Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Meme kanseri dünyada ^1,2 ve kansere bağlı ölümlerin ² ikinci önde gelen nedeni genelinde kadınlarda en sık görülen kanseridir. Kompleks genetik ^{3,4, 5} histolojik ve klinik fenotipleri ⁶ meme kanseri, çeşitli alt tipleri karakterize etmek için kullanılır ve genellikle hayatta kalma tahmin etmek için bir araç olarak kullanılır. Meme kanseri olan kadınların büyük bir kohort analizi ölen hastaların (yaklaşık% 80) en çok primer tümörün ⁷ 10 yıl sonrası çıkarıldıktan içinde nüks ettiğini belirtti. Invaziv meme karsinomlarının bir çoğunluğu için, Lenfovasküler güçlü bir kötü sonuç ve hastalığın ⁸ daha agresif klinik seyri korelasyon olduğu gösterilmiştir.

Çünkü meme kanserinin genetik ve fenotipik karmaşıklık, hastalığın bütün seyrini özetlediği bir hayvan modeli yoktur. İnsan göğüs tümörü hücre çizgileri sık olmuşturksenograft ya da bağışıklık eksikliği olan farelerde invaziv ve metastatik meme kanseri ortotopik ⁹ model olarak kullanılmıştır. Her ne kadar bu detaylı bir çapraz tür aşı olduğu için, bu modeller, tüm tümör mikro etkilerini bozar, bağışıklık baskısı yokluğunda meydana gelir ve. Bu tür kemirgen meme tümörü virüsü (MMTV) ve kesilmiş süt suyu asidik protein (WAP) gibi meme özel promotörler ile tahrik indüklenebilir genetik mutasyonlar göğüs kanserinin genetik yapısı hakkında bilgi muazzam bir katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu promotörlerin dokuya özgü sentezleme tipik insan göğüs kanserinde aşırı ifade onkogenlerin ekspresyonunu ayna yok kaynaklı genetik mutasyon değişken ekspresyonu ile sonuçlanan, endokrin sistem ^10-16 için kendi yanıt tarafından tehlikeye girer. Onkogenlerin MMTV tahrik ifade endokrin kontrol üstesinden gelmek için, Moody ve ark. Memede Neu aşırı ifade eden bir koşullu, doksisiklin uyarılabilir modeli oluşturdukepitel ^17. Bu model regresyon ve nüks çalışma Tümör oluşumundan sonra Neu deinducing için yararlıdır, ancak tutarlı, uzun vadeli onkogen ifade için sürekli doksisiklin uygulanmasını gerektirir. Mevcut çok sayıda alakalı göğüs tümör modellerinin ayrıntılı bir tartışması Vargo-Gogola et al. ¹⁰ ile inceleme bulunabilir

Amacımız, tam bir C57BL / 6 arka plan üzerinde izlenebilir, meme kanseri, bir fare modeli geliştirmek için olduğu, mutasyon olayları, modeller bağışıklık basınç mevcudiyetinde bir olgunlaşmamış tümör oluşumu kalıcı indüksiyonundan sonra. Bu TP53 of floxed alelleri ve K-ras bir onkojenik biçimi ve YFP içeren transjenik farelerin meme kanallarına Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs getirmiştir. Cre ifade TP53, bir çok meme kanserlerinde ^18'de sık mutasyona uğramış gen ablates ve spesifik olarak YFP ifade ek olarak K-ras bir onkojenik allel indüklermeme duktal epitelyum içinde. K-ras mutasyonu, meme kanseri hastalarının ^19,20 sadece% 6.5 'de meydana gelen, meme kanseri sık olmasına rağmen, insan meme tümörleri içinde Ras sinyal yolağının konstitütif aktivasyonu Her2/neu ve EGFR sonucunda yukarı kinazların aşın ^21-23. Birçok meme tümör hücre hatlarında Ras sinyal yolunun aktivasyonu, aynı zamanda ^24,25 bildirilmiştir. Tümör oluşumu başlangıcı ve cinsel olarak olgun, bakire dişi farelere Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs intraduktal enjeksiyon tekniği anlatacağız. Meme kanseri Bu model, 7-8 hafta koltuk altı lenf düğümü Lenfovasküler invazyon ve metastaz ile yavaş tümör progresyonunun yaklaşık 8 hafta sonra katlanarak büyümeye açık lezyon gelişir. Bu fareler tam bir C57BL / 6 arka plan üzerinde ve YFP ifade tümör hücrelerinin uzak lenf düğümlerinde izlenebilir, çünkü bu model ce incelemek için ilgili bir araç sağlarllular ve immünolojik gizli metastaz mekanizmaları ve metastatik duktal meme kanserinin tedavisi için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için yardımcı olacaktır.

Tüm hayvan deneyleri Wistar Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1.. Transgenik Farelerin Üretimi ve Bakım

1. C57BL / 6 fareleri, en az 10 nesil geri çaprazlanması ile tam bir C57BL / 6 arka plan ²⁸ LSL-K-ras ve ^{tm4Tyj 26} (karma bir arka plan üzerinde insan kanser konsorsiyum NCI fare modellerinde de elde edilmiş) ²⁷ Trp53 ^tm1Brn Breed. Izlemek için tümör metastazı, cins B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor ^{tm1 (EYFP)} (tam bir C57BL / 6 arka plan üzerine Jackson Laboratuvarı elde LSL-EYFP) ^Cos / J çift transgenik LSL-K-ras ^G12D ile ^/ p53 ^{+ loxP / loxP} farenin.
   Not: Transgenik LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} farenin, onkojenik K-ras ve endojen p53 lokusunun bir transkripsiyonel susturulması alel yan loxP sitelerine sahip Cre aracılı eksizyon, bir K-ras onkojen aşırı ekspresyonu üzerine, böylece mutant ve p53 ablasyon achi olaneved.
   Not: LSL-EYFP fare YFP durdurma kaseti, kesilerek çıkarılacak olan dokularda YFP ekspresyonunda Cre aracılı eksizyon sonuçları üzerine geliştirilmiş bir sarı floresan proteini (YFP) bunun için bir gen kuşatan bir durdurma kodonu içerir.
   1. LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} fareleri veya LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP /} intraduktal enjeksiyonlar için ^loxP LSL-EYFP fareler elde edilmesi için transgenik fareler Breed.
      Not: K-ras bir homozigot delesyonu ile farenin rahimde kalıp LSL-K-ras ^{G12D / +} için Fare p53 ^{loxP / loxP} için heterozigot ve homozigot olarak yetiştirilmektedir. Intraduktal enjeksiyonlar için en az altı-haftalık naif bakire kadın kullanın.
      Not: genotipleme homozigot için primerler olan p53 alel floxed p53 - T010-FWD (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') ve p53-T011-REV (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). Onlar 391 bp vahşi bir tip allel üretmek ve p53 461 bp ^29,30 de alel floxed.
      Not: K-ras 'ın mutant formu tespit etmek için primerler oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3') ve oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3 ')' dir. Onlar 600bp tespit mutant bandı üretmek.
      Not: YFP raportör üç transjenik fareleri için, primer ('(5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3, yabani tip aleli) (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3') ROSA kaseti tespit ve ortak bir alel için 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') floxed alel ve yabani tip aleli için 600 bp 320 bp bantların amplifikasyonu ile sonuçlanır.

2. Cerrahi Hazırlık

1. % 75 EtOH ile ve tüm enjeksiyonlar önce ve sonra bunları otoklavlamayın temiz cerrahi malzemeler.
2. Bir hayvan tesis içinde bir dezenfekte odada temiz derli toplu laboratuar bankta ameliyat. % 75 EtOH ardından geniş spektrumlu dezenfektan solüsyon ile cerrahi mikroskop aşamasında ve aramalar dahil tüm yüzeyleri silin.
3. Tartılır ve steril tuzlu su içinde ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) bir karışımı intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi.
4. Onlar anestezi altında devam ederken yavaşça 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden kendi kafeslerine geri fareler yerleştirin. Bu süre zarfında virüs çökeltiler oluşturur (Protokolü 3).
5. Ayak sıkıştığı Ağrı ile yanıt eksikliği doğrulayın. Yavaşça aşırı kornea kurumasını önlemek için veteriner merhemi ile anestezi farelerin gözlerinizi kapayın.
6. Onlar kurtarmak için başlayana kadar, hipotermi önlemek cerrahi işlem sırasında düşük ısı ayarlanmış bir ısıtma pedi üzerine anestezi fareler yerleştirmek ve.
7. Ağrının tedavisi için, fareler, ameliyattan 24 saat sonra ve önce 1 mg / kg 'da deri altına meloksikam yönetmek.

3. Virüs Kristallerin Üretimi

DİKKAT: Adenovirüs vektörleri, onlar değiştirilebilir ve çoğaltmak mümkün değildir olmasına rağmen, bir risk teşkilenfeksiyon. Dikkatli adenovirüs taşıyınız. Bütün personel uygun BSL2 kurallarına uygun olarak adenovirüs atmayın, intraduktal enjeksiyonundan sonra BSL2 maddeleri işlemek için kurumun kurallarına göre eğitilmelidir.

1. Mağaza adenovirüs 3 mi adenovirüs partiküllerinin pfu ^{7 ila} 10 x 2.5 ile 16 hayvanlara enjekte etmek için yeterli bir 4 x 10 ⁸ pfu her biri, alikolar içinde dondurulmuş -80 ° C'de virüs stokları konsantre edildi.
2. Enjeksiyonlar başlamadan önce yaklaşık 15-20 dk kadar kuru buz üzerinde adenovirüs alikotları saklayın.
   Not: tekrarlanan donma çözülme döngüleri kaçının, virüs titresi her döngüsü arasında önemli ölçüde düşer gibi.
   Not: Adenovirüs çökeltiler, bir protokol değiştirerek oluşturulan, daha önce tarif edilen ^31.
3. Steril moleküler sınıf 50 ml su, 4 ° C'de steril koşullar ve mağaza içinde sodyum bikarbonat ve filtre 244 mg takviyesi ile MEM tozun 504 mg sulandırın
   <li> 4 ° C'de steril koşullar ve mağaza moleküler dereceli su ve filtre 50 ml kadar kalsiyum klorür ve 1.5 g eklenmesi ile kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın
   1. 10 ml 'lik bir son hacim için, steril su içinde yeterli bir% 3 sükroz ile 4 x 10 ⁸ pfu adenovirüs-Cre içeren alikotları karıştırın. Virüse MEM içinde 34 ml ilave edilir ve hafifçe karıştırın. Daha sonra, _CaCl2 çözeltisi 4 ml yavaşça karıştırın ve 15-20 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. Mağaza çökeltiler oluşturmak için hazır olana kadar kuru buz üzerinde adenovirüs. Çökeltiler meydana sürece, adenovirüsün çözülme ve uzun süreler boyunca buz ya da oda sıcaklığının üzerinde muhafaza kaçının.
      Not: Bu, hemen -80 ° çıkarıldıktan sonra çökelir bu adenovirüs kısım Çözülme ve yapmaya başlamak mümkün değilse önce ameliyatları için sukroz, MEM ve CaCl ₂ karıştırmak da mümkündür Sakaroz, MEM, ve kalsiyum bu kısım adenovirüs eklemek için hazır olana kadar kuru buz üzerinde kaydedilebilir.
      Not: Virüs partikülleri yaklaşık olarak 1 saat boyunca stabildir.
   3. , Her bir enjeksiyondan önce hafifçe emin virüs parçacıkları karıştırılır yapmak için tüp hafifçe vurun. 10 ml şırınganın içine virüs parçacıklarının 3 ml (2.5 x 10 ⁷ pfu) yukarı çekmek ve intraduktal enjeksiyon için fare hazırlamak.

4. Virüs Parçacıkların Intradüktal Enjeksiyon

1. Yavaşça temiz bir diseksiyon mikroskop ışıklı sahneye sırtında fare yerleştirin. Ekstra bir ışık kaynağı ile karın tarafı aydınlatmak ve her meme çevreleyen (C57BL / 6 kadın üzerinde görünür) kürk küçük beyaz yamalar ile sol 4 ^inci veya sağ 9 ^inci inguinal meme bezi bulun.
2. Steril bir etanol batırılmış pamuk ile hafifçe ovmak meme uzak meme saç temizlemek için ve enjeksiyon yerinde sterilize etmek uçlu bir aplikatör. Onlar bulmak zor ise, hafifçe meme ortaya çıkarmak için tüy dökücü krem ​​veya kullanım makaslar kalın bir tabaka uygulayın. Meme kapsayan keratin fişi, yoğun ölü deri hücrelerinin bir tabakasını kaldırmak. Meme maruz sonra, keratin fiş diseksiyon mikroskop altında kolayca görünür olmalıdır.
3. Ince cerrahi forseps ile meme güvenli ve keratin fişi kaldırmak için ışık güçle yukarı çekin.
4. Forseps arasında meme stabilize.
5. Yavaşça 90 ° kanal kanal cannulating, forseps arasındaki iğne takın. Meme dokusu yoluyla ve ventral vücut boşluğunun seröz zarlar içine nüfuz etmesini önlemek için hafifçe iğnenin (en fazla 2 mm) arasında konik geçen meme girin.
   1. Çok derin iğne takmayın. Enjeksiyon uygun derinlik sağlamak için, yavaşça yukarı çekilir gibi iğne kenarları boyunca meme yukarı çekme, kanal lümenine taktıktan sonra iğne yukarı çekin.
      Not: enjeksiyon görüntülenmesi zordur, bu nedenle PratikBu aşama için e tripan mavisi kullanarak önerilir.
6. Iğne uygun meme kanalı içine yerleştirildiğinde, yavaşça şırınga tutan elin başparmağı ile şırınga saplayarak (adenovirüs-Kretasedekine 2.5 x 10 ⁷ pfu) virüs çökeltilerin 3 ml bırakın. Sıvı ilave edilmektedir Emzik hafifçe şişirmek gerekir.

5. Farelerin Recovery

1. Bu anestezi kurtarmak için başlayana kadar enjeksiyondan sonra ısıtma pedi üzerine geri fare yerleştirin.
2. Fare kurtarıldıktan sonra, temiz bir kafes içine geri yerleştirin ve tam iyileşme ve hareket için monitör.
3. 24 saat intraduktal enjeksiyondan sonra, deri altına 1 mg / kg 'da meloksikam yönetmek.

6. İzleme Tümör İlerlemesi

1. Genişleme ve şişlik için günde 30 enjekte meme bezi palpe ediniz.
   1. Tümör gelişimini izlemek bir kez şişmiş ve genişlemiş meme Glan her 5-7 günd görülmektedir.
2. Palpe tümörler (yaklaşık 50-60 gün sonrası adenoviral enjeksiyon) görünür bir tümör büyüme kinetiği için her 3-4 gün tümör hacimlerini ölçmek.
3. Tümör hacimleri, farelerin vücut ağırlığının% 10'unu zaman fareler Euthanize.

Memesel duktal ağacın başarılı hedefleme önce tripan mavisi (uygun enjeksiyon tekniği (Şekil 1A) veya (uygun hazırlama ve viral enfeksiyonu kontrol etmek için mCherry sentezleyen bir adenovirüs doğrulamak için enjeksiyonundan sonra 32 tarif edildiği gibi, meme bezinin tüm bağlar hazırlanması ile görselleştirilebilir duktal epitelyum hücrelerinin, Şekil 1 B).

Şekil 1.. Trypan mavi veya adenovirüs-mCherry. A) enjeksiyonu ile meme bezlerinin Intradüktal hedeflenmesi bir bütün montaj, tripan mavi 3 saat sonrası enjeksiyon hazırlandı ile daha önce meme bezi 4. enjeksiyonundan sonra meme bezinin 32, rapor gibi görselleştirmek / onayla tüm duktal hedeflemeağaç. Görüntüler mCherry ifade adenovirüs 2.5 x 10 7 pfu enjekte edilerek adenovirüs ile duktal epitel 4X büyütme. B) Enfeksiyon vardır. Fareler intraduktal enjekte edildi ve 4 gün sonra enjeksiyon, meme bezinin bir bütün montaj duktal ağacın viral enfeksiyon teyit etmek için hazırlanmıştır. Görüntü 4X büyütme. MG LD süt veren, ya da ana kanal, ve TD terminali kanal olduğunu, meme bezi olduğunu. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Tümörler p53 loxP indüklenen zaman / loxP LSL-K-ras G12D / + transgenik fareler, tümör meme bezleri, genişlemiş ve şişmiş olacak yaklaşık 40 gün kadar belirgin olmaz. Bu gözlenmektedir zaman her 5-7 gün tümör büyümesini izleme, palpations başlamak gereklidir. Elimizde olanlar, meme bezinin sertleşme zaman tümör gelişme başlangıcı öncesinde. Tümörler, ek bir 2 hafta boyunca yavaş yavaş ilerleme olacaktır. Günde 56 civarında başlayarak, tümörler (Şekil 2B) katlanarak büyümeye başlayacak. Bu noktada (Şekil 2A ve 3A) normal tümör ilerlemesi, fare değişkenliğe hafif fare olacak, çünkü kinetik çalışmalar, arzu edilir ise, her 3 günde tümör hacimleri ölçmek için çok önemlidir. Büyük abdominal kitleler tümörler vücut ağırlığının% 10'dan fazla aşıyorsa, farenin ötenazi gereken sonra (Şekil 2A, 2B ve 3A) gün 80 tarafından anlaşılacaktır. bir tümör taşıyan fareden üç klon cDNA analizi, mezotelin ekspresyonunu ortaya, sitokeratin-8, Her2/neu, östrojen reseptörü ve-α (Şekil 2C).

P53 loxP in> Şekil 2,. Tümör gelişimi / loxP LSL-K-ras G12D / + fareler 80 gün Cre sentezleyen adenovirüs ile enjekte edildikten sonra tümörlerin adenovirüs-Cre. A) iki örnekle intraduktal enjekte edilir. Fareler / Cre ifade adenovirüs 2.5 x 10 7 PFU verildi ve 80 gün sonrası tümör-inisiyasyon, geniş kitleler palpe hayvan. B) Tipik tümör kinetik ve p53 LoxP uyarılan tümörler için palpasyon çizelgesi karın tarafında çıkıntılı görüntülendi olabilir loxP LSL-K-ras G12D / + fareler. C) bir p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + fare aynı homojenize tümöründen türetilen üç tümör hücre klonlarının karakterizasyonu. RNA ekstre edildi ve RT-PCR analizi için sentezlenmiş cDNA, mezotelin, sitokeratin-8, Her2/neu, progesteron reseptörü, estrojen reseptörü-α ve β östrojen reseptörü-β-aktin için spesifik primerler kullanılarak edildi.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Insan göğüs kanserinde hücresel mikro benzer şekilde, biz αβ ve γδ T hücrelerin infiltrasyonunu hem de tümörlere myeloid türevi bastırıcı hücreler ve makrofajlar (Şekil 4) gözlemledik. Aksiller lenf nodu için drenaj damarsal tümörler enjeksiyonu yapıldı, tüm meme dokusu (Şekil 3A) kapsayacak şekilde büyüdü önce yutmak başlayacak. Tümör hücrelerinin Lenfovasküler ve metastaz LSL-EYFP fareler ile LSL-K-ras G12D / + p53 loxp / loxp fareler geçerek izlenebilir. Cre aracılı eksizyon sonra YFP (yüksek ve düşük) ifade eden hücreler, tümörde tespit edilir ve drenaj lenf bezlerine (Şekil 3B) metastaz takip edilebilir. Distal aksiller lenf nodu metastazı teyit edildibaşarılı bir şekilde tümör-taşıyan LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP fare (veriler gösterilmemiştir), bu siteden bir tümör hücre çizgisi kültürlenmesiyle.

Koltuk altı lenf düğümü tümörü ve latent metastaz Şekil 3.. Birleşimi. Tümör progresyonu farklı oranlarda üç gelişmiş göğüs tümörlerinin A) Örnek. Sonunda ok, form ve ile gösterilen bir katı madde kütlesi, bütün abdominal meme dokusu boyutuna büyür. Tümör meme dokusu ile sınırlı kalır ve istila veya periton boşluğu kapsayan kas takmak için gözlenmez. Beyaz ok uçları ile gösterilen inguinal ve aksiller lenf düğümleri arasındaki yüzeysel epigastrik ven belirgin dolgunluğu var. 7-8 hafta sonra, the koltuk altı lenf nodu nedeniyle YFP pozitif tümör hücrelerinin metastaz akış sitometrisi ile koltuk altı lenf düğümünde görselleştirilebilir ok. ve B ile belirtilen tümör hücrelerinin lenfovasküler invazyon) için genişlemiş olmaya başlar. LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP farenin adenovirüs-Cre intraduktal teslimi ile tümörler ve YFP aktivasyonunu uyarmak için kullanıldı. Koltuk altı lenf düğümü, 80 gün sonra adenoviral enjeksiyon halinde tümör hücrelerinin istilasını Lenfovasküler doğrulamak için, belirtilen lenf düğümleri ve organların hasat edildi ve lenfosit işaretçileri için boyanmış ve YFP ifadesi için incelendi. CL lenf nodu drenajı kontralateral nontumor temsil eder. Sonuçlar, tümör hücrelerinin uzak koltuk altı lenf bezine akın eden olduğunu belirten, CD45 negatif tümör hücreleri üzerindeki yolluk temsil eder. Sayılar toplam nüfus yüzde YFP pozitif hücrelerini temsil eder. larg görüntülemek için buraya tıklayıner görüntü.

Şekil 4. Bağışıklık fare transgenik meme tümörlerinde infiltratları. Fare meme tümörleri homojenize ve CD45, CD3, γδTCR, CD11b ve Gr1 için boyandı. Sayılar tüm tümör (63.5) pozitif lökositlerin yüzde temsil toplam CD3 + (46.7), toplam CD3 negatif (40.1), toplam CD3 + γδ + (T hücreleri γδ, 13), CD3 + γδnegative (24), toplam GR1 yüksek CD11 (MDSC, 28.6) ve toplam CD11 GR1 düşük (makrofajlar, 18.5). resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Nedeniyle fare ve intraduktal enjeksiyon tekniği anatomisine biz hedefleme o bulmakf meme bezleri 4 ve 9 (Şekil 5) en tutarlı sonuçlar ve güvenilir enjeksiyonları verir. Ancak, herhangi bir bezi ameliyat teknisyeni tercihine bağlı olarak hedeflenebilir.

Şekil 5,. Meme kanalları Numaralandırma. Meme kanalları 4 ve 9 diyagram üzerinde kırmızı renkte ve fare üzerindeki oklar ile gösterilmiştir. Bizim ellerde, biz enjeksiyonları, bu meme kanallarına gerçekleştirmek için biz de benzer kinetik ile geliştirilen tümörleri hedef. Ancak tüm diğer meme dokuları kolay olduğunu buldu büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.