Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Tek ünite elektrofizyolojik kayıtlar kullanılmak üzere microwires organize dizileri implante teknik sorunlar bir dizi sunuyor. Bu teknik ve gerekli ekipman yerine getirilmesi için yöntemler tarif edilmiştir. Ayrıca, yüksek uzaysal seçicilik ile farklı nöral altbölgeler kayıt örgütlü mikrotel dizilerin faydalı kullanımı tartışılmıştır.

Abstract

Uyanık in vivo elektrofizyolojik kayıtları olarak davranmak hayvan tek hücre düzeyinde sinir sinyal anlamak için güçlü bir yöntem sağlar. Teknik deneyci devam eden davranış ile kaydedilen aksiyon potansiyelleri ilişkilendirmek için zamansal ve bölgesel spesifik ateş desenleri incelemek için olanak sağlar. Ayrıca, tek ünite kayıtları sinir işlevinin kapsamlı açıklamalar üretmek için diğer tekniklerin bir bolluk ile birleştirilebilir. Bu yazıda, Mikro implantasyon için anestezi ve hazırlanmasını tarif etmektedir. Daha sonra, biz gerekli ekipman ve doğru bir hedef yapısı içine bir mikrotel dizi eklemek için cerrahi adımlar numaralandırmak. Son olarak, kısaca dizideki her bir elektrot kayıt için kullanılan ekipman tanımlamak. Açıklanan sabit mikrotel diziler kronik emplantasyon için çok uygundur ve hemen hemen herhangi bir davranış preparatl nöral veri kayıtları uzunlamasına kılabilmektedirüzerinde. Biz mikrotel konumları yanı sıra kaydedilen sonuçların anatomik özgüllüğünü arttırmak amacıyla immunohistokimyasal teknikler ile mikrotel implantasyonu birleştirmek için yollar üçgen elektrot izlerinin tartışacağız.

Introduction

Elektrofizyolojik kayıtlar bilim adamları, biyolojik hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için izin verir. Elektriksel uyarılar bir sinyal mekanizması olarak hizmet merkezi sinir sistemi içinde, bu kayıtlar sinir fonksiyonu ^1-2 anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır. Hayvanlar davranıyor tek birim kayıtları sırasında, beynin içine yerleştirilen bir Mikroelektrot zamanla aksiyon potansiyelleri bir nöronun nesil değişiklikleri kayıt yapabiliyor.

Birçok teknik bir beyin aktivitesini kaydetmek için izin verirken, tek ünite elektrofizyoloji tek nöron düzeyinde çözünürlük sağlayarak en hassas yöntemlerden biridir. Mekansal yüksek bir spesifite derecesi isteniyorsa, microwires ayrık alt çekirdek ya da brain3 içinde hücre toplulukları hedeflemek için kullanılabilir. Kayıtları mikrosaniye düzeyinde doğru olarak tek birim kayıtları da yüksek temporal çözünürlük yarar. Ve, bir in vivowake kayıtları afferent ve efferent projeksiyonlar, sistemik kimyasal ve hormonal etkiler, ve fizyolojik parametrelerin doğal çevre ile bozulmamış devre etkileşimleri sağlar. Sinir sinyalleri duyusal girdi motor davranışları, bilişsel işleme, nörokimyasal / farmakoloji, ya da bazı kombinasyonundan türetilmiştir. Bu duruma göre, duyusal, motor, bilişsel ve kimyasal etkilere ve segregasyon belirtilen etkilerin her değerlendirilmesi için izin verebilir etkili yükümlülükler ve kontrolleri ile iyi tasarlanmış deneyler gerekli kılmaktadır. Sonuçta, hayvanlar davranıyor kayıtları denemecileri işleyen bir devre içinde birden çok bilgi kaynaklarının entegrasyonunu gözlemlemek ve devre fonksiyonu daha kapsamlı bir model elde etmek için izin verir.

Tek birimli kayıtlar aynı zamanda herhangi bir deneyi bilmelidir ki dezavantajları bir karşı karşıyadır. Birincisi ve en önemlisi, kayıtları yapmak zor olabilir. Gerçekten de, th özelliklerie headstage yükselticiler ve bu kayıtları mekansal ve zamansal özgüllük için izin implante microwires de gereksiz elektrik sinyalleri (yani elektrikli "gürültü") etkisiyle kayıtları duyarlı hale getirir. Buna göre, bir elektrofizyolojik sistemi sorunları giderme yeteneği elektrofizyolojik ilke ve aparatının iyi gelişmiş bir teknik anlayış gerektirir. Belli koşullar altında, hücre dışı kayıtlarında kaydedilen elektriksel sinyaller birden fazla nöral sinyallerin toplamını temsil edebilir, dikkat etmek de önemlidir. Ayrıca, bir hedef bölge içinde popülasyon aktivitesine tek birim aktivitesi genellenebilirlik genellikle, hedef bölge içinde hücresel heterojenlik derecesi ile sınırlı (fakat Cardin ⁴⁾ olabilir. Örneğin, elektrot diğer hücrelerin yerine yüksek genlikte bir çıkış nöronlar kayıt karşı önyargılı olabilir. Tek ünite kayıtların klanmas artardahil olmak üzere, diğer teknikler ile kombine kayıtları, ancak bunlarla sınırlı değildir göre, elektrik (veya ortodromik antidromic), kimyasal (örneğin, iyontoforetik veya tasarımcı reseptör) veya stimülasyon optogenetic ^4, geçici sinir inactivations, sensorimotor incelemeleri ^5, kesme işlemleri, ³ ya da immünohistokimya.

(Protokol diğer türlerde kullanılmak üzere uyarlanabilir de) sıçanda organize bir mikrotel dizi implant edilmesi için gerekli olan malzeme ve adımlar numaralandırma aşağıdaki protokolde. Laboratuvarımızda kullanılan sabit diziler prosedür ve stil boyuna kayıtları için güvenilir kanıtlamış ve bir aylık süre ^6-8 aşkın süredir aynı nöron kayıtları devam edebilir. Bu deneysel uyaranlara, sinirsel tepkiler plastik değişiklikler, ya da öğrenme ve motivasyon mekanizmaları fazik yanıtları incelemek için bu prosedür idealdir.

Protocol

Için hazırlanması ve aşağıdaki prosedürü yürütürken (9 Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklandığı gibi) son derece dikkatli aseptik koşullarda korumak için alınmalıdır. Aşağıdaki protokol Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile uyumlu olduğunu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, Rutgers Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Bu, daha sonraki işlemleri tamamlamak için 3-6 saat gerektirir tahmin edilmektedir. Mikro Array implante: Yer anestezisi uygulanmış hayvanlar 50 mg / kg sodyum pentobarbital (ip) kullanılarak ve atropin metil nitrat, 10 mg / kg yönetmek (IP; Glikopirolat ikame edilebilir) ve 0.25 mg penisilin (300.000 U / ml im) solunum fonksiyonu korumak ve enfeksiyonu önlemek için sırasıyla. Not: Bu maliyet-etkin ve insan maruziyetini sınırlar, çünkü bu implantasyon cerrahisi 3-6 saat uzunluğu ile, sodyum pentobarbital kullanılıranestetikler (gaz anestezik uzun süreli kullanımı ile ortaya çıkabilecek gibi) yine uzun süreli anestezi sağlarken. Diğer anestezik yer değiştirmesi kabul edilebilir. Anestezi geçmeden önce kuyruk tutam testi kullanılarak etkisi almıştır doğrulayın. Gerekli olduğu gibi, ameliyat boyunca anesteziyi muhafaza etmek üzere ketamin hidroklorür (60 mg / kg IP) ve sodyum pentobarbital (5-10 mg / kg IP) enjeksiyon alternatif verir. Bir # 22 neşter bıçak kullanarak kafa derisi tıraş. Povidon iyot ile traş kafa derisi dezenfekte edin. Bupivakain deri altına enjeksiyon vermek (~ 4 enjeksiyon siteleri üzerinden 1 mg / kg SC spread) lokal olarak saç derisini uyutmak. Etkili olması için lokal anestezik için 5-10 dakika bekleyin. Anestezi sırasında nemi korumak için gözleri üzerinde bir göz yağlayıcı yerleştirin. Kulak çubukları ve bir stereotaksik tertibatının burun kelepçe içine hayvan edin. Ster görsel işaretlerini kullanın (örneğin, yatay bir çubukyaklaşık hayvanın kafasını seviyeye eotaxic kare). Bu adım sadece yaklaşık seviyeye kafatası içindir. Bir neşter tutucuya monte # 11 neşter bıçak kullanarak kafa derisi orta hat boyunca bir kesi yapmak. Kesi burun kemiğinin arka kısmına sadece kulakların arkasından genişletmek gerekir. Lateral kafa sırtlar ve posterior kafatası sırt hem ulaşıncaya kadar bir diseksiyon spatula kullanarak, kalan tüm doku kafatası temizleyin. Hemostatlarla bir dizi (6x) kullanarak kesi etrafındaki deriyi geri çekin. Herhangi bir kan kafatası temizleyin ve kurutun. Kalan kanama oluşursa, küçük bir dağlama aracı ile artık kanamayı sonlandırmak. Kafatası temiz ve kuru kalmasını sağlamak sonraki aşamalarda kullanılan dental akrilik sürekli kafatası bağlamak sağlar. Mark Bregma ve kafatası sütür kesişim interpolating lambda (Şekil 2B). A diseksiyon mikrofonroscope doğru bu konumları işaretlemek için gereklidir. Stereotaksik kol küçük sivri kalem (örneğin bir pim ya da diş matkap ucu) takın ve dorsal / ventral (DV) belirlemek için alt bregmaya ve lambda koordinatı. DV birbirinden 100 um (0.1 mm) içindedir bregma ve lambda için koordinatları kadar burun kelepçe ayarlayın. Bir kez tesviye, anterior / posterior (AP) kayıt lateral / medial (ML) ve DV burun kelepçe konumu ile birlikte bregmaya koordinatları. Cerrahi kalan bu koordinatların duyarlığına bağlıdır gibi, doğruluk için koordinatları kontrol çift. ML ve AP bregmaya "kafatası pencere" göreli (; Şekil 1 yani kraniotomi) dört köşe koordinatları hesaplamak için ölçülen koordinatları kullanın. Kafatası penceresi mikrotel dizi geçeceği kesin olarak konumlandırılmış dikdörtgen. Işaretlemek için hesaplanan koordinatları kullanınkafatası pencere sivri stereotaksik eki ve dolma kalem mürekkep kullanılarak kafatası koordinatları. Kesin işaretleri elde etmek için, pamuklu bir aplikatör ile işaretleme aracının ucuna kadar mürekkep sadece küçük bir miktar uygulanır. Küçük tabakaların bir dizi kemik kaldırılarak kafatası pencereden dışarı delin. Işaretleri yerleştirilmiş pencerenin işaretli köşeleri sondaj başlayın. Sonraki, köşeleri bağlamak ve pencere anahat. Son olarak, açık dura mater derinliğe kadar anahat içinde alanı dışında. Delik pencere yukarıdan aşağıya doğru uygun bir genişlik muhafaza sağlamak için kafatası yüzeysel katlarının altında (yani açılı) daha geniş olması gerekir. Dikkatli kafatası penceresinin içinde kalan kemik cips, enkaz veya dura mater kaldırmak için microforceps kullanın. Bu malzeme bit indirme sırasında dizisinin bütünlüğünü tehlikeye olarak bu aşama, son derece önemlidir. Bir kez temizlendi, bir th tutmalısınızAmeliyattan geri kalanı için bakteriyostatik tuzlu su ile nemli e pencere. 5 kafatası vida ve 1 zemin tel kafatası (Şekil 1) işaretlerini yerleştirin. Bu pozisyonlar, hedeflenen beyin bölgesi bağlı olarak değişecektir. Bir vida 5 kafatası kemiği her yer ise headstage en güvenli olacaktır. Mikrotel dizi yerleştirme ile engel olmaz yerlerde kafatası vidaları ve topraklama kablosunu hem yerleştirin. Kafatası vidalar için delikler delin ve yerinde vidaları ile sabitleyin. Vidalar sadece 3-4 ipler (korteksi zarar değil çok derin şekilde veya tavsiye edilenden başka vidaları kullanarak, eğer yeterince derin dizi istikrarı teşvik etmek kafatası kalınlığı kastetmek için ama) gösteren kadar indirilmesi gerekir. Yerleştirildikten sonra vidaların dişlerini temizleyin. Topraklama teli için bir delik delin. Hedef DV koordine ve diş akrilik kullanarak yerine tel düzeltmek için (1-2 dakika boyunca) yavaş yavaş tel indirin. Konuları etrafında akrilik eklekafatası vidalar. Akrilik kurumadan önce, uzak topraklama kablosu veya kafatası vida akar herhangi bir aşırı çimento kaldırın. / Sertleşmesine kurumaya diş akrilik için 15 dakika bekleyin. Stereotaksik koluna dizi takın. Dizi seviye ve dürüstçe kafatası penceresinin sınırları geçecek, böylece onu yönlendirin. Bu kafatası ile aynı seviyede olacak şekilde kafatası penceresinde tuzlu su koyun. Bu tuzlu su içinde bir çukur oluşturur kadar bir dizi aşağı indirin. Bu koordinat dizisi için kafatası seviyesi olarak da kullanılır. Nihai DV dizinin koordine hesaplamak için bu değeri kullanın. Onun nihai DV koordinat ulaşıncaya kadar yavaş yavaş dizi indirin. Düşürücü her 1 mm durdurun ve beyin dokusu (PEG düşürürken, geçici olarak bir şekle sahip olan teller tutmak için kullanılır dimpling kurtarmak ve dizisinde, polietilen glikol (PEG) alt kısmını çözmek için izin vermek amacıyla bir kaç dakika bekleyin ve benzeri) tuzlu su içinde yavaş yavaş çözülür. Dizi 1 mm olduğunda,Nihai hedef ulaşana kadar uzak hedeften daha yavaş indirin. Doku 5 dakikalık bir süre boyunca dinlenmeye izin vermeden önce bir anda 0,1-0,2 mm düşürülmesi hedef bölgede hem de yakın sinaptik bağlantıların da dokuyu korumak için tasarlanmıştır. Ekipman mevcut ise, dizinin düşürücü hassas motorlu bir manipülatör kullanılarak desteklenebilir. Kalan PEG çözülür ve yerine microwires çimento diş akrilik kullanın. Teller güvenli olmasını sağlamak ve daha sonra devam etmeden önce sertleşmesine çimento için 15-20 dk izin çimento çoklu katmanlar ekleyin. Bu teller, son yerleştirme jostled olmayacak sağlar. Diş akrilik kullanarak hayvanın headstage kalan oluşturun. Microwires için kafatası vidaları, topraklama kablosu ve konektörü örtmek için akrilik kullanın. Akrilik şapka geçmeden önce yeterince sertleşmesini bekleyiniz. Emilebilir sütürler kullanarak saçlı deri kesi dikin ve yönetmek 2 ml of ameliyat hidrasyon geri bakteriyostatik tuz (sc). Kulak çubukları hayvan çıkarın ve temiz bir alanda konuyu yerleştirin. Termoregülasyon ve hareket iyileşene kadar ameliyat sonrası iyileşme sırasında sık sık hayvan gözlemlemek. Anestezinin etkisinden kurtulana kadar sonra, ameliyat sonrası iyileşme kalan tek hayvan yuva içine hareket eder. Hayvanlar günlük postoperatif izleme vermek ve prosedürü izleyerek günlerde önemsiyorum. Yedi ya da daha fazla gün izin verildiğinde bu prosedüre Kurtarma uygunudur. Hayvanlara Carprofen (5mg/kg) ve Enrofloxacin katılan veteriner hekim tarafından önerilen program başına kurtarma sırasında (5-10 mg / kg) veya eşdeğer enjeksiyonu verin.

Representative Results

Elektrofizyolojik sinyaller kayıt için bu laboratuvar tarafından kullanılan Ekipman listesi Tablo 3'te bulunabilir. Cerrahi işlemden sonra, tek üniteler implante konektörüne bir birlik-kazanç headstage takarak kaydedilir. Bu headstage elektrikli kayma halkaları kullanımı yoluyla elektrofizyolojik kayıt tatili olmadan ücretsiz dönme yeteneğine sahip bir komütatör, bir kablo ile bağlanır. Komütatör bu hazırlık ilkesinin avantajlarından biridir davranışı sırasında kayıt s…

Discussion

Ekstrasellüler kayıtları Nörobilimdeki neredeyse her deneysel hazırlık dahil edilebilir güçlü bir deney tekniği temsil eder. Kendi milleri (Şekil 5A) beyin aracılığıyla ve hedef bölgeye geçmek gibi organize dizilerde implante edilmiş teller izlenebilir. Küçük, post-deneysel lezyon paslanmaz çelik telden küçük bir demir depozito oluşturmak için noninsulated mikrotel ucunda oluşturulduğunda, biri tam bir çözüm kullanarak (tek ünite kaydedildi) yalıtılmamış mikrotel ucu…

Materials

<strong>Table 1. List of Surgical Materials.</strong>
Gauze	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Cotton Swabs	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropine Methyl Nitrate	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacin)	Butler Shein (Bayer)	1040007
Ketamine Hydrochloride	Butler Shein	SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Model 900
Cauterizing Tool	Stoelting	59017
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ445
Dental Drill	Buffalo	37800
Bacteriostatic Saline	Bulter Schein	8973
Jewlers Screws	Stoelting	51457
Microwire Array	Microprobes	Custom (Flexible)
Ground Wire	Omnetics	Custom Plug
Dental Acrylic	Fisher (BAS)	50-854-402
Absorbable Sutures	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant)	Fisher (Henry Schein)	008897
<strong>Table 2. List of Surgical Instruments.</strong>
2x Microforceps	George Tiemann Co.	#160-57	Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps	George Tiemann Co.	#160-93	Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats	George Tiemann Co.	#105-1125	Clamp and open incision
1x Small scissors	George Tiemann Co.	#105-411	Cut sutures after tying
1x Tissue forceps	George Tiemann Co.	#105-222	Holding tissue while suturing
1x Needle holder	George Tiemann Co.	#105-1259	Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade)	George Tiemann Co.	#105-80 (w/ #105-71 blade)	Making skull incision
1x #22 Scalpel blade	George Tiemann Co.	#160-381	Shaving scalp
1x Surgical Spatula	George Tiemann Co.	#160-718	Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws	Various	N/A	0/80 x 1/8&rdquo;
<strong>Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.</strong>
Microwire Array &amp; Connector	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Part No. based on array characteristics)	Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, <em>etc</em>.
Unity-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card&nbsp;	Data Translation (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card	Measurement Computing (Norton, MA)	PCI CTR-05	Acquires behavioral inputs and outputs