin (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)varlığını izlemenin ve FACS sonrası zenginleştirilebilen ve yeniden şekillendirilebilen uygulanabilir hESC-farklılaştırılmış türevler elde etmenin mümkün olduğunu gösteriyoruz. Protokolümüzün tek geçişi ile %100 pluripotent kök hücre içermeyen numuneler elde etmek mümkün olmasa da zenginleştirilmiş hESC türevleri yeniden şekillendirilebilir ve ardışık geçtikten sonra %100 somatik hücre saflığı elde edilir. FACS sonrası genişleme için somatik hücrelerin gösterilmiş canlılığı, potansiyel transplantasyon tedavileri için uygun yeterli sayıda hücrenin üretilmesine de olanak sağlamaktadır.

Bu pilot çalışmanın cesaret verici sonuçları, birkaç insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hattı¹⁵ile karşılaştırmalı bir çalışmada TG30/ GCTM-2 protokolümüzü kullanarak daha kapsamlı bir araştırma yapmamızı istedi. Bu çalışmada, TG30/GCTM-2 FACS protokolümüz kullanılarak elde edilen pluripotent kök hücre içermeyen örneklerin bağışıklıktan yoksun farelere nakledildiğinde teratom üretmediğini tespit ettik. Bu nedenle, bu in vitro protokolün kullanımıyla, pluripotent TG30^Hi-GCTM-2^Hi hücrelerinden arındırılmış olduğu belirlenen erken evre farklılaşma hücre kültürlerinin teratomageliştirmediğini güvenle belirtebiliriz vivo . Bu, hPSC türevi hücrelerin klinik uygulamalarda kullanılmadan önce teratom oluşumu riskini ortadan kaldırmak için potansiyel bir yaklaşım sağlayarak testimizin sağlamlığını güçlü bir şekilde desteklemektedir.

Tersine, TG30/GCTM-2 FACS testinin, bu iki yüzey antijeninin (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)yüksek düzeyde ekspresyosuna sahip pluripotent hücre popülasyonu almak için kullanılabileceğini de gösteriyoruz. Önceki çalışmalar, TG30^Hi-GCTM-2^Hi hücrelerinin OCT4^hi ekspresyasyonu ile en yüksek korelasyonu sergilediğini ve en yüksek hESC benzeri koloni sayısını oluşturduğunu göstermiştir^5,6,13,15. Bu nedenle pluripotency ağının TG30^Hi-GCTM-2^Hi ekspresyon hücrelerinde maksimum seviyelerinde aktive olmasının nedeni budur. TG30/GCTM-2 FACS protokolümüzü kullanarak ve P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)hücrelerini alarak zenginleştirilmiş canlı hESC kültürlerinin büyük ölçekli saflaştırılmasına izin verebileceğini düşünüyoruz.

Sonuç olarak, burada, HESK'lerin hem tasfiyesi hem de zenginleştirilmesi için yüzey antijenleri TG30 ve GCTM-2'nin birleşik ifadesine dayanan FACS tahlillerimizin potansiyelini gösteriyoruz. HPSC'lerin yönlendirilmiş farklılaşmasına yönelik protokollerle gelecekteki çalışmaların da bu potansiyel konusunda bilgilendirici olması muhtemeldir. Farklılaştırılmış hESC türevlerinin zamansal olarak TG30 (CD9) veya GCTM-2'yi ifade ettiği bazı tahlillerde, bu iki antikorun pluripotent hücrelerini testte belirli bir zaman noktasında farklılaşmış bir popülasyondan arındırmak için uygun veya yeterli olmayabileceğinin farkındayız⁶. Bu nedenle, bazı farklılaştırılmış hücre tipleriyle çapraz reaksiyonun olası sınırlamasının üstesinden gelmek için canlı hESK'leri özellikle tanıyan yeni antikorlar bulmaya ihtiyaç vardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM/F-12	Yaşam Teknolojileri	11320082	Uzun Adı: Dulbecco'nun Modifiye Kartalı Orta:Besin Karışımı F-12
KOSR	Yaşam Teknolojileri	10828028	Uzun Adı: Nakavt Serum Değişimi
GlutaMAX	Yaşam Teknolojileri	35050061	Uzun Adı: GlutaMAX takviyesi
Esansiyel Olmayan Amino Asitler	Yaşam Teknolojileri	11140050	Uzun Adı: MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi
Merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985023	Uzun Adı: 2-Merkaptoetanol
DPBS	Yaşam Teknolojileri	14190250	Uzun Adı: Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini, kalsiyum yok, magnezyum yok
TrypLE Express	Yaşam Teknolojileri	12604039	Uzun Adı: TrypLE Express (1x), Fenol Kırmızısı
AF-488	yokYaşam Teknolojileri	A21131	Uzun Adı: Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG2a
AF-647	Yaşam Teknolojileri	A21238	Uzun Adı: Alexa Fluor 647 keçi anti-fare IgM
PE-anti IgG2a	Yaşam Teknolojileri	P21139	Kısa Adı: R-Phycoerythrin Keçi Anti-Fare IgG2a (γ 2a) Eşlenik
DMEM	Yaşam Teknolojileri	11965-092	Uzun Adı: Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, yüksek glikozlu
Kalem/Strep	Yaşam Teknolojileri	15140-122	Uzun Adı: Penisilin-Streptomisin, Sıvı
Damıtılmış Su	Yaşam Teknolojileri	15230-089.	Uzun Adı: Steril Damıtılmış Su
PI	SIGMA	P4864	Uzun Adı: Propidyum iyodür çözeltisi
FBS	SIGMA	12203C	Uzun Adı: Fetal Sığır Serumu
Jelatin	SIGMA	G-1890	Uzun Adı: Domuz derisinden elde edilen jelatin
İnsan FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Uzun Adı: Fibroblast Büyüme Faktörü baz, insan rekombinant, hayvansız
Filtre 0.22 & mu; m	Millipore SCGPU02RE		Uzun Adı: Stericup-GP, 0.22 μ m, polietersülfon, 250 ml, radyo-sterilize 70
& mu; m Hücre Süzgeci	Becton Dickinson	352350	Uzun Adı: 70 &mu ile hücre süzgeci; m Naylon ağ
35 & mu; m Kapak hücre süzgeci, 5 ml tüp	Becton Dickinson	352235	Uzun Adı: 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü, hücre süzgeci kapaklı (35 μ m)
5 ml Polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü	Becton Dickinson	352054	Uzun Adı: 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü, steril
IgG2a İzotip Kontrolü	Becton Dickinson	554126	Uzun Adı: Saflaştırılmış Fare IgG2a, κ İzotip Kontrolü
IgM İzotip Kontrolü	Becton Dickinson	553472	Uzun Adı: Saflaştırılmış Fare IgM, κ İzotip Kontrolü
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Uzun Adı: PE Sıçan Anti-Fare CD90.2
8 tepeli kalibrasyon	Becton Dickinson	559123	Uzun Adı: Gökkuşağı Kalibrasyon Parçacıkları (8 tepe)
50 ml steril Polipropilen tüp	Greiner Bio-One	227261	Uzun Adı: 50 ml Konik tabanlı polipropilen tüp, Steril
T75 şişe	Greiner Bio-One	658175	Uzun Adı: CELLSTAR Filtre Kapağı Hücre Kültürü 75 cm2 Şişeler
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Uzun Adı: TG30 Antikor, klon TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Uzun Adı: GCTM-2 ticari olarak mevcut değildir, ancak TG343 ve eşdeğer monoklonal antikor
Tablo 4. Malzemelerin ve reaktiflerin listesi
FACS makinesi	Becton Dickinson		FACSVantage SE ile FACSDiva seçeneği
Ters mikroskop	Olympus		IX71<