Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Rachelle Levy; Jessica Molina; Moise Danielpour; Joshua J. Breunig

doi:10.3791/51319

Yöntem makalesi

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

DOI:

10.3791/51319

⸱

7 Mayıs 2014

Rachelle Levy¹ , Jessica Molina² , Moise Danielpour^*¹ , Joshua J. Breunig^*²

¹Department of Neurosurgery, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, ²Department of Biomedical Sciences, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç yılda Pial yüzey yaralanma sonrası da dahil olmak üzere, embriyonik perinatal ve yetişkin nöro-ve gliogenesis sırasında önemi bir germinal niş olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte, genetik olarak bu hücrelerin popülasyonları sorgulama ve soy izleme için yöntemler, özgünlüğü ya da zaman virüs üretimini tüketen olmaması nedeniyle sınırlı olmuştu. Böylece, bu bölgede ilerleme bu konumu soruşturmaların sadece bir avuç nispeten yavaş olmuştur. Elektroporasyon embriyo nöral kök hücre özelliklerini incelemek için bir on yıl için kullanılan ve son zamanlarda doğum sonrası beyinde olmuştur. İşte biz, bir uyarlanmış elektroporasyon yaklaşıma dayalı pial yüzey atalarıdır genetik manipülasyon için verimli, hızlı ve basit bir teknik açıklar. Pial yüzey elektroporasyon dolayısıyla bu hücrelerin incelenmesi için bir zaman tasarrufu ve ekonomik yaklaşımı temsil eden, bu atalarıdır uyduruk genetik etiketleme ve manipülasyon için izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir kök ve projenitör hücreler, memeli merkezi sinir sistemi ^{1, 2} mevcut bulunur. Onların doğası ve beyin ve omurilik ventriküler bölgelerini çevreleyen embriyonik ve yetişkin germinal bölgelerinde özellikleri de yoğun geçen on yılda ^1-3 belgelenmiştir. Büyük ölçüde, bu nedeniyle böyle floxed alellerin veya ⁴ izleme retroviral soy sinir sistemi belirli Kre rekombinasyon olarak giderek kesin genetik araçlarının geliştirilmesi olmuştur. Ancak, bir ata bölge Pial yüzey atası sadece son zamanlarda herhangi bir detay ^5-7 tarif edilmiş bölge-vardır ve bekliyor kapsamlı inceleme.

Beynin Pial yüzeyi b....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür Cedars-Sinai IACUC gereklerine uygun olduğunu. Müfettişler önce işlem için kurumsal IACUC uyumunu sağlamalıdır. Bütün araçlar ve reaktifler, kullanılmadan önce sterilize edilmelidir.

1.. Araçları'nın hazırlanması, Çözümleri ve DNA Karışım

Bir mikropipet çektirmesi içine 100 mm yangın parlatılmış borosilikat cam kapiller tüplerin yerleştirin. Yaklaşık 17,5 mm pipet oluşturan standart ağırlıklı çekme sağlamak için ısıtma ayarlayın. Kabaca 100 mikron çapında bir delik oluşturmak için ucu başından itibaren bir mesafe yaklaşık 8-9 mm keskin cerrahi makas ile ipuçları kesti.
Bir hisse% 1 w / kuru hızlı yeşil....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreleri çoğunlukla progenitorlar-ya da pial yüzeyinin yakınındaki ⁶ plazmid DNA'nın ifade Pial yüzey elektroporasyon ile sonuçlanır. Daha spesifik olarak, elektrotların oryantasyonu plasmid hareket ve daha sonra ifade yönünü dikte kritiktir. Bu nedenle, çift elektrot yapılandırmalarında, plazmid negatif ve pozitif elektrot arasında yaklaşık düz bir vektör içinde yönlendirilir. Negatif kutup enjeksiyon yerinde üzerine yerleştirilir ve pozitif kutup negatif kutbuna ventral olduğunu, bu nedenle, plazma Pial yü.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pial yüzey progenitörlerinin başarılı elektroporasyon için en önemli bir yönü vardır: 1) pial yüzeyine plasmid karışımı hedeflenmesi; 2) enjeksiyon sahasında hematom üretilmesini önlemek; ve 3) Ortabeyin elektroporasyon ile ilişkili mortalite kaçınarak.

Uygun Pial yüzeyi hedef Pial yüzeyin nüfuz etmesini önlemek için kafatası ölçülü ve dikkatli bir delik açarak gerçekleştirilir. Hafifçe doku (yani hızlı yeşil deri ve bağ dokusu kafatası üzerinde lokalize) ovuşturarak üzerine deri il.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Cedars-Sinai Rejeneratif Tıp Enstitüsü ve Guerin Ailesinden Samuel Oschin Kapsamlı Kanser Enstitüsü Kanser Araştırma Forumu Ödülü desteğini yanı sıra fon kabul etmek istiyorum. Açıklanan Proje Araştırma Kaynakları, Grant UL1RR033176 için Ulusal Merkezi tarafından finanse edilen bir CTSI Çekirdek Fiş şeklinde desteklenen ve Translational Bilimler, Grant UL1TR000124 ilerlemek için Ulusal Merkezi şimdi de edilmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası
Yangın Cilalı Borosilikat Boru	Dünyası Hassas Aletler, Inc.	1B100F-4
Mikropipet Çektirme	Sutter Instruments Company	P-30
Hızlı Yeşil FCF Sigma	Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Dijital Mikroenjektör	Sutter Instruments Company
ECM 830 Jeneratör	Harvard Cihazı, BTX Enstrüman Div	45-0052
3 mm Platin Cımbız	Harvard Aparatı, BTX Enstrüman Div	45-0487
SignaGel Elektrot Jel	Kardinal Sağlık	70315-025
Tris-EDTA Tamponu, pH 8.0	Entegre DNA Teknolojileri, Inc.	11-01-02-05
Kızılötesi Isı Lambası	VWR	36547-009
İnce Makas Keskin	İnce Bilim Araçları	14060-09

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Neonatal Beyin Genetik Manip lasyon Plazmid Enjeksiyonu Elektroporasyon Tekni i N ral Progenit rler Meningeal Bo luk Cam Pipet Mikro Enjekt r Platin Pensler

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler