Yöntem makalesi

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma Drosophila Larva

DOI:

10.3791/50998

⸱

7 Şubat 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Life Sciences Institute, University of Michigan, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 5Department of Mechanical Engineering, University of Michigan

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı görüntüleme, ancak bu canlı hayvanlarda zor olabilir, hücre biyolojik süreçleri incelemek için önemli bir tekniktir. Drosophila larva saydam manikür canlı görüntüleme çalışmaları için çekici bir model organizma yapar. Ancak, canlı görüntüleme teknikleri için önemli bir zorluk noninvaziv hareketsiz ve mikroskop bir hayvan pozisyon etmektir. Bu protokol bir polidimetilsiloksanın biz 'larva çipi' diyoruz (PDMS) mikroakışkan cihaz üzerinde Drosophila larvaları hareketsizleştirerek ve görüntüleme için basit ve kullanımı kolay bir yöntem sunar. Larva çip bir şırınga aracılığıyla bir vakumun uygulanması üzerine, hayvan hareketsiz ve bu sinir kablosu, segmental sinirler ve gövde olarak ventral getiren yapıları, ince bir cam lamel, eklenmiş bir rahat oturan PDMS microchamber oluşmaktadır lamel yakın mesafede duvar kasları. Bu yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar, ve daha da önemlisi, ane kullanımını önlerfizyolojik süreçleri geniş bir aralığının çalışma kolaylaştırır sthetics ve kimyasallar,. Larvalar hareketsizleştirme kolayca geri olduğundan, bunlar kolaylıkla çoklu görüntüleme oturumları tabi tutulabilir. Bu saatler gün arasında değişen bir süre boyunca uzunlamasına ders çalışmalar için izin verir. Bu protokol adım adım çip ve nasıl 3 instar larvaları nöronal olayların canlı görüntüleme için çip kullanmak için nasıl hazırlanacağını anlatır. Bu olaylar aksonlar, yaralanma kalsiyum yanıtları, ve uzun mesafeler ve zaman ölçekleri üzerinde fotoğraf-Cabrio proteinlerin kaçakçılığı time-lapse çalışmalarda organellerin hızlı taşınmasını içerir. Çipin diğer bir uygulaması, rejeneratif ve aksonal yaralanma dejeneratif yanıtları incelemek, bu nedenle bu protokolün ikinci bölümü bir segmental sinir izdihama periferik sinirler içinde ons yaralamaktan için yeni ve basit bir prosedür açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meyve sineği, Drosophila melanogaster, 100 yılı aşkın bir model organizma olarak kullanılmıştır, ve temel sinyalizasyon ve omurgasız insana korunmuş gelişimsel yolları tanımlayan vesile kanıtlamıştır. Spesifik hücre tiplerinde floresan etiketli proteinlerin ifade için pek çok genetik araçlar vardır, özellikle bu yana, canlı görüntüleme hücresel mekanizmaları çalışmak için önemli bir yaklaşım olduğunu ve basit vücut planı ve Drosophila larva saydam manikür canlı görüntüleme için cazip bir sistem yapar.

Canlı görüntüleme teknikleri için önemli bir zorluk noninvaziv hareketsiz ve mikroskopi için bir hayvan pozisyon etmektir. Geleneksel hareketsiz yaklaşımlar hayvan öldürmek her ikisi de, diseksiyon 1,2 ya da kloroform kullanımını içerir. Anestezik eter ve 4 izofloran 5-8 de kullanılmıştır. Anestetikler birçok avantaj sağlar iken, Onlar da bu nedenle okudu sürecini etkileyen ve hayvan üzerinde stres yaratabilir, nöral aktiviteyi ve (kalp atışı dahil) önemli fizyolojisini 9-11 inhibe. Eter ve izofluoran çalışmak için insan güvenlik kaygıları da vardır.

Biz 'larva çipi' 12 dediğimiz bir tek katmanlı PDMS mikroakışkan cihaz, Drosophila larvaları kılınması için bir ilaç içermeyen bir yöntem geliştirdik. Bu protokol almak veya larva çip yapmak nasıl anlatacağım ve erken sahnelenen 3. evre larvaları canlı görüntüleme için bunu kullanmak için nasıl. Yonga, bir şırınga ile bir vakumun uygulanması üzerine, hafif bir mekanik kuvvet ile hayvan hareketsiz, bir tatlı sıkı oturan microchamber, oluşur. Immobilizasyon yöntemi, böyle bir cam lamel yakın olan sinir kablosu, segmental sinirler ve vücut duvarı kasları gibi ventral yapıları getiriyor. Bu yüksek sayısal aper böyle yapıların yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin verirTure (yüksek büyütme) hedefler.

(I) yonga larva kullanılması anestezi yapılmamış hayvanlarda in vivo görüntüleme için izin veren, kimyasalların kullanımını yerine geçer: diğer geleneksel tekniklere göre larva çip avantajları şunlardır. (Ii) Larva hemen (izofluoran 8,13 için 2 saat iyileşme dönemi aksine) çip yayımlanmasından sonra iyileşir. Bu saat ve gün, milisaniye dakika arasında değişen geniş bir zaman ölçekleri üzerinde görüntüleme için izin verir. (Iii) bir gaz geçirgen bir madde olan PDMS, kullanılması larva vücuda çevre oksijen / hava sürekli difüzyonu olanak vermektedir. (Iv) yonga kullanımı kolay ve güvenli, ve (v) yeniden kullanılabilir, ve en az bir maliyetle imal edilebilir.

Larva çipi kullanarak talimatlara ek olarak, bu protokol 3 instar larvaları nöronal olayları incelemek için kullanımı çeşitli örnekler sağlayacaktır. Bu Axona canlı görüntüleme dahill ulaşım, yaralanma kalsiyum yanıtları, ve uzun mesafeler ve zaman ölçekleri üzerinde fotoğraf-Cabrio proteinlerin kaçakçılığı time-lapse çalışmaları.

Çipin diğer bir uygulaması, aksonal yaralanma nöronal yanıtları incelemektir. Bunun için ek bir prosedür bir segmental sinir izdihama periferik sinirler içinde ons yaralamaktan için (bölüm 3) tarif edilir. Bu basit deney aynı zamanda işlenecek bir çok hayvan sağlayan standart bir diseksiyon stereomikroskop altında, hem de hızlı bir şekilde ve yeniden üretilebilir yapılabilir. Yaralanma hücresel yanıtları larva çip canlı görüntüleme ile ele alınabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. PDMS Chip yapma

SU-8 kalıp bir PDMS çip yapmak için adımları 1.1-1.7 izleyin. Bir çip üzerinde-el olduğunu, ancak kullanımı için monte gerekiyorsa, 1.8 adıma atlayın.

  1. PDMS baz 45 g ve küçük tek kullanımlık plastik kap içinde bir PDMS kiti maddesi (10:1 oranı) kür 4.5 g karıştırın ve iyice bir plastik karıştırma sopa kullanarak karıştırın.
  2. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için 10 dakika boyunca bir vakum kabı (örneğin bir kurutucu) 'de kap yerleştirin.
  3. Çapında plastik bir kaba 150 mm altındaki SU-8 kalıp koyun ve yavaş yavaş, kalıp üzerindeki PDMS dökün. PDMS dökerken kabarcıkları üretmek için değil dikkat edin.
  4. 4 saat boyunca 650 ° C'de bir fırında (veya inkübatör) 'de PDMS Cure.
  5. Fırından tedavi PDMS/SU-8 kalıp çıkarın ve birkaç dakika boyunca soğumaya bırakın.
  6. Bir jilet kullanarak, SU-8 kalıp kenarı boyunca tedavi PDMS kesilmiş ve SU-8 kalıp ayırmak.
  7. PDMS levha BölBir jilet kullanarak bireysel PDMS cips içine.
  8. Bir 21 G iğne kullanılarak dağıtma, PDMS çipin (şekil 1A'da gösterilen) vakum portu bir delik sokmak.
  9. 23 G dağıtma iğne alın ve iğne kilit göbeğinden tüyo kırmak için kendi tabanından birkaç kez iğne ucu bükün.
  10. Boru iğnenin en azından bir milimetre kapsar, böylece polietilen boru küçük bir parça halinde 23 G iğne ucu yerleştirin. Sonra uzakta iğne aşırı boru kesmek için jilet kullanın. Bu vakum giriş noktasına yerleştirildiğinde bir yalıtım oluşturur iğnenin bir ucunun etrafına plastik bir halka oluşturur.
  11. Bir ters mikroskop (Şekil 1 B ve 2A-B) ile birlikte kullanım için: vakumlu port deliğine 23 G iğne ucu yerleştirin. Dik bir mikroskop (Şekil 1C ve 2C-D) ile kullanmak için: bir 21 G dağılma ile PDMS çipin yanı üzerindeki bir ikinci delik açmakİğneyi nsing, bu delik taraftan ilk delik erişim sağlayacaktır. Daha sonra, yan deliğe boru halka ile 23 G iğne ucu yerleştirin. En iyi delik (Şekil 1C) mühürlemek için PDMS çipin üst üzerinde çift taraflı bant bir parça yerleştirin.
  12. Uzunluk olarak yaklaşık 20 cm olan polietilen bir boru parça al. Vakum portuna sokulur iğne ucu için boru bir tarafı bağlayın.
  13. (Malzeme listede ''3-yollu valf bakınız), 3-yollu vana bağlantı noktalarından birine borunun diğer tarafında geç
  14. Kalan iki girişlerinden birine bir 20 ml şırınga takın. Son liman çevreye açıktır.

2. Canlı Görüntüleme Larva Chip kullanma

  1. Şeffaf yapışkan bant ile PDMS çip temizleyin. Çipin altına bir parça bant takın. Emin bant tüm PDMS yüzeye temas olun ve sonra şeridi sıyırın.
  2. Olmadığından emin olmak için yukarıdaki adımı 2-3x tekrarlayınPDMS çip yüzeyinde (önceki deneylerden elde tutulan) partiküller ya da herhangi bir yağ vardır. PDMS çip yeniden olduğu için, bu cam PDMS yapışma etkileyen ve yeterli bir sızdırmazlık neden gibi yağlı bir tortu çıkarmak çok önemlidir.
  3. Su içeren bir Petri 3. larva evresindeki erken (yani yağmalama) aktarın. (Toplayıcı 3 instar evre larva ziyade kültür flakon tarafı daha, gıda vardır). Kültür ortamının kaldırmak için su içinde larvaları batırın.
  4. Temiz bir cam lamel alın ve onun merkezinde Halokarbon 700 yağ küçük bir damla koyun.
  5. Forseps kullanarak, hafifçe pick up temiz, (larva uzunluğu ~ 3,5-4 mm olmalıdır) sudan 3 instar larva erken düzenledi. Aşırı su çıkarmak ve ardından petrol damla yerleştirmek için hafif bir mendil veya kağıt havlu üzerine kısaca hayvan yerleştirin. Damla kadar küçük larvaların trakea kaplı olmayan şekilde olmalıdır. Larva sta izin10 saniye boyunca petrol damla y.
  6. Petrol açılan larva çıkarın ve sonra temiz bir cam lamel üzerine yerleştirin.
  7. Başka temiz bir cam lamel larva transferi. Bu adım, aşırı yağı temizler.
  8. Larva yönüne dikkat edin. Nöral kord ve segmental sinirler görüntüleme için, larva ventral yüzü lamel oturmak gerekir. Iki boyuna trakeal tüpler ile karakterize olan dorsal yüzü, yukarı doğru bakmalıdır. Not: Bu larva doğal tercih yönlendirmedir.
  9. Yavaşça larva üstüne PDMS çip yerleştirin. Larva vakum noktasına yönelik kuyruğu, microchamber merkezi ortasına aynı hizada olmalıdır. Larva odasının kenarlarına değmeyecek dikkatli olun. Bu ön ve arka trakeal terminalleri için özellikle önemlidir. Not: Bu adım en iyi bir stereo mikroskop altında yapılır.
  10. Iyi bir sızdırmazlık elde etmek için cam lamel karşı PDMS çipi itin. Larva tamamen emin olunPDMS çip cam lamel dokunuyor microchamber tarafından eklenmiştir.
  11. Şırınga bir vakum oluşturmak için (tüp yoluyla) PDMS microchamber hava çekmek için böyle üzerinde 3-yollu vanayı kapatın.
  12. Tek bir el ile sıkıca PDMS çip / cam lamel tutun. Şırınga pistonu çekmek için diğer elinizi kullanın. Direnç vakum oluşturmak için, şırınga kolu hissedilir kadar, hava 2-2.5 ml çekin. Vakum PDMS çip, yağ ve lamel arayüzler arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşturur ve larva hareketliliğini kısıtlar.
  13. PDMS çip şırıngadan ve çevreden izole edilir, öyle ki kapatma vanasını açın. Sonuç olarak, nispeten kararlı bir vakum seviyesi, şırınga pistonu tutulması için gerek kalmadan microchamber korunur.
  14. Tüm hayvan vücut microchamber içine yerleştirilir, ve hayvan hareketsiz olduğundan emin olmak için Stereoskop altında larva kontrol edin. Trakea görünür olmalıdır. Geri kalanıPDMS çip lamel ile temas halinde olmalıdır. Not: doğru çip hareketsiz hayvanların örnekleri için Şekil 2E ve 2F bakınız. Bazı yanlış yönelimleri Şekiller 2G ve 2H gösterilmiştir.
  15. Mikroskop larva çip (yonga PDMS + cam lamel) yerleştirin. Larva çip, boru ve şırınga lamel PDMS çipin ayrılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Dik bir mikroskop için, çift taraflı bant (Şekil 1C) ile mikroskop aşamasında çip 'üst' tarafını düzeltmek.
  16. Ilgi hayvanın yapısı (ler) bulmak ve görüntüleme gerçekleştirmek için yüksek büyütme hedefi (yağ daldırma, 40-63X tavsiye edilir) kullanın. Bazı durumlarda, daha düşük bir büyütme daha yüksek bir büyütmede geçmeden önce görüntüleme için arzu edilen bölgesini tespit etmek gerekli olabilir.
  17. Görüntüleme işlemi tamamlandığında, pozisyonuna geçiş valfı tarafından yapılan vakum uygulaması durdurulurbu ortama açıktır.
  18. Lamel PDMS çipi ayırın. Larva derhal hareketli olmalıdır.
  19. Microchamber gelen larva kaldırmak ve yavaşça toparlanma için bir üzüm suyu agar plaka üzerinde larva yerleştirmek için forseps kullanın.

3. Larvaların segmental sinirler bir Sinir Crush Yaralanma Inducing

  1. Izole etmek için yukarıdaki adımı 2.3 izleyin erken istenen genotip 3. larva evresindeki düzenledi. Adım 2.3 'de açıklandığı gibi gıda kaldırmak için suda larva yıkanmak.
  2. CO ile, standart bir sinek CO 2 Anesthetization istasyonu kullanın 2 ped larvaları bastırmak için, bir diseksiyon stereomicroscope altında tuttu. Larva 1-2 dakika için CO 2 pad üzerinde yerleştirildikten sonra immotil haline gelmelidir.
  3. Şimdi stereomicroscope altında bir üzüm suyu agar plaka üzerine tek bir anestezi larva yerleştirin. Ventral sinir kablosu görselleştirmek ve (manikür sinirler segmental kadar hayvan ventral tarafını çevirin Şekil 3). Larva tamamen immotil olduğundan emin olun.
  4. Dumostar sayı-5 forseps kullanarak, sıkı 5-10 saniye için manikür segmental sinirler çimdik. Bu doğru yapıldığında, manikür bozulmadan kalır ve vücut duvarı deldi değildir. Not: yaralanması, ön-arka gövde ekseni boyunca farklı pozisyonlarda yapılabilir sürece ventral sinir kablosu, tükürük bezleri, bağırsakların zarar değildir. Şekil 3B 'de gösterildiği gibi en etkili yaralanma konumu, 3. karın segment sonuna doğru yer alır. Bu konum zararların en sinirler de yaralanma ve hayvan öldürmeden çoğaltmak kolay değildir.
  5. Yaralanma sonrası, hayvan çevirmek aşağı üzüm plaka üzerindeki ventral yüzü o kadar. Onun kafasını taşımak ve yemek gerekir. Yaralanma başarılı olursa, o zaman larva posterior yarısı felç olacak.
  6. 25 de üzüm suyu agar plaka üzerinde yaralı hayvanları tutmak ve# 176; C deneysel amaca göre istenilen zaman için. Motonöronlar için, proksimal güdük yaralanma 14 8-10 saat içinde filiz başlar ve distal güdük 6-8 saat 15 içinde dejenere başlar. Sınıf IV da duyusal nöronlar için, proksimal güdük yaralanma sonrası 3-4 saat içinde dejenere için 4-6 saat, ve distal güdük başlangıç ​​içinde filiz başlar. Not: Uygun Gal4 sürücüleri ve floresan gazetecilere, filizlenme ve dejenerasyon (örneğin, bakınız Şekil 6) larva çip görülebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Larva yonga, tasarımı, Şekil 1 'de şematik olarak gösterilmiştir tek katmanlı bir PDMS bloğu, (a PDMS chip) oluşur. (Ayrıca kendi kalıp tasarımı için ek DXF dosyasına bakın). Larva microchamber, vakum liman ve çevre kanalları (Şekil 1A) PDMS çip 140 mikron izlerdir. Yonga, bir üstüne konumlandırılmış erken bir yağ (Şekil 1B ve 1 C) bir lamel üzerinde durmaktadır 3. instar larvası, düzenledi. Lamel ve PDMS yonga arasındaki yağ cam arayüzü hafif bir vakumun uygulanması üzerine oluşturulacak bir conta sağlar. Bu mühür, oda içindeki larvaları yakalar, ve erken aşamalı Başlangıcı 3. instar larvası odacık bazı fiziksel hayvan üzerinde daralma etkili hareketsiz kılma ve onun hareketini sınırlayan sızdırmazlık oluşturur, bölmenin biraz daha kalındır. Bu hareketsiz durumda, belirli ventralBöyle ventral sinir kablosu ve segmental olarak vücut yapıları, lamel yakın itilir. Hareketsiz halde bu yapıların 40X ve 63X hedeflerin çalışma mesafesi içinde yer çünkü bu, görüntüleme için avantajlıdır. Vakum serbest bırakıldıktan sonra larva kolaylıkla ilave deneyler izin vererek, microchamber kaldırılabilir. Bu tamamen mekanik immobilizasyon yaklaşım kadar 1 saat 12 sürekli hareketsizlik dönemlerinden sonra diri larvaların% 90 tutabilirsiniz.

Vakum basit bir 20 ml şırınga, bu nedenle bütün birim odası içinde konumlandırma canlı görüntüleme gerçekleştirilir konfokal mikroskop ya da epifloresans, için, bir stereo gerçekleştirilir, ikinci taşıma kolay tarafından oluşturulur. 1,6-1,14 adımda tarif edildiği gibi şırınga (uzaklaştırıldı kilit hub) polietilen boru ve 23 G iğne ile dağıtma vakum noktasına bağlanır. Ters mikroskoplar, boruya içinve şırınga çip (Şekil 1B, 2A ve 2 B) en üzerinden bağlanır. Dik mikroskopları için, bu çipin tarafında bir bağlantı noktası (Şekil 1 C, 2C, ve 2 D) yoluyla bağlanır. Ters mikroskopları için yapılandırma kullanımı biraz daha kolaydır. Şırınga yakalama ve oda içindeki larva hareketsiz, lamel ve PDMS cihaz arasında sıkı bir sızdırmazlık meydana getirmek üzere yağ cam PDMS arayüzü bağlanan yumuşak bir vakum (yaklaşık 10 psi) oluşturmak için çekilir.

Microchamber içine larva yerleştirme (protokolde 2,7-2,10 adımlar) etkili hareketsizlik ve sağkalım (Şekil 2E-H) için önemlidir. Hayvan da (Şekil 2G), odası için büyük, ya da eğer onun baş veya trakea odasının kenarı ve kapakları arasında sıkışıp kalırsanızDudak (Şekil 1 H), o zaman işlem hayatta kalmak için mümkün değildir.

Aşağıdaki nöronlarda çeşitli hücresel tepkiler incelemek için larva çip (4-7, film S1 ve S2 Şekil Film) kullanımının çeşitli örnekleridir.

Hızlı aksonal taşıma Görüntüleme: larva yonga görüntü bireysel periferik akson içinde sinaptik veziküllerin kinesindir aracılı taşıma (Şekil 4 ve Film S1) için kullanılan anterograd (~ 1.0 mm / sn) ve retrograd (~ 0.8 mm / sn. Bu kesecikler) hareketi kolayca bir dönen disk konfokal mikroskop toplanan filmlerde incelenebilir.

Lazer mikro için hayvan yerleştirme:. Bir duyu nöron dendrit (Şekil 5 ve film S2) darbeli bir lazer kullanılarak UV boya nakledilir t kullanımı için protokollermikrocerrahi için onun yöntemi başka yerde 16,17 bulunabilir. Verimli immobilizasyon tekniği gibi algılanabilir ve ölçülebilir olması (genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergesi GCamp3.0 18 ile tespit) hücre içi kalsiyum değişiklikleri gibi yaralı nöron hızlı zaman çaplı değişiklikler, (Şekil 5) sağlar.

Yaralanma rejeneratif ve dejeneratif tepkilerin Çalışması: hayvan görüntüleme oturumları arasında dinlenmek için izin verilirse, larva çip sonra zaman ölçekleri geniş bir yelpazede üzerinde meydana hücresel olayları incelemek için kullanılabilir. Örneğin, 'rejeneratif' ve 15 saatlik bir zaman ölçeği üzerinde gerçekleşecek aksonal yaralanma, dejeneratif tepkileri her iki larva yonga (Şekil 6) görüntülü olabilir. Bu örnekte, octopaminergic motor nöronlar aksonlar protokolünün bir parçası 3 'de tarif edilen segmental siniri paralizi (Şekil 3) ile yaralandı. Proksimal akson güdük,Yeni filizlenmesini uğrar, ve varisler oluşturması ve sonra Wallerian dejenerasyon sürecinde parçalanır distal aksonlar, yaralanma sonrası görüntülü ve farklı zaman aralıklarında okudu edilebilir.

In vivo olarak, zaman içinde photoconvertible floresan proteinleri izleme: floresan, UV ışığına maruz kalma üzerine geri dönüşü olmayan değişiklikler photoconvertible floresan protein) bir gelişme bir özel bir hücre içinde protein bir alt etiket, ve zaman boyunca 19 etiketli proteinler kaderini izlemek sağlar: 20. Bu teknik en yaygın olarak, bir in vivo olarak tanımlanan hücreler içinde genetik olarak kodlanmış proteinleri photoconvertible izleyebilir larva çip ile, ancak, hücre kültürü içinde gerçekleştirilmektedir. Bir örnek olarak Denda2-α-tubulin füzyon proteini, sınıf IV da duyusal nöronlar olarak ifade olduğunu göstermektedir, Şekiller 7A (hücre gövdelerinde photoconverted edilebilir B). Photoconverted proteinlerin ulaşım sonra zamanla izlenebilir: iki gün içinde biz uzakta hücre gövdesi (Şekil olarak özgün konumundan ~ 1 mm yalan duyu nöronlarının akson terminalleri, içinde photoconverted proteinin önemli bir miktarını tespit olabilir Şekil 7A ve 7 ° C).

Tarif edilen tüm örnekler (Şekil 4-7 ve Filmler S1 ve S2), bir Nipkow CSU10 tarayıcı ve C9100-50 EMCCD kamera oluşan bir dönen disk konfokal sistemi kullanılarak görüntülendi, 63X (1.5 NA) ile bir Axio Observer üzerine monte yağ objektif ve Volocity toplama yazılımı kullanarak tahrik.

figure-results-1
Şekil 1. larva çip kullanan güçlü> şematik karikatürler.
(A) bir çip larva cam lamel yapıştırılmış açık mavi belirtilen PDMS çip, oluşmaktadır. Çip beyaz belirtilen 140 mikron kalınlığında mikroakışkan kanalları içerir. Merkez microchamber rahatça erken (açık yeşil cartooned) 3. instar Drosophila larva sahnelenen uyacak şekilde tasarlanmıştır. Kalıp tasarımı için kullanılabilecek tam boyutları içeren bir dosya DXF Yardımcı veriler olarak sağlanmaktadır. Ölçek çubuğu = 1.5 mm. Larva yonga içine bir larva yükleme için şemadaki (BC) Side-bakıldı. Larva aşağı lamel ventral tarafında oturur, ve vücut 140 mikron derin microchamber içinde yatıyor. Bir 20 ml şırınga vakum giriş noktasına bağlanır ve hafif bir vakum indüklemek için kullanılır. Halokarbon yağ PDMS-cam arayüzü microchamber içinde larva kısıtlayan sıkı bir mühür içine vakum ile bağlıdır. Bu mühür kolayca tersine çevrilebilirşırıngadan basıncı serbest bırakarak, sonra hayvanlar derhal hareketliliğini kavuşur. Dik mikroskopları (B) için, şırınga vakum çipin üstten polietilen boru 50 üzerinden bağlanır. Çipin 'üst' çift taraflı bant ile mikroskop aşamasına bağlı iken çevrilmiş mikroskop (C) için, bu bağlantı, çipin tarafından yapılır.

figure-results-2
Şekil 2.. PDMS cips ve larva doğru konumlandırma Görüntüler.
(AD). Ters ve dik mikroskoplar için PDMS cips gösteren fotoğraflar. 23 G dağıtma iğne ucu vakum (şırınga) boru yoluyla bağlantı sağlayan, vakum portuna takılmıştır. Ölçek çubuğu = 1.5 mm. (EH). Drosophila larva Parlak alan görüntüler. E ve doğru hareketsiz hayvanların F örnekleri göstermektedir. Uzun zaman ölçeklerinde (> 12 saat) üzerinden birden fazla görüntü yapılacaktır eğer F küçük hayvan tercih edilir. G çok büyük bir hayvan gösterir, ve H yanlış yerleştirilmiş küçük bir hayvanı gösterir. Ölçek çubuğu = 1.5 mm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

figure-results-3
Drosophila larva segmental sinirler Şekil 3.. Sinir ezilme yaralanması.
(A) sinir ezilme testinin Karikatür. 3 rd içinde segmental sinirler (B) manzara sinir ezmek sonra 20 saat disseke. Anti-HRP antikorları (kırmızı) ile nöronal membranların için immün beyin lobları, ventral sinir kablosu ve motonöron ve duyusal nöron aksonları içeren uzun segmental sinirler vurgulamaktadır. Bireysel motor nöronlar bir alt m12-Gal4 sürücü ile UAS-mCD8-GFP (yeşil) ekspresyonunu tahrik ile etiketlenir. Aksonları segmental sinirler yoluyla vücut duvarı kasları proje ise hücre organları ve bu nöronlardan dendritlerden, ventral sinir kablosu yalan. (Bu sürücü de birlikte hayvanın her iki tarafında ön-arka çizgili olarak görülebilir ki, her bir larva için hemisegment kas 12 GFP ekspresyonu sağlayan). Ezmek zarar bölge mavi noktalı çizgilerle vurgulanır. Ölçek çubuğu = 70 mikron. (C) hasarlı akson, yaralanma sonrası 20 saat manzarasına kadar kapatın. Sol:proksimal akson çimlenme geçirmiş ve yeni bir büyüme oldu. Sağ: distal akson küçük GFP nedeniyle Wallerian dejenerasyon ve enkaz temizlenmesi için, kalan, parçalanır. Ölçek çubuğu = erken 3 instar larva sinir ezmek 10 mikron. (D) Görüntüler. Ventral sinir kablosu için kırmızı ok puan. Protokol metni (Protokolü 3) de anlatıldığı gibi ezmek konumu, 3 segmentinin alt kısmına doğru olan. D görüntüler aslında J. yayınlandı Hücre Biol 191, 211-223, DOI:.. 10,1083 (2010) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Peptiderjik sinaptik veziküllerin aksonal taşıma Time-lapse görüntüleme.ANF ​​GFP, UAS-ANF-GFP 21 ile etiketlendi atriyal natriüretik peptid sıçan, eve-RRA-Gal4 sürücüsü 22 kullanarak belirli motonöronlar içinde ifade edildi. Segmental sinirler canlı görüntüleme akson peptiderjik veziküllerini etiketli ANF-GFP hızlı taşıma ortaya koymaktadır. Ayrıca Movie S1 bakınız. Canlı time-lapse görüntüleme gelen motonöron akson (A) Tek kare. Yeşil, kırmızı ve mavi oklar anterograd örnekleri, kırtasiye ve retrograd veziküller gösterir, sırasıyla. Ölçek çubuğu = 5 um. (A ') film Bireysel zaman çerçeveleri ImageJ kullanılarak birleştirilmiştir. (B) ANF-GFP ulaşım time-lapse görüntüleme oluşturulan bir kymograph, bir dakika kapsayan tek kare bir koleksiyon oluşturuldu Kymographs bölümlenmiş izleri yamaçlarından hesaplandı ortalama segmental hızlarının İmageJ 23 için 'Çoklu kymograph' plug-in kullanarak görüntüleme zamanı. (C) Kantitasyonu. Presen yeşil çubukts anterograde segmental hızı (n = 543) ve mavi çubuk 10 Kymographs veziküller retrograd segmental hızı (n = 548) sunuyor. parçacık yoğunluğu (D) belirlenmesi. Parçacık yoğunluğu (yeşil çubuğunda gösterilir) anterograd sayısına, 10 Kymographs akson uzunluğu 100 um ortalama sabit (kırmızı çizgi ile gösterilen) ve (mavi çizgi ile gösterilen) retrograd parçacıklar ile ölçülmüştür. Bu şekilde, veriler, et al Ghannad-Rezaie daha önce yayınlanmış, PLoS bir 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).

figure-results-5
Şekil 5,. Lazer mikrocerrahi ve kalsiyum görüntüleme için larva çipin kullanılması.
Sınıf IV duyusal nöron bir dendrit darbeli bir UV dye lazer yüksek güçlü lazer darbeleri ile ile kesişen edilir. Mikrocerrahi için bu yöntemin kullanımı için başka protokoller 16 bulunabilir. Larva çip etkili immobilizasyon canlı görüntüleme ile incelenmesi gereken hücre içi kalsiyum seviyelerinde hızlı değişikliklere izin verir. Bu örnekte, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi GCaMP3.0 PPK-Gal4 sürücüsünü kullanarak Sınıf IV dendritik arborization (C4da) duyusal nöronlar ifade edildi. GCaMP3.0 şiddeti (A) Time-lapse görüntüleri rengine göre renkli yanlış olduğunu zamanla yoğunluğu değişiklikleri göstermek için yoğunluk ölçek. Bireysel kare 5 kare / sn dönen bir disk konfokal mikroskop görüntülü bir time-lapse film (Film S2) çıkarıldı. Kalsiyum dinamiklerinin (B) miktarının belirlenmesi lazer mikrocerrahi cevaben. Bireysel nöronların soma GCaMP3.0 floresan yoğunluğu (ΔF/F0) ait normalize kat değişimi (gri gösterildiği gibi, n = 7) zamana karşı çizilmiştir. Ortalama ΔF/F0 turuncu temsil edildi. GCaMP3.0 yoğunluğunun en yüksek artış, yaralanma sonrası 1-2 saniye arasında gözlenmiştir. Arka Plan ham G-CaMP3.0 floresan yoğunluğu çıkarıldı. Bu şekilde, veriler, et al Ghannad-Rezaie daha önce yayınlanmış, (2012) PLoS bir 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 12.

figure-results-6
Larva çip kullanan Şekil 6.. Görüntüleme aksonal filizlenme ve dejenerasyon. Proksimal güdük (solda) ve sinir ezmek sonra farklı zaman noktalarında octopaminergic motonöron akson distal güdük (sağ) Temsilcisi konfokal görüntüler. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, Resimler 'e benzer yerlerde alınmıştır. Bu nöronlar TDC kullanarak bir UAS-mCD8-RFP transjenin ekspresyonunu ile etiketlenir2-Gal4 sürücü 24,25. Bu nöronların hücre gövdeleri ventral sinir kablosu 24 yer alır. Üç ayrı akson tek bir segmental sinirin içinde görülebilir ve kolayca birbirinden çözümlenir. Bu, bu nöronlar için 15 saat içinde tamamlanır dejenere akson parçalanması, bireysel hücresel olayların çalışma için ideal bir durumdur. Görüntüler, bir dönen disk konfokal mikroskop 63X büyütmede larva çipi kullanılarak canlı hayvanlardan elde edilmiştir. Ölçek çubukları sağ paneller (distal kütükleri) için 10 sol panelleri için mikron (proksimal kütükleri) ve 20 mikron =. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7. Larva kullanmaCanlı hayvanların uzun süreleri ve mesafelerde photoconverted floresan proteinleri izlemek için çip.
Bu örnekte, α-tubulin kaynaştırılmış photoconvertible floresan protein Dendra2 19, bir füzyon proteini, ppk-Gal4 sürücüsü kullanarak, sınıf IV dendritik arborization (C4da) duyusal nöronlar bir UAS-Dendra2-α-tubulin transgen eksprese edilir Fotoçevrim deney için 26. (A) şematik. C4da nöronların hücre gövdeleri çevre yatmak ve kordon sinaptik sinir terminalleri oluşturmak üzere segmental sinirler yoluyla aksonlar uzanır. Hayvanın arka yarısında hücre kütlelerinin bir alt-grup içinde Dendra2-α-tubulin Hg lambası (sol çizgi) ile standart bir DAPI filtre kullanılarak 6 saniye boyunca UV aydınlatma ile Fotoçevrim tabi tutulur. Süre sonra photoconverted Dendra2-α-tubulin ventral sinir kordon sinaptik terminallerindeki tespit edilebilir. Bu, tubulin protein tran olduğunu gösterir(~ 1-2 mm) uzun bir mesafe üzerinden oynadı. Bir sınıf IV duyusal nöron hücresi vücutta Dendra2-α-tübülinin Ölçek çubuğu = 1 mm (B) Örnek görüntüleri önce ve sonra Fotoçevrim. Ölçü bar = 5 um. (C) hücre gövdeleri Fotoçevrim sonra 0 saat ya da 48 saat ya da sınıf IV duyusal nöronlar için sinaptik terminallerinden örnek görüntüler. Bir süre sonra sinaptik terminallerindeki photoconverted Dendra2-α-tübülin spesifik görünümü protein akson terminus hücre gövdesi gitti anlamına gelir. Her zaman noktalarında Fotoçevrim ve görüntüleme larva çip yapılmıştır. Ölçek çubuğu = 15 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Film S1. Lazer mikrocerrahi ve C4da nöron kalsiyum görüntüleme. Darbeli UV lazer prim transect kullanıldıary dendritik dal. Lazer transseksiyon yaralanma yerinde başlayan ve hücre gövdesine gitti GCaMP yoğunluğu hızlı bir artış, neden. UAS-GCaMP3.0 18 C4da spesifik PPK-Gal4 sürücüsü 26 kullanılarak ifade edildi. Filmleri GCaMP3.0 göreceli yoğunluk seviyelerini göstermek için renkli sahte idi. Zaman atlamalı görüntüleme / sn 5 kare ile iplik disk konfokal mikroskobu ile yapılmıştır.

Film S2. motonöronları ANF-GFP Hızlı aksonal taşıma.
ANF ​​GFP, UAS-ANF-GFP 21 ile etiketlenmiş sıçan atriyal natriüretik peptid eve-RRA-Gal4 sürücüsü 22 kullanarak belirli motonöronlar içinde ifade edildi. Larva segmental sinirler olan bu peptiderjik veziküllerin taşıma dönen bir disk konfokal mikroskop kullanılarak 300 msn / çerçeve de larva çip üzerinde görüntülendi.

Ek Figure1 (DXF dosyası)
Silikon kalıp imalatı için DXF dosya. Dosya 4 inç silikon yonga üzerinde olumsuz Fotorezist maske (SU-8 için karanlık yayımlandı maskesi) için tasarlanmıştır. İkinci sıra bu protokolde kullanılan larva cips yapmak için 5 kalıpları içerir. Bu çipleri (2. satırda) Her bir erken evre 3 instar larva uyacak şekilde tasarlanmış bir ~ 5,4 mm x 1,5 mm odasını içerir. Üçüncü sıra (satır 3) küçük bir odasını (~ 4.4mm x 1.5mm) içerir ise ilk satır (satır 1), büyük bir odasını (~ 5,4 mm x 2 mm) içerir. Bunlar sırasıyla, daha büyük ve daha küçük boyutlarda larvası ile kullanılabilir. = 2 mm Ölçek çubuğu.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapma veya larva çip elde:

Larva yonga, cam lamel bağlı bir PDMS bloğu ('PDMS çip' olarak adlandırılır) oluşur. 1. adımda protokol yapma ve larva çipleri kullanarak, bir SU-8 kalıp kullanılabilir olduğunu varsayarak için prosedür açıklanmaktadır. SU-8 kalıp photolithographically (ayrıntılar Ghannad-Rezaie vd. 12 bakınız) bir silikon yonga üzerinde bir 140 mikron kalınlığında SU-8 fotorezist tabaka desenlendirme tarafından mikrofabrike edilir. SU-8 kalıp mikroimalat özel ekipman erişimi gerektirir, biz bir mikroimalat tesisinden sipariş öneririz (örn.. Michigan 14 Üniversitesi LNF tesis), ya da onlara sağlanan yonga tasarımı göndererek dökümhaneden ek bir dosya olarak. On (farklı boyutlarda larvaları ile kullanım için, örneğin) PDMS yonga tasarımı, DXF dosya (örn. Autocad) kolları CAD yazılımı değiştirmek isterse de kullanılabilir. Bir SU-8 kalıp da Fernandes talimatı izleyerek içi yapılabilir vd. 27. Pek çok okuyucu bu elverişli sadece kendi cips imalatı önce tekniğini denemek için bir örnek PDMS çip elde etmek için bulabilirsiniz. Bu istek üzerine serbestçe sunulacaktır.

Canlı görüntüleme için mikroakışkan 'larva çip' Kullanımı:

Larva chip bir hareketsizleştirme yöntemi, anestezik kullanımı önler, ve bunun yerine, hayvanın hareketi kısıtlamak için, bir vakumun uygulanması yoluyla, basınç içerir. Hayvanlar birkaç saat 12, daha kısa bir immobilizasyon bir süre (5-15 dakika) için çip immobilizasyon yaşayabilir da tavsiye edilir. Bu hücre içi kalsiyum değişikliklere veya hızlı aksonal taşıma gibi çok sayıda hücresel olayları, görüntüleme için yeterli zamanı. Bu, aynı zamanda lazer tabanlı mikrocerrahi, ağartmanın ve photoconver gibi canlı hayvan istenilen manipülasyonları için yeterli zamanısion.

Uzunlamasına tek bir hayvanda daha uzun bir süre boyunca etkinliklerini inceleme için, hayvanlar dinlenme süreleri ile ayrılmış, bir kaç kez çip yerleştirilir ve görüntülenebilir. Bunlar kolay bir besin kaynağı ve nem sağlamak gibi üzüm suyu agar plakaları, görüntüleme oturumları arasında dinlenmek için idealdir. Her oturum (aşağıda, sorun giderme bölüm 2 bakınız) hayvan zarar için bazı risk taşır bu yana çoklu görüntüleme oturumları, bir dereceye kadar larva hayatta etkiler. Hayvanlar rutin olarak% 50'den daha fazla hayatta kalma oranı, iki gün boyunca> 5 kez görüntülenebilir. Hayvanlara anestezi olmadığı için, hemen çip vakumun serbest bırakılması sonrasında sağlıklı ve hareketli bulunmaktadır. Orada görüntüleme oturumları arasındaki geri kazanım süresine gerek bu nedenle, bu nedenle oturumları arasındaki zaman aralığı esnektir ve deney amaçları için ayarlanabilir.

Sorun Giderme:

En yaygın tekniklarva çip ve önerilen çözümler şunlardır ile mahkemeye verdi:

(1) hayvan çok fazla hareket ediyor. Çok fazla hareketlilik görüntüleme hedefleri engelleyebilir. Larva chip bu için en yaygın nedeni a) Hayvan çip için yeterli değildir, veya b) hareketsiz hale getirme adımı sırasında uygulanan vakum basıncı tehlikeye bulunmaktadır. Erken 3. larva evresindeki sahnelenen için bu protokolü açıklanan larva çip tasarlanmıştır. Hayvan için en uygun boyutu (ön-arka ekseni boyunca) uzunluğunda 3.5-4 mm'dir. Direnç kolu hissedilir kadar vakum basıncı yeterli olduğundan emin olmak için, şırınga 2-2.5 ml çekin, ya da. Vakum çalıştığından emin bir göstergesi çevre kanal küçük kabarcıklar vakum kaynağına doğru yavaşça hareket görülebilir olmasıdır. Başka bir göstergesi yonga (üstten kaldırıldığında lamel her çip ile seyahat gerektiğidir ve bu bölmeyi taşınması için önerilen bir yöntemdirlarva konumlandırılmış ve vakum) hakkında bir kez. Boru içinde çatlak varsa vakum tehlikeye olabilir veya yağ boru içinde ise. Bu kolayca (adımlarla 1,6-1,14 itibaren) iğne ucu ve polietilen-50 tüp dağıtım 23 G değiştirerek ele alınabilir.

(2) Hayvan chip görüntüleme sonra ölür. Prosedür hayvana göre en az strese neden amaçlanmıştır ve vahşi tip genotip hayvanlar da çip 12 hareketsizleştirme bir saat sonra, bir>% 90 hayatta kalma oranına sahip edilir. Bazı genotipleri çipin strese daha az esnek olabilir için, ilk olarak vahşi tip hayvanların (örneğin, Canton S) hareketsizleştirici teknik hayatta kontrol edin. a) öldürücülüğü için en yaygın nedeni larva yanlış konumlandırma (Şekil 2G-H bakınız). Kütikül, baş ya da trakea parça bölmenin içinde tamamen değil ise, o zaman hareketsizleştirilmesi sırasında hasar ve edebilirçip (> 4 mm) için çok büyük larva hayatta kalmak için daha az olasıdır. b) öldürücülüğü için daha az yaygın nedeni çok fazla basınç veya vakum çip yükleme kullanılmasıdır. Düzgün bir chip yerleştirildikten sonra, vakum ile oluşturulan basınç iyi tolere edilir. Bununla beraber, vakum ya da hayvan konumlandırılması ilk aşamada ya da aşırı basınç, bir sorun olabilir. Bu, doğru boyutta vahşi tip larvası ile deneyler ile ampirik olarak gerekli basınç derecesini öğrenmek için en iyisidir. çok Halokarbon petrol hayvanın trakea kapakları c) Eğer hayvan potansiyel olarak uzun süreli sağkalım ile ilgili sorunlar olabilir. Bu vakumun oluşturulması, görüntüleme sırasında optik için önemlidir ve bu çip içinde kurumaya karşı koyar: Yağ çipin çeşitli önemli rol oynar. Ancak aşırı yağ kaçınılmalıdır. (Bu ayrıca vakum ödün, boru ve şırınga içinde bir yağ yol açabilir). Yağ ile larva sadece ventral yüzü önerilen protokol mont, ardından rgörüntüleme için son lamel aktarmadan önce temiz bir lamel larva yerleştirme aşırı yağı emoves. d) fototoksisitenin görüntüleme oturumu deneyimli olabilir. Herhangi bir canlı görüntüleme uygulaması olduğu gibi, iyi bir derece hassas bir kamera veya dedektör kullanılarak elde edilir, düşük yoğunluklu lazer ışığı, kısa pozlama süreleri kullanmak için idealdir. Hg ışık kaynakları tarafından oluşturulan geniş spektrumlu ışık dahil, UV ışığı ile aydınlatma en aza indirmek için deneyin.

Diğer konular ve geleceğe yönelik:

Bu yöntem anestezikler kullanmak olmadığından, hayvanın kalbi atmaya devam ediyor. Bu diğerlerinden daha bazı yerlerde görüntüleme etkileyen bazı kaçınılmaz hareketlilik yaratır. Burada örnekler ventral sinir kablosu, segmental sinirler ve vücut duvarı kolayca kalp atışı müdahalesi olmaksızın görüntülü olabilir göstermektedir. Kalp görüntüleme etkiler durumda, normal hareketleri bazen ile düzeltilebiliranaliz yazılımı (örneğin, ImageJ için Görüntü Sabitleyici eklentisi). Tek tek nesneler (saat dakika) hızlı bir zaman ölçeği (hızlı aksonal taşıma örneğin ~ 1 mm / sn) ya da çok yavaş bir zaman ölçeğinde hareket olduğunda bu iyi çalışıyor. Ancak, nesne (ler) hızları ve yönleri bir dizi faiz hareket, bu kalp kaynaklı hareketler düzeltmek için zor olabilir.

Başka bir sorun, hayvandan hayvana ya da çip aynı hayvanın çoklu görüntüleme oturumları arasındaki optik olarak hafif bir değişkenlik. Derin ilgi konusu nesne hayvan içinde olan, daha fazla bu değişim olacaktır. Segmental sinirler ve ventral sinir kablosu çok derin düzenli bir mikroskop üzerinde görüntülü sonra hayvan içinde normal olarak. Ancak larva çip yaşanan hafif basınç çok yakın manikür ve lamel bu yapıları iter. Lamel bu yapıların kesin mesafe tr küçük varyasyonları olacakmahkemeye Ial. Nesneleri için bir varyasyonunun bu gibi duyu nöronlarının hücre gövdeleri olarak, kütikül yakın, daha azdır. Bu optik olarak değişkenlik hesaba hayvan ve bağımsız çalışmalarda çok sayıda kullanmak için, özellikle yoğunluk ölçümleri yapmak için, önemlidir.

Burada gösterilen örnek nöronlar içinde işlemleri üzerine odaklanmış olsa da, bu yaklaşım mikroskop amacın odaklama derinliğinde getirilebilir hayvanda herhangi bir yapı görüntüleme için uygun olmalıdır. Bu manikür, vücut duvarı kasları ve onların NMJs içerir. Hayvanın ventral tarafında nefes borusu ve potansiyel olarak sindirim sisteminin parçaları da görüntülenebilir olabilir. Hayvan da dorsal yüzeyine yakın yapıların kısa süreli görüntüleme için lamel yönelik sırt tarafı ile konumlandırılabilir. Derin hayvan içinde görüntü yapılara yeteneği kullanılan mikroskop amacın çalışma mesafesi ile sınırlıdır. Gibi im YapılarıVajina topu diskler yüksek büyütmede (örneğin 40X) amaçları için erişilemez.

Bu protokol açıklanan larva yongaları (3.5-4 mm arasında değişen büyüklüklerde) erken 3 instar aşamasında larvaları için tasarlanmıştır. Ancak birçok ilginç sorular farklı larva aşamasında görüntüleme gerektirir. Geç 3. Instars karşılamak için 2. larva evresindeki, ya da daha büyük cips karşılamak için küçük cips kolayca aynı prensibi kullanarak dizayn edilebilir. (Ek Şekil 1 değişmiş odası boyutları ile silikon kalıplar yapmak için kolayca değiştirilebilir DXF dosyasını içerir). Tersinir contanın basit prensip da C gibi diğer organizmalara uygulanabilir ana varyant odası boyutu olmak elegans veya zebra balığı. Bir yararlı gelecekteki yönü tarama amaçlı kullanmak için, aynı anda birçok hayvanların hareketsiz bir çip tasarlamaktır. Ancak, bunun için, tasarım önemli ölçüde farklı olması gerekirçip hayvan konumlandırma konuları bağımsız olarak her hayvan için ele alınması gereken mevcut cihazdan.

Larva periferik sinirlerde yaralanma yanıtları incelemek için sinir ezilme deneyi:

Larva segmental sinirler için burada açıklanan sinir ezilme tahlil Drosophila periferik akson bir yaralanma tanıtmak için basit bir yöntemdir. Bu yöntemin avantajları şunlardır: a) bir Drosophila laboratuvarında (stereomikroskopta CO 2 kaynak ve forseps) bulunan standart araçları ile yapmak basittir, b) yaralanma sonrası sinir tellerinin biyokimyasal analiz yapma, pek çok hayvan için hızlı bir şekilde yapılabilir 14 uygulanabilir, c) bu yaralanma için moleküler ve hücresel cevaplar 14,15,28 yüksek oranda tekrarlanabilir ve omurgalı nöron 29,30 de önemlidir işlemler keşfedilmesi için kullanılabilir.

Nöronların zarar için alternatif yöntemler focu etmektirsa yüksek güç lazer, örneğin lazer mikrocerrahi 17,31-33 üzerinden bir akson sever bir darbeli-UV veya femtosecond lazer. Larva çip gibi mikrocerrahi için hayvan konumlandırma için ideal bir yöntemdir. Ancak, yukarıda tartışılan çalışmalar arasındaki optik, minör farklılıklar, lazer tabanlı yöntem özellikle larva segmental sinirler, larva çoğaltmak için daha zor olabilir. Ayrıca, lazer bazlı aksonal yaralanma, her bir hayvan konumlandırmak için daha fazla zaman gerektirir, dolayısıyla hayvanlar (çok sayıda) ile büyük ölçüde yapmak çok daha zordur.

Sorun Giderme:

Sinir ezmek en sık karşılaşılan teknik sorun, iç organlara hasar ölümdür. Ezmek takibi yaparken, ventral sinir kablosu, tükürük bezleri, ya da bağırsakları çimdik için önemli değildir. Bu manikür delmek için değil de önemlidir. Bu sorunlar en manikür Surfac 45 ° açıyla forseps getirerek kaçınılıre (bkz. Şekil 3).

Forseps kalitesi sonradan ezmek ve hayatta kalma etkinliği üzerinde büyük bir etkisi vardır. Biz Dumostar numara 5 forseps öneririz. Onların keskinliğini korumak için, forseps, dikkatle diğer amaçlar için kullanılan değil, onlar künt ya da katlanmasını hale kez değiştirilmesi gerekir.

Hayvanın boyutu da ezmek etkinliğini etkileyebilir. Küçük hayvan (uzunluğu 3 mm'den az) çok daha az muhtemel yaralanma hayatta kalmak için vardır. Büyük hayvanlar ile, (3 rd Instars dolaşıp), bu sinirleri bulmak ve büyük tükürük bezleri ve bağırsakların zarar görmesini önlemek için daha zordur, ve pupa öncesi yaralanma yanıtları incelemek için daha az zaman vardır. Sinir ezilme en etkili erken 3. evre larvaları yapılır (ki ~ ön-arka eksen boyunca uzunluğu 3-4,5 mm).

Hayvan üzerine yükseltilmiş gıda kaynağı etkileyebilirezmek sonra manikür ve hayatta kalma gücü. Bu standart maya-glikoz tarifi yapılan gıda hayvanları yükseltmek için tavsiye edilir.

Etkili ezmek yapmak için öğrenmek için en iyi yöntem ilk birincil yaşam ulaşma hedefi (ve pupa devresi) ezmek sonra 24 saat ile, birçok hayvan üzerinde uygulama olduğunu. Yeni Başlayanlar normalde düşük bir hayatta kalma oranı (örneğin% 10) var, ama teknik öğrenilen bir kez, sağkalım oranları ~ 90% ulaşabilirsiniz.

Diğer konular ve geleceğe yönelik:

Ezilme tahlil yaralanma site ve akson ve yaralanma siteye uzak sinapsların dejenerasyonu akson proksimali filizlenmesini incelemek için güçlü bir yöntem sağlar. Dejenerasyon oranları farklı nöron türleri arasında farklılık olsa da, onlar yaralanma testin tekrarlanabilirliği için vasiyet sağlayan, belirli bir nöron tipi içinde son derece tekrarlanabilir.

Bunun tersine, 'rejeneratif' filizlenmeproksimal akson gözlenen yanıt çalışmasında daha zordur. Segmental sinirin tüm aksonlar (örneğin, Şekil 6 ve Şekil 3) yaralanma siteye yakın çimlenme geniş başlatabilir. Ancak filizlenme ölçüde nöron nöron değişir, ve ölçmek zordur edebilirsiniz. Küba'da benzer bir derecesi ve değişkenliği bir UV pulse-dye lazer kullanılarak tanıtılan segmental sinirler tek motonöronlann daha fokal lezyonlardan sonra görülebilir. Biz filizlenme nondiscriminate yön segmental sinirler rehberlik ipuçlarının yokluğu nedeniyle olduğunu yorumlamak. Buna karşılık, yakın hücre gövdeleri için lazer tarafından yaralı duyusal nöron akson kayıp akson 34 olarak aynı yönde yeni aksonal büyüme geçmesi. Hayvanın bu bölgede Aksonlar olasılıkla yenileyici akson rehberlik daha spesifik konumsal bilgi maruz kalmaktadır. Segmental sinirler içindeki ortamı çok resemblan olması olası değildiraslında embriyo onların rehberliği sırasında navigasyon aksonlar, dolayısıyla yenileyici aksonlar rehberlik bilgi sahibi olması beklenmektedir olmadığını çevreye ce.

Segmental sinir ezilme deneyi kullanılarak rejenerasyon eğitim için başka bir sınırlama yaralı duyusal ve motor nöron akson hala hayvan uğrar önce kendi hedefine ulaşmak için (0.25-1 mm) ve sınırlı bir zaman çerçevesi (<3 gün) kapsayacak şekilde önemli bir mesafe olması pupa devresi. Yeni yapılan bir çalışmada 3 instar larva aşamasında 35 süresini üçe prothoraciotropic hormon reseptörünün genetik manipülasyon tespit etti. Bu manipülasyon 9 yerine 3 gün, önemli ölçüde yaralanma sonrası nöronların kurtarma ve dejenerasyon eğitim için zaman çerçevesini genişletmek olacaktır. Bu yaralanma sinaptik biten yakın neden, özellikle böyle kendi postsinaptik hedefi ile bir yaralı akson yeniden bağlanma gibi yeni olaylar, gözlemlemek için yeterince uzun olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma (CAC BY R00MH080599, NC R21 NS062313 ve NS069844) Ulusal Bilim Vakfı (hibe sayısı CAC IOS-0842701) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Biz teknik destek için James Schutt, Emily Han ve Leni Truong kabul etmek istiyorum, ve sinek hatları için Bloomington Stok merkezi olacaktır. Tüm cips Michigan Üniversitesi'nde Lurie nanofabrication Tesisleri'nde imal edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 mm Polietilen boruFisher Scientific14-170-11BPolietilen boru, ID = 0,023 inç OD = 0,038 inç
1 mm Poliüretan boruFisher ScientificBB521-63Poliüretan boru, ID = 0,063 inç  OD = 0,125 inç
Dikenli - dikenli konektörBio Rad732-83000,8 mm dikenli - dikenli konektör
3 Musluk vanasıBio Rad732-8104Şırınga
Şırıngası için vidalı valf Şırınga (20 ml)Fisher Scientific14-817-33Vakum üreten 20 ml şırıngayı
vidalayın Dağıtım iğneleri, 23 G (0,4 mm İç Çap, 0,6 mm Dış Çap)McMaster-Carr75165A684Çıkış bağlantısı için iğne
Dağıtım iğneleri, 21 G, (0,6 mm İç Çap,  0,8 mm Dış Çap)McMaster-Carr75165A679Çıkış bağlantısı için iğne
Halokarbon yağıSigmaH8898Halokarbon yağı 700
Dumostar Numara 5 ForsepsRobozRS-498Sinir ezilme için
PDMS Kiti (Baz ve kürleme maddesi)Ellsworth184 SIL ELAST KİTİ 0.5KGDow Corning Sylgard 184 Silikon Kapsülleyici 0.5 kg Kit
Şeffaf Cam LamellerFisher Scientific12-544-C24 mm x 40 mm (mikroskop objektifinizin tavsiyesine göre kalınlık)
Tek Kullanımlık Plastik Bardak (9 oz)
Plastik kahve karıştırma çubuğu
Jiletli Üzüm
suyu agar plakalarıTarif için http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 sayfasına bakın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  2. Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
  3. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
  4. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
  5. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
  6. Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
  7. Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
  8. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).
  9. Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
  10. Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
  11. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  12. Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
  13. Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
  14. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  15. Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
  16. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  17. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  18. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  19. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
  20. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  21. Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
  22. Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
  23. Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
  24. Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
  25. Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
  26. Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
  27. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  28. Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
  29. Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
  30. Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
  31. Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
  32. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  33. O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  34. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
  35. Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroak kan ipVakumlu mmobilizasyonSinir Ezilme YaralanmasKonfokal MikroskopiKalsiyum G r nt lemeAksonal TransportFotokonverte Edilebilir ProteinlerWallerian Dejenerasyonu

İlgili makaleler