Hücre nakli fotoreceptör kaybı ile karakterize retina dejenerasyonu tedavisi için bir stratejiyi temsil eder. Burada, nakledilebilir fotoreceptörlerin zenginleştirilmesi ve yetişkin farelere alt deri nakli için bir yöntem açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
MACS Saflaştırılmış Fotoreceptör Öncü Hücrelerinin Yetişkin Fare Retinasına Subretinal Transplantasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Retinanın ışık algılayan hücrelerinin, yani fotoreceptörlerin kaybına bağlı görme bozukluğu ve körlük, sanayileşmiş ülkelerde temel engellilik nedenini temsil eder. Dejenere fotoreceptörlerin hücre nakli ile değiştirilmesi, gelecekteki klinik uygulamalarda olası bir tedavi seçeneğini temsil etmektedir. Nitekim, son preklinik çalışmalar, doğum sonrası 4. günde yenidoğan fare retinasından izole edilen olgunlaşmamış fotoreceptörlerin subretinal transplantasyondan sonra yetişkin fare retinasına entegre olma potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Donör hücreler, iç ve dış segmentler, dış nükleer tabakada bulunan yuvarlak bir hücre gövdesi ve endojen bipolar hücrelere yakın sinaptik terminaller dahil olmak üzere olgun bir fotoreceptör morfolojisi oluşturdu. Nitekim, son raporlar donör fotoreceptörlerin konak farelerin sinir devrelerine işlevsel olarak entegre olduğunu göstermiştir. Bu tür hücre değiştirme yaklaşımının gelecekteki bir klinik uygulaması için, tercih edilen hücrelerin saflaştırılmış süspansiyonlarının üretilmesi ve göze uygun entegrasyon için doğru konuma yerleştirilmesi gerekir. Fotoreceptör öncüllerinin zenginleştirilmesi için, donör hücrelerin genetik muhabir modifikasyonunun önlenmesi için sıralama belirli hücre yüzeyi antijenlerine dayanmalıdır. Burada manyetik ilişkili hücre sıralamasını (MACS) gösteriyoruz - hücre yüzeyi işaretleyici CD73'e dayanarak fotoreceptöre özgü muhabir farelerin yenidoğan retinasından izole edilen nakledilebilir çubuk fotoreceptör öncüllerinin zenginleştirilmesi. Anti-CD73 antikorları ile inkübasyon ve ardından mikro boncuk konjuge sekonder antikorlar, çubuk fotoreceptör öncüllerinin MACS tarafından zenginleştirilmesini yaklaşık% 90'a kadar sağladı. Akış sitometrisine kıyasla MACS, GMP standartlarına daha kolay uygulanabilmesi ve yüksek miktarda hücrenin nispeten kısa zaman periyotlarında sıralanabilmesi avantajına sahiptir. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonlarının yetişkin vahşi tip farelerin alt alanına enjekte etmesi, sıralanmamış hücre süspansiyonlarına kıyasla 3 kat daha yüksek entegrasyon oranına neden oldu.
Giriş
Görme, insanların en önemli duyularından biridir. Bu duygunun bozulması ve körlük, sanayileşmiş ülkelerde engelliliğin başlıca nedenlerinden biridir. Görme bozukluğu veya körlüğün baskın nedeni, makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa, koni-çubuk distrofisi ve diğer durumlarda gözlenebildiği gibi fotoreceptör hücre kaybı ile karakterize retina dejenerasyonudur. Bugüne kadar, kayıp görüşü geri yüklemek için etkili bir tedavi mevcut değildir. 2006 ve 2008'de birbirinden bağımsız iki farklı laboratuvar rapor edildi, çubuk fotoreceptör öncül hücrelerinin yetişkin vahşi tip fare retinalarına başarılı bir şekilde nakli1,2. Böylece, fotoreceptör öncüsü hücre nakli olasılığının da d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanların etik kullanımı ve bakımı beyanı:
Tüm hayvan deneyleri Avrupa Birliği ve Alman yasalarına (Tierschutzgesetz) sıkı bir şekilde uygun olarak gerçekleştirildi ve ARVO Oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı'na bağlı kaldı. Tüm hayvan deneyleri TU Dresden ve Landesdirektion Dresden hayvan etik komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Hücre Ayrıştırma ve Hücre Sıralamaya Başlamadan Önce
- Üç 15 ml reaksiyon tüpünü şu şekilde etiketle: Yıkama (W), Pozitif fraksiyon (+) ve Negatif fraksiyon (-).
2. Retina Ayrışm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Çubuk fotoreseptörlerin fare retinasına entegre olma yeteneğini değerlendirmek için, GFP'nin nöral retina lösin fermuarı (Nrl, Nrl-GFP) promotörü11tarafından yönlendirildiği bir fare muhabir hattı kullanılmıştır. Nrl, yetişkinlik boyunca E12.5'te ekspresyonunu başlatan ve donör çubuk fotoreceptör hücrelerinin belirli bir şekilde etiketlenebilmesini sağlayan çubuk fotoreceptörlerin en erken belirtecidir.
PN 4 Nrl-GFP yavrularının kafası kesildi ve gözler enükle edildi. Retinalar daha.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fotoreceptör öncül hücrelerin subretinal nakli, bu ışığa duyarlı hücrelerin ana bilgisayar retinalarına önemli sayılarda entegrasyonunu sağlamak için güvenilir bir aracı temsil eder1,2. Bu, gelecekte retina dejeneratif hastalıkların tedavisi için bir hücre tedavisi kurulmasına izin verebilir6. Şu anda PN 4 retinalarından izole edilmiş olan hücrelerin donör popülasyonu, subretinal enjeksiyondan sonra sadece fotoreceptör öncül hücrelerin entegre olduğu farklı hücre türlerinin bir karışımıdır. CD73 tabanlı MAC sıralama kul.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Nrl-GFP fareleri sağladığı için Anand Swaroop'a, teknik destek için Jochen Haas'a ve hayvancılık için Sindy Böhme ve Emely Lessmann'a teşekkür ederiz.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir: FZT 111 - Rejeneratif Terapiler Merkezi Dresden, CRTD Tohum Hibe Programı, SFB 655 ve ProRetina e.V. vakıf, DIGS-BB Lisansüstü Programı Dresden ve Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Papain Ayrışma Sistemi | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | sağlanan DNaz I yöntemde kullanılmaz |
| Saflaştırılmış sıçan anti-fare CD73, klon TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stok konsantrasyonu 0.5 mg / ml |
| Keçi Anti-Sıçan IgG Mikro Boncuklar | Miltenyi | 130-048-501 | Toplam 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | hacmiToplam hücre sayısını saymak için kullanılır |
| DNaz I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Retinaların ayrışması için kullanılır |
| Tripan mavisi | Sigma | Fluka93595 | Toplam hücre sayısını saymak için kullanılır |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamin% 10 | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Fenilefrin %2.5-Tropicamid %0.5Üniversite | Klinikleri Dresden Eczane | ||
| Ön Ayırma Filtreleri | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Sütunları | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Ayırıcı | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Ateş cilası camı Pasteur pipet | Marka | 74777 20 | Pipet' Uçların ateşle parlatılması ve otoklavlanması gerekir. |
| MACS 15 ml tüp rafı | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Hücre sayım odası | Carl Roth | T728.1 | |
| Steril 15 ml tüpler | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | Olympus SZX10 yerine kullanılabilir Olympus SZX10 |
| Olympus | SZX10 | Leica M651 MSD | |
| yerine kullanılabilirOlympus ters çevrilmiş stereo mikroskop CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Hücre kültürü başlığı Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaksiyon tüpü | Sarstedt 727706400 | ||
| 2 ml Reaksiyon tüpü | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Santrifüj 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Fare kafası tutucu | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton mikrolitre şırınga 5 & mikro; l, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | iğnesiz teslim edildi |
| Hamilton RN özel iğne 34 G | Hamilton | 065-207434 | Künt, 12 mm uzunluk |
| Vannas-Tü bingen Yaylı Makas - 5 mm Bıçaklar Düz | İnce Bilim Aletleri | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forseps - Titanyum Biologie | Güzel Bilim Aletleri | 11272-40 | |
| Elmas kalem | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Kapak kaymaları | Kıvılcımlar | MIC3366 |
Kaynaklar
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
