Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Özet

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Özet

Doğada, bakteriler nadiren izolasyon var, onlar yerine metabolitler salgılayarak yerel çevreyi değiştiren diğer mikroorganizmaların çeşitli bir dizi ile çevrilidir. Bu metabolitler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini ve farklılaşmayı modüle potansiyeline sahip ve kurulması ve kompleks mikrobiyal toplulukların bakım muhtemel önemli faktörlerdir. Biz, kimyasal olarak aracılık edilen mikrobiyal etkileşimleri belirlemek için bir flüoresan bazlı kokültürü ekran geliştirdik. Ekran katı ortam üzerinde çevresel mikroplarla bir flüoresan raportör transkripsiyon gerginlik birleştiren ve ortak kültürü koloniler büyümeye izin gerektirir. Bu ilgi belirli bir fenotip ifade edildiğinde, seçilen bakteri suşu fluoresces böylece flüoresan raportör transkripsiyon tasarlanmıştır (yani biyofilm oluşumu, sporulasyon, hastalık oluşturma faktörü üretimi, vs.) Tarama büyüme koşulları altında gerçekleştirilir wheBu fenotip yeniden ifade (ve dolayısıyla haberci soy tipik nonfluorescent olan) değildir. Çevresel bir mikrop bu fenotip aktive eden bir metaboliti salgılar, bu agar boyunca yayılır ve flüoresan raportör konstruktunu aktive eder. Bu, indükleyici-metabolit üreten mikrop tespit edilmesini sağlar: bu floresan koloniler en yakın nonfluorescent koloniler bulunmaktadır. Bu nedenle, bu ekran, bir haberci soyuna özel bir fizyolojik tepkiyi harekete geçirilen bir yayılabilir metabolitleri üreten çevre mikropların belirlenmesini sağlar. Bu yayın için nasıl anlatılır: a) Uygun kokültürü tarama koşullarını seçmek, b) muhabiri ve tarama için çevresel mikropların hazırlamak, c) kokültürü ekranı gerçekleştirmek, d) varsayılan organizmaların uyaran izole, ve e) ikincil ekranda faaliyetlerini onaylayın. Biz Bacillus subtilis biyofilm matris üretimini aktive toprak organizmaları için ekran için bu yöntemi geliştirdi

Giriş

Biz bakterilerin salgıladığı metabolitler komşu mikropların fizyolojisini ve gelişimini nasıl etkilediğini anlamak ilgilendi. Birçok metabolitler diğer mikropların üzerindeki etkileri için biyolojik olarak aktif karakterize edilmiştir. İki iyi tarif edilen örnekler, diğer mikropların küresel gen ekspresyonunu değiştiren diğer mikropların büyümesini inhibe antibiyotikler, ve çoğunluk algılama molekülleri içerir. Bununla birlikte, bakteriler bilinen biyolojik aktiviteye ¹ diğer birçok küçük molekül doğal ürünler üretmek. Biz bakteri gelişti ve onları en çok bakteri var, içinde kompleks mikrobiyal toplulukların kendi mikrobiyal komşularının hücresel fizyolojisini modüle izin çünkü bu metabolitlerin bazı üretmek için yeteneği korunmuş olması varsayımında.

Bacillus subtilis hücre tipleri

Biz bacil içeren kimyasal olarak aracılık mikrobiyal etkileşimleri konusunda çalışmalar yoğunlaşmıştırlus subtilis. Bu sadece, çünkü Gram-pozitif bakteri modeli ve manipülasyon için uygun edilen genetik araçlar olarak durumu, aynı zamanda, çünkü, özelliği hücre tiplerine ayırt kabiliyetini taşımaktadır. Örnekler hücreler bulunmaktadır:; sağlam biyofilm oluşumu için gerekli olan hücre dışı matrisi üretmek; çevre DNA almak için yetkin, yüzme ve diğer ² arasında, sporlanan. Bu hücre tipleri, her biri onları, fizyolojik ve / veya fiziksel olarak ayrı bunların genetik olarak özdeş kardeşler yapan bir vasıftır, transkripsiyon regulon ifade eder. Birçok büyüme koşulları altında, birden fazla hücre tipi B. Tek bir koloni içerisinde gibi çeşitli alt-popülasyonunu arada subtilis hücreleri ^3. Bakteri birçok türün benzer hücre tipi heterojen gösterebilirler, ancak, bu olgu özellikle de B. incelenmiştir subtilis.

EPD olan belirli genlerdeBu özel B. her biri içinde egulated subtilis hücre türleri tespit edilmiştir. Bu ilgi mikrobiyal fenotipleri çok doğrudan gözlemlemek zor veya imkansız olduğu için bu tür yukarı düzenlenen genlerin belirlenmesi burada açıklanan çalışma için gereklidir. Örneğin, görsel, böyle katı (% 1.5) ağar plakaları üzerinde yüzme gibi bir özellik tespit edemez bile B'nin ICSI'nin subtilis hücreleri bu koşullar altında ³ flagella'yı üretirler. Başka bir örnek biyofilm matris-üretimidir. Matriks üretimi (bu makroskopik kırışık koloniler ile sonuçlanır gibi) koloni morfolojisi ile görselleştirilmiştir, ancak bazı büyüme ortamında ve sadece büyüme ⁴ birden fazla gün sonra olabilir. Bununla birlikte, genlerin farklılaşması sırasında düzenlenen hangi bilerek, bu hücre tiplerinin içine hücresel farklılaşma belirteçleri olarak hareket kopyalayıcı gazetecilere inşa edebilirsiniz.

Raportör

Bu floresan transcriptional muhabir hücre tipi özel bir flüoresan protein genleri, örneğin, bir raportör genin üretimini tahrik etmek için promotörler içerir. Örnekler P _x x gen için promotör bölge gösteren P (hücreler yüzme) _YY-YFP, P _Tapa-YFP (biyofilm matrisi üreten hücreler için) ve (sporlanan hücreler için) P-YFP _SSPB içerir. Fenotip yerli düzenleme değişmeden kalır, böylece bu raportör kromozom üzerinde bir nötr lokusuna entegre (Şekil 1 ve aşağıya bakınız) vardır. Bir hücre bu fenotip ifade Ancak, şimdi, o da bir floresan proteini ifade eder. Bu bize, bu fizyolojik yanıtı aktive mikroplar taranması sağlayan, belirli fenotipik davranış aktivasyon kolayca görsel Okuması sağlar. Böyle gazetecilere yaygın mikrobiyoloji kullanılmasına rağmen, onlar geniş identif ekranları uygulanan edilmemiştirBu yöntemle önce mikroplar arasında y metabolik etkileşimler ⁵ nitelendirildi.

Hücre-tipi-spesifik haberci soylarının tasarımı ve kurulmasında önemli hususlar vardır. Yapıları diğer türleri kesinlikle mümkün olmasına rağmen biz sadece transkripsiyon floresan gazetecilere kullanmıştır. Biz iki nedenden dolayı, ancak, bizim ekranda hücre tipi farklılaşması için belirteç olarak öteleme füzyonların kullanımını vazgeçirmek: soğukkanlı yerel hücre türüne özgü protein ayrılmak 1) arzu, ve 2) tanıma bir diffüz, hücre- Geniş floresan (çeviri füzyonlarmı ile ortak) hücreler içinde lokalize puncta daha tespit etmek daha kolay olacaktır.

Muhabir gen seçimi

Bir okuma olarak transkripsiyon kullanmak için karar verdikten sonra, raportör geni (örneğin LacZ, floresan ya da lusiferaz) seçilmelidir. LacZ en özel ihtiyaç avantajına sahiptiralgılamak ekipman uluslararasılaûtırırken, ancak çevresel mikropların arasında yanlış pozitif çok daha yüksek bir ihtimal. Bizim ellerde, Lac toprak mikroplar arasında organizmaların ⁺ arka plan seviyesi (; veriler gösterilmemiştir toprak mikropların% 10 X-gal plakalar üzerine) Lac ⁺ (mavi idi >>) yasaklı yüksek oldu. Bu girişimi yoktu, ancak bu, ortam içinde X-gal konsantrasyonunu titre edilmesi ile, bu X-gal habercisinin kullanımına izin vermek için optimize edilmiş olması olasıdır. Lüsiferaz algılama için yüksek hassasiyet sağlar ve en dik muhabir: çevresel mikropların doğal ışıltılı olmanın neredeyse hiç şansı yoktur. Bununla birlikte, en çok oyuklu plakalar içerisinde sadece bölgesel bölgeleri taramak için tasarlanmış olduğu gibi zor, tüm Petri levhalar arasındaki ışıldama tespit izin bizim kurumunda aletleri tespit bulunmuştur. Ayrıca eşzamanlı fiziksel olan izin verilen bir şekilde ışıldayan koloniler görselleştirme komplikasyonlar olabilirneden olan organizmaların olation. Fiduciaries kullanarak bu mümkün yapmış olsa da, yerine B. çalışmak için kanıtlanmış olan floresan transkripsiyonel gazetecilere, kullanmak seçildi subtilis, algılama ve toprak organizmalar arasında düşük yanlış pozitif oranları yeterli duyarlılık sağlanan ve görselleştirme ve izolasyon prosedürleri hem de kolayca kullanılabilir enstrümantasyon kullanmak için izin.

Fluoroforun seçimi

Seçilen özel fluoroforun sizin bakteri türlerinin bağlıdır, kullandığınız agar büyüme ortamı ve özellikle floresan filtre kullanılabilir olması ayarlar. Bizim enstrümantasyon, bulduğumuz B. hem subtilis kendilerini ve YFP (sarı floresan protein) filtreler kullanıldığı zaman onlar bizim ellerde GFP (yeşil floresan protein) bu muhabir üstün yapım, daha az sergilediklerini eşiğe yetiştirilmiştir agar kolonilerinin. Floresan proteinler kodon kullanımı olanya da sık sık da bakteri türleri çalışmak için ya da bir kurucu promoter kullanılarak açık bir şekilde test etmek için, literatürde bilinen bir flüorofor seçmek için önemli hale ökaryotlar için optimize edilmiştir. Sürekli gelişen floresan protein varyantları sayıda kaynağa açıkça deney ⁹ için uygun bir floresan proteini seçiminde rehberlik bazıları ^7,8, bir dizi gözden edildiği, ⁶ mevcut.

Yarışmayı seçimi

Bir promotörün seçimi büyük ölçüde bir hücre tipi ya da ilgi fenotipe bağlıdır. Örneğin B olarak organizmalar için subtilis, bir hücre tipi özel raportör genler, literatürde kurulmuştur. Diğer bakteriyel suşlar için, bir mikro ya da transkripsiyonel verileri temelinde yüksek koşullar altında yukarı regüle olan genler hakkında bilgi temin etmek için gerekli olacaktır burada ilgi i da hücre tipis tezahür. Yeni bir çalışma B. transkripsiyonunu Katalogda fayans mikrodizinleri ¹⁰ kullanarak 104 farklı büyüme koşulları altında subtilis. Bu kağıt genler son derece az-iyi-fenotip için çok değerli olan, farklı koşullar altında regüle edildiği hakkında kapsamlı bilgi sağlar.

Aksine ilgi her gen için promotör bölge kesin haritalama yerine, tipik olarak sadece promoter olarak, genin üst akışında 200-500 bp dizisi kullanır. Tam dizi uzunluğu genomik koşullara bağlıdır: Gerekli açık okuma çerçevelerini komşu yukarı kodlama bölgeleri de dahil olmak üzere önlemek için daha kısa zaman bölgeleri kullanılır.

Nötr loci ve entegrasyon

Da bakteri soyundaki haberci yapı, bir flüoresan raportör transkripsiyon gerilme tasarımı nihai soru olur korumak için. Bakterilerde, ilgi konusu genler sıklıkla korunurantibiyotik seçimi kullanarak plazmidler üzerinde. Bununla birlikte, çevresel mikrop öldürmeden ortak kültürü sırasında antibiyotik kullanmak mümkün olmayabilir. Plazmidler istikrarlı bir şekilde bakteri türlerinde muhafaza edilir, bu da bakteri taraması için raportör hazırlamak için antibiyotiklerin varlığında bir plazmid-kaynaklı reporter içeren büyümesi mümkündür ve daha sonra umuduyla kokültür kendisi sırasında antibiyotik ortadan kaldırabilir bu plasmid olacak yeterince floresan izin vermek için muhafaza edilebilir. Plazmidler kolayca bakteri içinde kaybolur, ya da stres şartları altında kaybolur, ancak bu uygun bir seçenek olmayacaktır. Birçok durumda, en iyi çözüm daha seçim yokluğunda muhabir kararlı bakımına olanak bakteriyel kromozomu üzerinde raportör yapıyı entegre olacaktır. Ilgi genin normal ifadesini veya düzenlemeyi bozmayacak entegrasyon açısından, biz kromozom üzerinde ektopik site içine entegre tavsiye ettiklerini can olarak hareket "nötr odağının." B. In subtilis bu entegrasyon siteler genler olduğunu - mutasyona uğradığı zaman - (entegranlarm antibiyotik seçimi olmadan tespit edilmesi sağlayan) belli minimal medyada bir fenotip iletmek, henüz zengin medya büyüme veya sporulasyon oranlarını değiştirmez, ve amyE, Laca gibi genlerini içerir, thrC, Pird, Glta ve saca (nişastayı kullanma yeteneği taşıma, β-galaktozitler, treonin, urasil, glutamat, ve sükroz, ^{sırasıyla), 11-13.}

Bu genlerin entegrasyon B'de yıllardır güvenilir kullanılmış olsa da subtilis (özellikle amyE Laca ve at), benzer bilgiler birçok diğer bakteri türlerinde genler için uygun olmayabilir. Faj bağlanma sitelerinin kullanımı nötr kromozom olarak entegrasyonu siteler için büyük alternatiflerdir: çok türe özel ^14-16, hem de bu tür Tn7 birleşme bölgesi (att Tn7) gibi genel entegrasyon sitelerinbir çok bakteri türleri ^17,18 tespit ve gen eklemeleri için kullanılmıştır.

Çevre mikroplar

Biz kokültürü ekran için çevresel mikropların doğrudan kaynağı olarak toprak kullanın. Toprak mikropların yüksek çeşitlilik içerir ve bu organizmaların bir çok doğal ürün zengin bir kaynağıdır. (Topraktan bakterilerin önceden izole edilmeden) fluoresan transkripsiyonel raportör türü ile plakalar üzerine yerleştirilir toprağın sıvı süspansiyonlar kullanarak, büyük ölçüde deneysel yaklaşım basitleştirir. Toprak ya da hemen sonra hasat kullanılabilir ya da gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C de dondurulabilir. Hemen kullanımı sanayide iyi donma hayatta olmaz olanlar dahil olmak üzere, mikrop daha büyük bir çeşitlilik potansiyel olarak yetiştirilebilir avantajı vardır. Bu kullanılmalıdır ekran plakalarının sayısının artırılması, bu örneklerden ekilebilir toprak organizmaları konsantrasyonu bilinmeyen dezavantajına sahiptir. Delayed kullanımı koloni optimize edilmiş bir sayıda, her ekran plaka üzerinde büyümüş izin vererek, her bir toprak kaynağı için cfu / ml önceden belirlenebilir bir avantajı vardır. Ancak, toprak organizmaları dondurma kalan yeteneğine sahip olması gerekir.

Büyük filogenetik çeşitlilik olarak matris-indüksiyon ekranında tanımlanan isabet görülmemiştir: (toprak kaynaklarının yani) incelenmektedir indükleyici havuz çeşitlendirilmesi aynı topraklar üzerinde derinlemesine tarama daha yeni türler arası etkileşimler belirlenmesi daha etkili gibi görünmektedir unutmayın Ek toprak kaynakları daha ziyade iyice aynı toprak kaynakları (EA Shank ve R. Kolter, Harvard Tıp Fakültesi, yayınlanmamış sonuçlar) tarama daha incelendi.

Genel bakış

Biz burada açıklamak yaklaşımı, teknik gereklilikler açısından basittir. Bu içerir: 1) B'deki bir flüoresan raportör transkripsiyon yapımında subtilis ya da birdiğer ilgi bakteri türleri, 2), bu muhabir aktif değil hangi şartlar altında belirlenmesi 3) (bizim durumumuzda toprakta, ancak diğer kaynaklar yerine kullanılan olabilir) bu muhabir gerginlik ve taranması organizmaların alikolarını hazırlanması 4) Bu karıştırma Katı ortam, 5) tanımlanması ve varsayılan organizmaları uyaran izole, ve 6) bu organizmalar gerçekten ikincil ekranda bu fenotip aktive edersiniz teyit mikropların iki takım. Belirlendikten sonra, bu organizmalar ve bunların metabolitleri bakteri fizyolojisi ve mikrobiyal etkileşimleri çalışmak için, bakteriyel davranışı modüle etmek ve potansiyel gelecek terapötik bileşikler gibi yeni iskeleler hareket kimyasal araçları ile bize.

Protokol

1.. Bir raportör gen seçin ve bir floresan haberci yapı Transkripsiyonel

B. subtilis için:

1. Bacillus subtilis floresan transkripsiyonel raportörler, yapımını anlatan bir protokol için referans ¹⁹ JoVE makaleye bakın.

Diğer bakteri türleri için:

1. Ilgilenilen fizyolojik yanıt sırasında yukarı düzenlenen bir genin belirlenmesi. Bu, mevcut edebiyat ya da belirli koşullar altında mikrobun transkripsiyonel analizine dayalı olabilir.
2. Fenotipindeki değişiklik için bir vekil olarak hareket etmek, bu gen için bir flüoresan raportör transkripsiyon oluşturun. Bu konstrukt, (bkz. Şekil 1), uygun bir floresan protein üretimini sürüş bu yukarı düzenlenmiş genin promoteri içermelidir.
3. Kromozom üzerinde nötr bir lokus içine bu yapıyı entegre. Bu sayede bu doğal belgeliİlgi konusu genin ulation bozulur ve çevresel mikropların büyüme ile etkileşebilir plazmid seçimi mekanizmalar (örneğin antibiyotikler) ihtiyacını ortadan kaldırır değildir.

2. Coculture Şartları belirleyin

B. subtilis P _Tapa-YFP muhabir için:

1. Kullanım 0.1x LB, bu muhabir için Lennox (1 g tripton, 0.5 g maya özütü, litre başına 0.5 g NaCl) ortamı, B. tarihi subtilis matris-üretim Luria Broth on ²⁰ az. Bu ortam sağlar: B. ⁵ büyümeye topraktan farklı takson izin verirken subtilis koloniler, submillimeter ancak gözlemlenebilir boyutu büyür.
2. Potansiyel pH değişiklikleri en aza indirmek için 100 mM MOPS tamponu içerir.

Diğer bakteri türleri için:

1. Kullanın activatio transkripsiyonel verileri yayınlanmış veya ampirik mikrop büyür birini tanımlamak için çeşitli kültür koşullarını sınamak amafloresan haberci n (haberci soyu uyaran mikroplar ile birlikte-kültür yetiştirilir zaman onun aktivasyon tespit izin vermek için). önemsiz
2. (Örneğin toprak gibi) oligotropik ortamlarda çevresel mikropların tarama sırasında yüksek besin koşulları ²¹ ile sunulduğunda birçok oligotropik bakteriler büyümek değil, çünkü (geleneksel zengin mikrobiyolojik medyaya göre) düşük besin içeriğine sahip bir ortamı kullanın. Düşük bir besleyici ortam ayrıca, ekranın artırıp, koloni oluşumunu azaltır.
3. Düşük eşiğe ve iyi optik netliği ile bir ortam seçin.
4. Muhabir gerginlik ve çevresel mikropların hem de aynı anda büyümeye izin vermek için büyüme sıcaklığı optimize.
5. Bir tamponlama maddesi ilave edilmesini düşünün. Bu tür etkileşimler ilgi olmadıkça plakalarda tamponun kullanımı, fizyoloji ²² pH aracılı değişikliklerin tespit olasılığını azaltacaktır.

3. Muhabir Alikolar hazırlayın

B. subtilis P _Tapa-YFP muhabir için:

1. Steril bir kürdan veya aplikatör çubuk kullanarak taze LB plaka üzerine -80 ° C donmuş stoktan Streak muhabiri suşu.
2. 30 ° C de bir gece boyunca büyütün
3. Katı ortam üzerinde büyüme kaynaklanan arka plan floresan en aza indirmek için, sıvı kültür içinde bir seri seyreltmeleri yapın:
   1. LB, 5 ml sıvı kültürü inoküle ve 37 ° C'de çalkalama ile büyür
   2. Kültür OD 0,6 ~ ₆₀₀ ulaştığı zaman, 0.02 OD ₆₀₀ için 5 ml taze LB seyreltin.
   3. Kültürlerin OD ₆₀₀ ~ 0,6 ulaşana kadar çalkalama ile tekrar 37 ° C'de büyür.
   4. Seri büyüme Dilüsyonlar 3x toplam tekrarlayın.
   5. Nihai seri seyreltme kültür ₆₀₀ ~ 0,4 OD büyüsün.
4. % 15-20 gliserol ekleyin.
5. 50-200 kısım 0.5 ml mikrofüj tüplerine ul ve -80 ° C'de dondurularak
6. Annemuhabiri nonfluorescent ana suşu için ke eşdeğer tümbölenleri (bunlar ikincil tarama sırasında istenecektir.)

Diğer bakteri türleri için:

1. Düşük arka plan floresan sahip hücreleri için (yani, muhabir kullanılan promotör çok az ifade olduğu koşullar altında yetiştirilir.)
2. (Daha fazla bilgi için bakınız yukarıdaki bölüm) yapın ve koloni bir uygun sayıda, her kokültürü ekran plaka üzerinde yetiştirilebilir böylece muhabir soyun bilinen cfu / ml (mililitre başına koloni oluşturan üniteler) ihtiva eden alikotları dondurma.
3. Nonfluorescent ana suşu için eşdeğer hacimde yapmak (bunlar ikincil tarama sırasında istenecektir.)

4. Toprak Örnekleri Alınır

1. Maruz kalan yüzey toprağının üst 0.5 cm atarak, steril konik tüpler veya bir spatula kullanarak steril torbalara toprak toplayın.
2. 1 g başına 10 ml 'lik bir oranda, steril tuzlu su (% 0.85 NaCl) ekleyinBir toprak bulamaç yapmak için toprak.
3. Toprak parçacıkları bakterilerin çıkarmak için bir yöntem seçin: taze bir numune) hemen kullanım veya numune dondurma sonra b) gecikmiş kullanımı.
   1. Acil kullanım için, 1 dakika boyunca vorteks bulamaç.
   2. Gecikmiş kullanım için, karıştırma döngüsü arasında 1 dakika boyunca buz üzerinde blender kavanoz destekleri yerleştirilmesi, üç dakika 1 döngü için karıştırıcı içinde toprak çamuru karışımı.
4. Toprak çamuru ~ 1 dakika dinlendiriniz.
5. , Yeni bir tüpe üst sulu katman hareket ettirin.
6. % 15-20 arasında bir son konsantrasyona gliserol ekleyin.
7. 50-200 kısım 0.5 ml mikrofüj tüplerine ul ve -80 ° C'de dondurularak

5. Dondurulmuş Reporter Ve Toprak Alikotun kob / ml belirleyin

1. Donmuş toprak ve muhabir kısım Çözülme. Toprak mikrop buz üzerinde çözülmüş olabilir. Çünkü B. 4 ° C'de lize subtilis, bunlar tam bölünen miktarları düşük bir sıcaklıkta harcanan zamanı en aza indirmek için oda sıcaklığında hızlı bir şekilde çözdürülmelidir.
2. Iki suret Seria olun0,1 x LB veya başka bir izotonik tampon maddesi içinde l dilüsyonları (10 ^-8 için).
3. Kokültürü tarama için kullanılacak olan aynı ortamın agar plakaları üzerine her bir seri seyreltme plaka 5 ul lekeler.
4. RT (veya tarama için kullanıyor olacak sıcaklığında) büyür.
5. Ertesi gün, her bir nokta içinde koloni sayısını saymak ve dondurulmuş alikotları her cfu / ml hesaplanır.

6. Fark Ekran Tabaklar kısım Konsantrasyonları onaylamak

1. Adım 5.1 'de olduğu gibi bir kısım donmuş çözülme.
2. ⁵ x 10 5, 1 x 10 x 1, 10 ^5, 2.5 x 10 ⁵ seyreltin ⁶ ve 2.5 x 10 ⁷ cfu / ml.
3. Bireysel plakalarının merkezi her bir seyreltinin 50 ul nokta ekleyin. Bunlar hesaplanan plaka başına 25,000 koloni optimum, hem de 2 ile plakaları verim gerekir - ve 5 - en gerçek seyreltme belirlenecek sağlayan, daha az kat.
4. Yaklaşık 20 steril cam (3 mm) boncuk göre ekleyavaşça plaka üzerine dokunarak. Boncuk bükülmüş bir cam yayıcı göre daha plaka üzerinde kolonileri daha düzgün dağılımını sağlar.
5. Sıvı absorbe edilene kadar, benchtop plakaları tutmak ve ileri geri sallayarak, çalışmak gibi çevirerek hücreleri yayılır. Plaka kuruduktan sonra boncuk sallamayın devam etmeyin, aksi takdirde bakterileri öldürmek için başlayacak.
6. Üzerinde tabak çevirme ve etanol içeren atık behere boncuk atın.
7. Plakaları (örneğin 24 ° C / RT) sizin tahlil için doğru sıcaklıkta deneyde (örneğin 24 saat) zaman büyümesine izin.
8. Diseksiyon Stereoskop kullanma, görünüm, iki veya daha fazla alanda koloni sayısı.
9. Alan başına koloni sayısını hesaplayın ve her plaka üzerinde kaç koloni belirler.
10. Gerekli gelecekteki seyreltilerini ayarlayın. Kolonilerin gerçek sayısı her Benzer ekran plaka üzerinde aynı sayıda sahip olarak önemli değildir.

7.. Coculture Plates hazırlayın

1. Adım 5.1 'de olduğu gibi çözülme raportör kısım (ve eğer toprak dondurulmuş numune).
2. 0.1x LB veya diğer düşük besin, izotonik çözelti içinde (6. bölümde optimize konsantrasyonlara) muhabiri seyreltin.
   1. Donmuş toprak için: 0.1x LB veya diğer düşük besin, izotonik çözelti içinde 6. bölümde optimize konsantrasyona seyreltilir.
   2. Taze toprak için: toprak bulamacın cfu / ml 10 ^-4 10 ^-9 cfu / ml aralığında olabilir tahmine dayalı bir taze toprak çamurunun dilüsyonları, olun.
3. Nokta kokültürü ekran plakasının merkezinde üzerine toprak ve raportör dilüsyonlardan 50 ul. Ayrıca, plaka başına toprak ve tek başına kontrol olarak muhabir.
4. Aşama 6.4-6.6 açıklandığı gibi cam boncuklar kullanarak yayıldı.
5. Floresan muhabiri, çizgi etkinleştirmek veya bu koşullar altında muhabiri plaka ve tarama sırasında bir pozitif kontrol olarak kullanmak için büyüyebilir bilinen büyüme koşulları varsa.
6. 28 saat (ya da raportör / deneyi için uygun şekilde) - 24 boyunca 24 ° C'de inkübe edin

8. Floresan için ekran Coculture Tabaklar

1. Koloniler keskin böylece aydınlık aydınlatma kullanarak, Stereoskop odaklanır.
2. Senin toprak numunesi kolonileri autofluorescent olup olmadığını belirlemek için toprak sadece plakaları bak. Bu durumda, bu toprak (ikincil taramasında eşlik eden bir artış ile birlikte) yanlış pozitif yüksek oranda neden olabilir.
   1. Indükleyicisidir onlar yanlış pozitif olarak tespit edilecek şans (Şekil 2) azaltarak, birçok muhabir koloniler çevrili olacağını şansını artırmak için kokültürü plakaları toprak: muhabiri yüksek bir oranını kullanın.
   2. Farklı bir floresan protein (farklı bir kanalda yayan bir) kullanın.
3. Tahlil zamanlamasını belirler. En yeni gazetecilere için de, potansiyel indüksiyonu zamanlama bilinmemektedir ve bu nedenle deneysel olarak tespit edilmelidir.
   1. Kısa sürede koloniler diseksiyon Stereoskop (büyütme ~ 30X) ile açıkça görülür hale gelir ve büyüme sona ermiştir ve / veya arka plan floresan çok yüksek olana kadar periyodik plakaları inceleyerek devam ederken floresan için tarama başlar.
   2. Potansiyel indüksiyonunun zaman penceresi, belirli bir muhabir için tespit edildikten sonra, bu ekran plakaların izlenmesini kolaylaştırmak, bu muhabir içeren tüm kokültürü levhalar için benzer olmalıdır. B. subtilis P _tapa-YFP muhabiri, plakaları incelemek için uygun zaman hücreleri kaplama sonra 24-28 saat arasında, B. subtilis P _SSPB-YFP muhabiri, bu büyümenin 26-32 saat arasındadır.
4. Lütfen floresan maksimize etmek:
   1. Lütfen floresan diseksiyon kapsamı, karanlık bir odada ya da karartma perdeleri çevrili olun. İndüksiyon olasılıkla bir kurucu şekilde üretilen FP daha az yoğun ve daha büyük olması gerekmektedir sensi doyurmayaalgılamak için tivity.
   2. Floresan lamba stabilize etmek ve gözlerini kokültürü plakaları (en az 1-2 dk) floresan algılamak için denemeden önce karanlığa ayarlamak için zaman tanıyın.
5. Bir pozitif kontrol kullanarak (eğer varsa), kullandığınız büyütme floresan algılamasına olanak sağlar emin olun. Büyütme genellikle iyi görüş alanınız yaklaşık tipik bir koloni çapı (200-400X) 30-50x ise.
6. Parlak ışık kapatın ve floresan için kapağını açın.
7. Gözlerini karanlığa ayarladıktan sonra, yavaş yavaş parlak noktalar arıyor, görüş alanınızda geri ve ileri plakasını taşıyın.
   1. Plakanın üst başlatın ve plakanın alt kısmına doğru hareket ederken plaka yan-yana hareket ettirmek için bir zigzag deseni kullanın.
   2. Pratik plaka taşımak için nasıl yavaş yavaş bir fikir edinmek için, ve tüm sur kapsayan emin olmak için aydınlık içinde plaka hareketlialana karşı karşıya.
   3. Yeterince yavaş koloniler bulanık olmazlar plakasını taşıyın. Daha çok özledim alanlarda daha yüzeyini oversample daha iyidir.
   4. Tam bir süpürme sonra, plaka 90 ° ve tekrar açın. İnsan gözü bu yöntemle bile sönük floresan tespit de oldukça iyi.
8. Eğer floresan tespit ederseniz, plaka hareketli durdurmak ve geri dönün ve floresan alanı bulmak.
9. Yavaş yavaş aydınlık dönüm, floresan bir bakteri kolonisi (ve autofluorescent toprak tortusu veya medya bileşenleri) ile ilişkili olup olmadığını belirlemek. Eğer öyleyse, floresan kolonisine yakın nonfluorescent kolonileri uyaran varsayımsal organizmalardır.

9. Putatif Endükleyen Organizmalar izole

1. Bir kez kaynaklı (flüoresan) koloniler tespit edilmiştir, indükleyici bileşiklerin salgılayan koloni izole eder.
   1. Raportör koloni yeterince yüksek bir konsantrasyon plaka üzerinde büyüyen ise(> 0.5:1 muhabir: toprak cfu), varsayılan oluşturmama kolonileri (yine, bakınız Şekil 2) Birden fazla floresan koloniler ile çevrili olacak.
   2. Olduğu durumlarda kokültürü büyüme karmaşıklığı, ettiricisi olan koloni o belirsiz kılan ikincil ekranda sonraki test için birden fazla potansiyel oluşturmama koloniler izole.
2. Eğer görüş alanının merkezinde almak istiyorum koloniler yerelleştirilmesine.
   1. Bu plaka kenarına yakın ise, plakanın ağız (sağ elini ise, yani, soldaki plakanın ağız koymak) uzakta dominant elden böylece, plaka döndürün. Bu, toplama doğruluğunu artırır düşük bir açıyla koloniler yaklaşmasını sağlar.
3. Kullanılan ipuçlarını içine atmak için yakındaki üzerine çizgi varsayımsal uyaran organizmalar, yanı sıra atık beher taze tabak yerleştirin.
4. Üzerinde floresan lamba bırakarak, parlak ışık yavaşça açınEğer, (şekil ve pozisyona göre) floresan koloni ve çevresindeki varsayılan uyaran organizmaları tespit etmek mümkün olacak, böylece, üzerinde. Eğer hiçbir floresan ve sadece parlak ışık olduğunda almak istiyorum koloniler tespit edebilmek için ışık ile ileri geri birkaç kez gitmek gerekebilir.
5. Steril, yuvarlak 200 ul jel yükleme ucu pick up ve bir kalem gibi tutmak için bir cam çubuk (200 mm uzunluğunda x 5 mm çapında) kullanın. Bu tek tek koloniler izole etmek için kullanacağınız toplama aracıdır.
6. Çalışma yüzeyi üzerine stabilize aşamada karşı dış avuç dinlendirin. Lütfen toplama aracı stabilize etmek için elinizin iç, başparmak tarafındaki diğer elinizi koyun.
7. Gerekirse, almak istediğiniz koloniler belirlemek için floresan ve aydınlık görünümleri arasında tekrar çevirin.
8. Levha yüzeyi üzerinde pipet tutulması, görüş alanınızda içine taşımak ve almak istiyorum kolonisi üzerinde ortalamak. Ucu odak dışında olacaktır.
9. (Mikroskop aşamasında veya çalışma yüzeyinin üzerinde dinlenme) elinizin dış kenarını kullanarak, yavaş yavaş aşağı çekilmesi için koloni pipet döndürün. Kaç diğer kolonileri uç temaslarını en aza indirmeye çalışırken, çok hafifçe dokunun.
10. Taze bir plaka bir bölümünün üzerine toplama aracı, çizgi dönen olmadan. Oluk açma agar önlemek için yumuşak bir dokunuş ile yayıldı. Bu yöntem ile aktarılan hücrelerin sayısı (koloniler genellikle manipüle daha küçüktür) oldukça küçük olduğu için, tek bir sürekli çizgi izole edilmiş koloniler neden olur.
11. Farzedilen diğer uyarım organizmalar ile bu işlemi tekrarlayın.
12. 24 ° C (ya da tahlilin sıcaklığı) ile inkübe edin.

10. Streak Putatif Endükleyen Organizmalar Isolated Tek koloniler elde etmek

1. Bir Stereoskop kullanarak belirlemek - koloni yapısı veya morfolojiye göre - sizin farazi aldı ind her birinde bulunan farklı koloni türleri vardır olmadığınıorganizmaların ucing.
   1. Eğer potansiyel koloni farklılıkları tespit etmek için yukarıda yanı sıra alttan hem kolonileri aydınlatmak bir sahne kullanarak kolonileri bak.
2. Taze bir plaka üzerine her biri farklı Morfotip Restreak ve büyüyene kadar kuluçkaya yatmaktadır.
3. Bir kez daha Restreak ve büyümesine izin. Farklı morfotipler devam ederse, saflığa restreak devam ediyor.

11. İkincil Ekranında Putatif Endükleyen Organizmalar sınayın

1. Floresan transkripsiyonel muhabiri aktive olduğunu belirlemek için bir ikincil ekranda varsayılan uyaran organizmaların tüm sınayın. İkincil ekran varsayımsal uyarılması organizmalar yamalı veya tespit edilir, üzerine kontrol plakaları ile birlikte flüoresan raportör transkripsiyon suşunun mikrokoloniler bir çim, oluşur.
2. Aynı konsantrasyonu da flüoresan raportör transkripsiyon gerginlik bir microcolony çim içeren (bir: da üç aynı plakaları ayarlamas) kokültürü tarama sırasında kullanılan ve hiç çim ihtiva eden bir, bir a microcolony bir floresan haberci olmadan vahşi tip ana suşu çim ihtiva etmektedir.
   1. Plaka yönünü belirlemek için her plakanın arka kısmının üst işaretleyin.
   2. Yamalar / noktalar için pozisyonel işaretçileri ekleyin; kadar on farazi uyaran organizmalar plakalarının her set (Şekil 3) üzerinde test edilebilir.
   3. Çözülme çim tümbölenler adım 5.1 olarak (muhabir ve nonfluorescent ana soy).
   4. Adım 6.4 'te olduğu gibi steril boncuklar kullanılarak çim plakaları (veya başka bir duruma seyreltiler) üzerine bir 5 x 10 ⁵ hücre / ml dilüsyon 50 ul yayıldı.
   5. Plakalar kuru olsun.
3. Patch ya da farazi organizmalar uyaran nokta:
   1. Bir daha kolay ve hızlı bir yaklaşım isteniyorsa yama seçin ve biriken hücre, daha az hassas bir sayı olması kabul edilebilir. Yama:
      1. Test koloni steril bir kürdan dokunun - tüm hücreleri almak etmeyin.
      2. Boş tabağa Patch (küçük bir çizgi olun).
      3. Muhabir levha üzerine taze kürdan ile yama tekrarlayın.
      4. Kontrol levha üzerine taze kürdan ile yama tekrarlayın.
   2. Nicel ve tekrarlanabilir bir yaklaşım isteniyorsa lekelenme seçin. Lekelenme biriken hücrelerin sayısı (tüm ayrıntılar için referans 5 e bakınız) normalize edilmesi sağlar ve karşılaştırılabilir, farklı uyarım organizmaların göreli gücünü verir. Nokta:
      1. Süspanse farazi bir steril plastik küvet içinde sıvı ortam içinde 1 ml organizmaların temin edilmesi.
      2. OD resuspensions ₆₀₀ atın.
      3. Formülü X = 250 ÷ (OD _600-0,5) kullanarak, bir ₆₀₀ OD 0.5 olan bir çözelti elde etmek için sıvı ortam içinde 500 ul her bir yeniden süspanse edilmesi için ses X ekleyin. Eğer aynı hacimde (50 kullanabilirsiniz, çünkü OD adlı normalleştirmek için birden dilüsyonlarını yaparken bu yöntem, gerekli pipetleme adımları kolaylaştırırLütfen sulandırıcı tümü için 0 ul).
      4. Üç plakalarının her biri için her bir OD normalleştirilmiş tabanda Noktası 1 ul.
4. 24-28 saat (ya da raportör / deneyi için uygun olan) boyunca 24 ° C 'de büyümesine izin.
5. Floresan muhabiri suşu ancak ebeveyn kontrol suşu etkinleştirmek farazi uyaran organizmaları tanımlamak için floresan mikroskop kullanın. Bu izolatlar pozitif isabet vardır - sizin ilgi fenotipi teşvik bileşikler salgılar çevre mikroplar.

Sonuçlar

Bu ekran B. fizyolojisini değiştirebilir bileşikleri salgılayan toprak organizmaları tanımlamak için kullanılan subtilis. Burada açıklanan sonuçlar B matrisi üreten hücre tipi odak Bu bakteri sağlam biyofilm oluşumu için gerekli olan protein ve eksopolisakarid üreten subtilis. Biz floresan raportör yapı (P _Tapa-YFP) için Tapa-sipW-TASA operonunun destekleyicisi seçilmiş. Bu operon matrisin protein yapı bileşeni kodlar ve biyofilm matris ²³ üreti...

Tartışma

Bu protokolün doğal sınırlamalar biri mikrobik organizmaların cultivability dayanıyor olmasıdır. De ²⁴ belgelenmiştir gibi, gezegendeki en mikrobiyal yaşam (henüz) bugüne kadar araştırdı kültür koşullarında yetiştirilen olamaz. Böylece, doğal ortamlarında meydana gelen mikrobiyal türler arasındaki etkileşimleri çok sayıda bu yaklaşımı kullanarak tespit edilmeden gidecek. Arzumuz bu tür etkileşimlerin varlığını belirlemek, ama sonra da onlara aracılık eden mekanizmaları ve molekülleri çalışma değil sadece Anca...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Spektrofotometre			OD600 absorbans değerlerini ölçebilen herhangi bir spektrofotomer.
Luria suyu, Lennox	VWR	80017-484	Alternatif medya kaynakları gerekli olabilir.
Cam boncuklar, 3 mm	VWR	26396-508
Jel yükleme uçları, yuvarlak	VWR	29442-666
Cam çubuklar	VWR	59060-069
Floresan diseksiyon stereoskopu	Zeiss	N/A	Yazar, bir EXFO X-cite 120 floresan ışık kaynağı, uzun geçişli bir YFP filtre küpü, bir akromatik 0.63X objektif, 10X göz merceği ve bir Axio HRC HR dijital fotoğraf makinesi. Çoğu tarama, 2.0-3.2X'te odaklama montajı ile yapıldı. Floresan özelliklerine sahip herhangi bir diseksiyon stereoskopu, kullandığınız FP için doğru filtrelere sahip olmanız koşuluyla iyidir. Parlak alan ve floresan arasında kolayca geçiş yapmanızı sağlayan bir deklanşörün yanı sıra yukarıdan ve aşağıdan aydınlatmaya izin veren bir sahne olması en iyisidir. Görüntü çekmek istiyorsanız, bağlı bir kamera da gereklidir.