Hücre nakli fotoreceptör kaybı ile karakterize retina dejenerasyonu tedavisi için bir stratejiyi temsil eder. Burada, nakledilebilir fotoreceptörlerin zenginleştirilmesi ve yetişkin farelere alt deri nakli için bir yöntem açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
MACS Saflaştırılmış Fotoreceptör Öncü Hücrelerinin Yetişkin Fare Retinasına Subretinal Transplantasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Retinanın ışık algılayan hücrelerinin, yani fotoreceptörlerin kaybına bağlı görme bozukluğu ve körlük, sanayileşmiş ülkelerde temel engellilik nedenini temsil eder. Dejenere fotoreceptörlerin hücre nakli ile değiştirilmesi, gelecekteki klinik uygulamalarda olası bir tedavi seçeneğini temsil etmektedir. Nitekim, son preklinik çalışmalar, doğum sonrası 4. günde yenidoğan fare retinasından izole edilen olgunlaşmamış fotoreceptörlerin subretinal transplantasyondan sonra yetişkin fare retinasına entegre olma potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Donör hücreler, iç ve dış segmentler, dış nükleer tabakada bulunan yuvarlak bir hücre gövdesi ve endojen bipolar hücrelere yakın sinaptik terminaller dahil olmak üzere olgun bir fotoreceptör morfolojisi oluşturdu. Nitekim, son raporlar donör fotoreceptörlerin konak farelerin sinir devrelerine işlevsel olarak entegre olduğunu göstermiştir. Bu tür hücre değiştirme yaklaşımının gelecekteki bir klinik uygulaması için, tercih edilen hücrelerin saflaştırılmış süspansiyonlarının üretilmesi ve göze uygun entegrasyon için doğru konuma yerleştirilmesi gerekir. Fotoreceptör öncüllerinin zenginleştirilmesi için, donör hücrelerin genetik muhabir modifikasyonunun önlenmesi için sıralama belirli hücre yüzeyi antijenlerine dayanmalıdır. Burada manyetik ilişkili hücre sıralamasını (MACS) gösteriyoruz - hücre yüzeyi işaretleyici CD73'e dayanarak fotoreceptöre özgü muhabir farelerin yenidoğan retinasından izole edilen nakledilebilir çubuk fotoreceptör öncüllerinin zenginleştirilmesi. Anti-CD73 antikorları ile inkübasyon ve ardından mikro boncuk konjuge sekonder antikorlar, çubuk fotoreceptör öncüllerinin MACS tarafından zenginleştirilmesini yaklaşık% 90'a kadar sağladı. Akış sitometrisine kıyasla MACS, GMP standartlarına daha kolay uygulanabilmesi ve yüksek miktarda hücrenin nispeten kısa zaman periyotlarında sıralanabilmesi avantajına sahiptir. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonlarının yetişkin vahşi tip farelerin alt alanına enjekte etmesi, sıralanmamış hücre süspansiyonlarına kıyasla 3 kat daha yüksek entegrasyon oranına neden oldu.
Giriş
Görme, insanların en önemli duyularından biridir. Bu duygunun bozulması ve körlük, sanayileşmiş ülkelerde engelliliğin başlıca nedenlerinden biridir. Görme bozukluğu veya körlüğün baskın nedeni, makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa, koni-çubuk distrofisi ve diğer durumlarda gözlenebildiği gibi fotoreceptör hücre kaybı ile karakterize retina dejenerasyonudur. Bugüne kadar, kayıp görüşü geri yüklemek için etkili bir tedavi mevcut değildir. 2006 ve 2008'de birbirinden bağımsız iki farklı laboratuvar rapor edildi, çubuk fotoreceptör öncül hücrelerinin yetişkin vahşi tip fare retinalarına başarılı bir şekilde nakli1,2. Böylece, fotoreceptör öncüsü hücre nakli olasılığının da dejenere bir retinaya dönüşmesi, dejenere fotoreceptörlerin yerini alması ve görmeyi geri kazanma olasılığı ortaya çıkmıştır. Nitekim, son zamanlarda gösterilmiştir. bu tür nakledilen fotoreceptör öncül hücrelerin, düzgün bir şekilde geliştirilen dış segmentler3, endojen bipolar hücrelere yakın sinaptik terminaller ve dış nükleer katman2-4'tebulunan yuvarlak bir hücre gövdesi gibi olgun vahşi tip fotoreceptörlerin morfolojik kriterlerini ortaya çıkardığı ve ayrıca5-7ana sinir devresine işlevsel olarak entegre olma yeteneği . Bu stratejinin ana ilkelerinden biri, doğum sonrası 4. gün (PN 4, PN0 doğum günü olarak tanımlanır) genç fare retinalarının kullanılmasıdır ve bu da transplantasyon için farklı hücre tiplerinin bir karışımı ile sonuçlanır. Gelecekteki bir terapötik uygulamanın arka planında, bu karışımın fotoreceptör öncül hücreler için saflaştırılması gerekir. CD73 retina8-10genç fotoreceptörler için özel ilk hücre yüzey belirteci olarak tanımlanmıştır. Burada, bu hücre yüzeyi işaretleyicisine dayanan ve manyetik ilişkili hücre sıralama (MACS) tekniğinin kullanıldığı bir fotoreceptör öncül hücre temizleme yöntemini gösteriyoruz. MACS, hızlı sıralama süreleri ve GMP koşullarına daha kolay uyum sağladığı için floresanla etkinleştirilen hücre sıralama tekniklerine kıyasla avantajlara sahip olabilir. Zenginleştirilmiş popülasyonu yetişkin vahşi tip retinalarda alt alana nakledirken ~%90 zenginleştirme ve 3 kata kadar daha yüksek entegrasyon oranı gösterebiliriz. Bu nedenle, MACS tabanlı fotoreceptör öncül hücre zenginleştirme ve subretinal transplantasyon, retina dejenerasyonu tedavisi için rejeneratif terapötik stratejinin geliştirilmesi için güvenilir ve umut verici tekniklerdir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanların etik kullanımı ve bakımı beyanı:
Tüm hayvan deneyleri Avrupa Birliği ve Alman yasalarına (Tierschutzgesetz) sıkı bir şekilde uygun olarak gerçekleştirildi ve ARVO Oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı'na bağlı kaldı. Tüm hayvan deneyleri TU Dresden ve Landesdirektion Dresden hayvan etik komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Hücre Ayrıştırma ve Hücre Sıralamaya Başlamadan Önce
- Üç 15 ml reaksiyon tüpünü şu şekilde etiketle: Yıkama (W), Pozitif fraksiyon (+) ve Negatif fraksiyon (-).
2. Retina Ayrışması
- Bir makas kullanarak PN 4 yavrularının kafasını koparın.
- Yavruların başını kısa bir süre içinde% 70 etanolde durulayın ve ardından PBS'de yıkayın.
- Başı soğuk HBSS'ye aktarın ve gözü enükle edin (bu adımı tüm kafalar için tekrarlayın). Enükle etmek için göz kapaklarını açın ve gözü optik sinir bölgesinde kavisli tokmaklarla sabitlayın. Sonra gözü dikkatlice yörüngeden çıkarın.
- Tüm gözleri kaplattıktan sonra retinayı izole edin: optik sinire kapalı bir makas sokun ve bıçakları açın. Peal RPE/chorid dışarı. Kavisli kümesleri kullanarak lensleri ve kan damarlarını çıkarın.
- İzole retinaları papain çözeltisini içeren 1,5 ml reaksiyon tüpüne aktarın (papain ayrışma kiti tarafından sağlanır).
- Retinaları papain çözeltisinde 37 °C'de bir su banyosunda veya çalkalayıcıda (400 rpm) 30-60 dakika kuluçkaya yatırın.
- Retinalar papain çözeltisinde kuluçkaya yatarken, pipet 15 ml reaksiyon tüpüne (etiket "1") 1 ml ovomucoid çözeltisi.
- 15 ml reaksiyon tüpüne (etiket "2") 60 μl DNase I (10 mg/ml) + 60 μl ovomucoid çözeltisi (kit tarafından sağlanır) + 520 μl EBSS ekleyin.
- Papain inkübasyonundan sonra, kısmen sindirilmiş retinaları içeren papain çözeltisini reaksiyon tüpü "2"ye aktarın.
- Yangın cilalı pipet kullanarak mekanik ayrışma (10x yukarı ve aşağı) gerçekleştirin.
- Pipet tek hücre süspansiyon reaksiyon tüpü "1". Hücre süspansiyonu ovomucoid çözeltisinin üzerine hafifçe katlayarak 2 katman oluşturmaya çalışın.
- 300 x g'da (yaklaşık 1.300 rpm) 5 dakika santrifüj.
- Üstnatant atın ve hücreleri 500 μl MACS tamponunda yeniden biriktirin.
3. Manyetik İlişkili Hücre Sıralama (MACS) Kullanarak Hücre Sıralama
- 10 μg/ ml'lik son konsantrasyonu elde etmek için 500 μl'ye X μl sıçan anti-CD73 antikoru ekleyin.
- Buzda 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 15 ml reaksiyon tüpünü MACS tamponu ile 10 ml'ye doldurun ve 300 x g hızında 5 dakika santrifüj edin.
- Üsttekini çıkarın.
- Peleti 480 μl MACS tamponunda yeniden sakla ve 120 μl keçi anti-sıçan IgG mikrobead ekleyin.
- Buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatır; karıştırmayın, sallamayın veya karıştırmayın.
- 15 ml reaksiyon tüpünü MACS tamponu ile 5 ml'ye doldurun ve 300 x g'da 5 dakika santrifüj edin.
- Reaksiyon tüpü santrifüjlendikçe:
- LS Sütununu manyetik standa ayarlayın.
- Önsezi filtresini LS Sütunu'nun üstüne yerleştirin.
- Önsezim filtresini ve LS Sütununu 3 ml MACS tamponu ile nemlendirin ve MACS tamponunu yıkama (W) tüpüne toplayın.
- Üsttekini çıkarın.
- Peletin 500 μl MACS tamponunda yeniden süzülür.
- 500 μl hücre süspansiyonunu filtreye yükleyin, ardından filtreye 1 ml MACS tamponu ekleyin ve negatif fraksiyonu negatif fraksiyon (-) reaksiyon tüpüne toplayın.
- Ardından, sütuna bağlı olmayan hücreleri yıkamak için sütuna 3 x 3 ml MACS arabelleği ekleyin
- Bu 9 ml LS Sütunundan geçtikten sonra, sütunu manyetik standdan çıkarın ve pozitif fraksiyon (+) reaksiyon tüpünün üzerine takın.
- LS Sütununa hızlı bir şekilde 5 ml MACS arabelleği yükleyin ve pistonu LS Sütununa koyun ve tüm arabellek sütundan geçene kadar bastırın.
- Pozitif fraksiyonu içeren reaksiyon tüpünü 300 x g'da 5 dakika santrifüj edin.
- Üst düğmeyi çıkarın, 500 μl MACS tamponunda yeniden dirilin ve 4 °C'de tutun.
- Ortak bir hücre sayma aygıtı kullanarak toplam hücre miktarını sayın.
- MACS tamponunda 2 x 105 hücre/μl içeren pozitif sıralanmış fraksiyondan bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve 4 °C'de tutun
4. MAC sıralı Fotoreceptör Öncü Hücrelerin Fare Retinasına Nakli
- Aşağıdaki çözümlerin tümünde hazır olduğundan emin olun: 1 ml steril PBS veya HBSS, 10 μl DNASE I, 1-2 ml steril deiyonize H2O, hücre süspansiyon fraksiyonlarının aliquots 4 °C.
- Yetişkin fareyi(yani 2-4 aylık) medetomidin hidroklorür intraperitoneal enjeksiyonu (0.01 mg/10 g vücut ağırlığı), ketamin (0.75 mg/10 g vücut ağırlığı) ile uyuşturun. Daha sonra ağrı kesici için buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) deri altı enjeksiyonu yapın.
- Fenilofilin düşüşü olan genişlemiş gözbebekleri %2.5-Tropicamid %0.5.
- Fareyi fare başı tutucusuna sabitle ve stereo mikroskop altına yerleştirin.
- Gözün kurumasını önlemek için bir damla Vizidik jel uygulayın.
- İğnede steril 30 G 1/2 kullanarak sklera ve kornea (sırasıyla ora serrata)arasındaki sınırda küçük bir delik açın.
- Ortak bir kapak kaydıramasını elmas bir kalem kullanarak küçük (yaklaşık 5 mm x 5 mm) parçalar halinde kesin, bu parçalardan birini korneanın üzerine yerleştirin ve retinanın doğrudan görselleştirilmesini sağlar.
- Presterilize mikroliter şırıngasını deiyonize su ile birkaç kez yıkayın.
- Mikroliter şırıngayı 1 μl hücre süspansiyonu ile yükleyin, konjonktiva ve sklera yoluyla teğetsel olarak doğrudan iğne yapın ve retinanın burun yarısında görsel kontrol altına yerleştirin.
- Alt alana ulaşana kadar retinaya hafifçe bir delik açın, hücre süspansiyonu alt alana enjekte edin.
- Retina alanının yaklaşık 1/4'lerini kanama olmadan kaplayan, düzgün olması gereken retinanın büllöz kopuşunun gözlemlenmesi.
- Şırındıcı nazikçe çekin, retina deliği otomatik olarak kapanır.
- Mikroliter şırıngasını deiyonize suyla birkaç kez yıkayın.
- Fareyi baş tutucudan serbest bırakın.
- Medetomidin hidroklorür etkisinin tersine çevrilmesi için atipamozol hidroklorür enjekte ederek fareyi uyandırın.
- Uyanma süresi için fareyi sıcak karanlık odaya (yaklaşık 25 °C) yerleştirin.
- Transplantasyondan sonraki 2 gün sonra, Ağrı kesici için sabah ve öğleden sonra deri altı enjeksiyonu ile Buprenorfin (0.05 mg/kg vücut ağırlığı) uygulanmalıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Çubuk fotoreseptörlerin fare retinasına entegre olma yeteneğini değerlendirmek için, GFP'nin nöral retina lösin fermuarı (Nrl, Nrl-GFP) promotörü11tarafından yönlendirildiği bir fare muhabir hattı kullanılmıştır. Nrl, yetişkinlik boyunca E12.5'te ekspresyonunu başlatan ve donör çubuk fotoreceptör hücrelerinin belirli bir şekilde etiketlenebilmesini sağlayan çubuk fotoreceptörlerin en erken belirtecidir.
PN 4 Nrl-GFP yavrularının kafası kesildi ve gözler enükle edildi. Retinalar daha...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fotoreceptör öncül hücrelerin subretinal nakli, bu ışığa duyarlı hücrelerin ana bilgisayar retinalarına önemli sayılarda entegrasyonunu sağlamak için güvenilir bir aracı temsil eder1,2. Bu, gelecekte retina dejeneratif hastalıkların tedavisi için bir hücre tedavisi kurulmasına izin verebilir6. Şu anda PN 4 retinalarından izole edilmiş olan hücrelerin donör popülasyonu, subretinal enjeksiyondan sonra sadece fotoreceptör öncül hücrelerin entegre olduğu farklı hücre türlerinin bir karışımıdır. CD73 tabanlı MAC sıralama kul...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Nrl-GFP fareleri sağladığı için Anand Swaroop'a, teknik destek için Jochen Haas'a ve hayvancılık için Sindy Böhme ve Emely Lessmann'a teşekkür ederiz.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir: FZT 111 - Rejeneratif Terapiler Merkezi Dresden, CRTD Tohum Hibe Programı, SFB 655 ve ProRetina e.V. vakıf, DIGS-BB Lisansüstü Programı Dresden ve Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Papain Ayrışma Sistemi | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | sağlanan DNaz I yöntemde kullanılmaz |
| Saflaştırılmış sıçan anti-fare CD73, klon TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stok konsantrasyonu 0.5 mg / ml |
| Keçi Anti-Sıçan IgG Mikro Boncuklar | Miltenyi | 130-048-501 | Toplam 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | hacmiToplam hücre sayısını saymak için kullanılır |
| DNaz I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Retinaların ayrışması için kullanılır |
| Tripan mavisi | Sigma | Fluka93595 | Toplam hücre sayısını saymak için kullanılır |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamin% 10 | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Fenilefrin %2.5-Tropicamid %0.5Üniversite | Klinikleri Dresden Eczane | ||
| Ön Ayırma Filtreleri | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Sütunları | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Ayırıcı | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Ateş cilası camı Pasteur pipet | Marka | 74777 20 | Pipet' Uçların ateşle parlatılması ve otoklavlanması gerekir. |
| MACS 15 ml tüp rafı | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Hücre sayım odası | Carl Roth | T728.1 | |
| Steril 15 ml tüpler | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | Olympus SZX10 yerine kullanılabilir Olympus SZX10 |
| Olympus | SZX10 | Leica M651 MSD | |
| yerine kullanılabilirOlympus ters çevrilmiş stereo mikroskop CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Hücre kültürü başlığı Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaksiyon tüpü | Sarstedt 727706400 | ||
| 2 ml Reaksiyon tüpü | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Santrifüj 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Fare kafası tutucu | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton mikrolitre şırınga 5 & mikro; l, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | iğnesiz teslim edildi |
| Hamilton RN özel iğne 34 G | Hamilton | 065-207434 | Künt, 12 mm uzunluk |
| Vannas-Tü bingen Yaylı Makas - 5 mm Bıçaklar Düz | İnce Bilim Aletleri | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forseps - Titanyum Biologie | Güzel Bilim Aletleri | 11272-40 | |
| Elmas kalem | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Kapak kaymaları | Kıvılcımlar | MIC3366 |
Kaynaklar
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
