Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

3 boyutlu doku kültüründe biyo materyalin kullanılması 2B yapışma ve bir plastik alt-tabaka ile bir değinmeyecek daha fazla bir in vivo ortamda daha fazla benzer fizyolojik koşullar altında laboratuarda hücre davranışını incelemek için araştırmacılar sağladı. Özellikle, büyük adımlar ileriye hava-sıvı arayüzü ^1-4 3D kültür yöntemlerinin benimsenmesi ile tabakalı epitel modelleme yapılmıştır. Bu tür teknikler sadakatle keratinosit farklılaşması ve bu süreçleri inceleyen araştırmacılar için daha fazla esneklik ve sadakat sağlayarak tümör hücresi istilasını taklit. Stromal ortamı taklit etmek için biyo-malzeme alt-tabaka seçimi temel olarak tip I kollajenin, Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom matris ve de-epidermized dermişin kullanımı dahil oldu. Örneğin, kanser ile ilgili fibroblastlar stromal-epitelial etkileşimleri ^6,7 ile kanser istilası ^5, başlatma ve progresyon doğru katkıda gösterilmiştir when, alt tabakalar yetiştirilir.

Deride stromal çevreyi taklit için altın standart, bu tür teknikler kullanılarak en büyük ve en çok çalışılan tabakalı epitel, insan dermis (DED) de-epidermized edilmesi kabul edilir. DED hazırlanması insan kadavra derisi ^3,4 ikinci tripsinizasyon veya fiziksel ayrışması ile epidermisin kaldırılmasını içerir. Ancak, bu tür cilt için erişim klinik kurumları ile ilişkili olmayan laboratuarlar için çok zor olabilir, ve hastalıklı dermis elde yakınında mümkün değildir. Bir alternatif olarak, laboratuarlar sık ​​I kollajen (sıçan kuyrukları izole) ve / veya Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu matris tipi bir arada kullanın.

Bu kollajen ⁸ Nageotte tarafından 1927 yılında keşif kolayca asetik asit ve tuz çökelmesini kullanılarak izole edilebilir sonra, doku kültürü için uygulanması, daha sonra Huzel öncüleridirla ve arkadaşları ^9. Kolajen kaplama Ehrmann ve Gey'de ⁹ tarafından sorgulanan olarak 29 suşları ve doku eksplantlarında hücre kültürü için cama göre daha üstün olduğu kanıtlanmıştır. Şu anda, doku kültüründe kullanılan kolajen önemli bir tipi, fare kuyruk tendon izole edilir ve genellikle ticari kaynaklardan satın alınır. Bununla birlikte, alt-tabaka sadık tekrarlama için dezavantajı, fare kuyruk kolajeni insan kolajen, tür I ve III kollajen ana bileşenler olarak mevcut olan insan dermiş, özdeş değildir ve izole edilmiş fare kuyruk kolajeni her zaman bölünmüş olmasıdır.

Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu matris kültüre Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkoma hücreleri ¹⁰ tarafından salgılanan jelatinimsi bir protein karışımıdır. Ana bileşen laminin, tip IV kolajen, heparin sülfat proteoglikan, Entactin ve nidogen ve bu proteinlerin kesin oranları partiden partiye değişecektir. Kenara yapısal Proproteinlerden, bu matris, aynı zamanda, bir büyüme faktörü β, epidermal büyüme faktörü, insüline benzer büyüme faktörü, 1 sığır fibroblast büyüme faktörü ve hücre davranışını değiştirecek ^11,12 trombosit türevli transforme edici büyüme faktörü gibi büyüme faktörlerinin önemli düzeyde içerir. Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom matris sırf karmaşıklığı dönük, 1.851 proteinlerin toplam yeni proteomik çalışmada ¹³ tespit edilmiştir. Yorumlanması ve bunun ¹¹ kullanımı ile, farklı deneyler karşılaştırırken Bu matrisin zengin ve karmaşık doğası ışığında, dikkatli tavsiye edilmiştir.

Bizim laboratuvarları genetik deri hastalıkları, kutanöz skuamöz hücreli karsinom (CSCC) ¹⁴ gelişmekte olan bir yatkınlığı olan özellikle bir ilgi var. Resesif distrofık ​​epidermoliz bullosa (RDEB), COL7A1 gen mutasyonu germline ile ciddi bir kabarma hastalık durumunda 18 teşvik tümör olduğunu tespit ettik. Bu çalışmanın seyri sırasında kolajen ile I / Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu matris gömülü ve hücrelerin kendi, yerli matris değerlendirilmesi yollarını araştırmıştır dermal fibroblast özellikleri teşvik tümörü değerlendirmek için koyamadık. Bunu başarmak için, biz insan cildi üzerinde çalışan ^19,20 Eşdeğer Lucie Germain laboratuarından bir önceki tekniği değiştirilmiş. Germain teknik, sentetik ya da kadavra iskele yokluğunda primer insan keratinosit ve fibroblast hücreleri kullanılarak iyi organize bazal membran ile insan derisinin yeniden başardı.

Bu yazıda kutanöz tümör stromal mikroortam (yerli matris) özetlemek için kullanılan adımlar in vitro birincil stromal fibroblastlar doğrudan elde ¹⁸ açıklanmıştır. Native matrisler pfibroblast uzun süreli kültüründen roduced CSCC hücre istilası için tahlil eşdeğer bir dermal olarak kullanılmıştır. Biz, (VII tipi kolajen (C7) in eksik) RDEB fibroblastlar veya retroviral olarak tümör ile ilgili tek bir kolajen derin bir etki oluşturmak ve göstermek ifade eden bir tür VII kollajen ile transduse RDEB fibroblastlar salgılanan dışı matris ya da türetilmiş doğal matrisi kullanılarak veri mevcut hücre işgali.

Bu çalışma Helsinki İlkeler Bildirgesine göre yapılmıştır ve uygun Etik Komiteleri tarafından onaylandı.

1.. Medya ve Reaktifler hazırlanması

1. L-askorbik asit 2-fosfat stoklar 200x hazırlanması
   1. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) çözeltisi, 5 ml başına L-askorbik asit 2-fosfat 29 mg çözülür ve 0.22 um'lik bir membran filtresinden filtre. Mağaza -20 ° C de 0.25 mi steril olarak alikotları
   2. L, 0.1 mM'lik bir son konsantrasyon için, gerekli olan günde fibroblast ortamı (% 1 L-glutamin ve% 10 fetal sığır serumu ile DMEM) içinde her 50 ml 200x L-askorbik asit 2-fosfat stok 0.25 ml'lik bir şişe ekleme -askorbik asit 2-fosfat.
2. Keratinosit büyüme ortamının hazırlanması
   1. Birinci SCC keratinositlerin izolasyonu ve kültürü, daha önce ²¹ tarif edilmiştir. Keratinosit büyüme ortamının hazırlanması tarif edilmektedirhususda.
   2. Kısaca, medya hazırlar:
      300 ml DMEM ve% 10 FBS ile takviye edilmiş Ham F-12 ve 100 mi
      0.4 mg / ml hidrokortizon
      5 mg / ml insulin
      10 ng / ml EGF
      5 mg / ml transferrin
      8.4 ng / ml, kolera toksini
      13 ng / ml liothyronine
      1x penisilin-streptomisin solüsyonu

2.. L-Askorbik Asit 2-Fosfat Tümlenmiş Medya fibroblast-türevli Yerli Matrix Vitro İnşaat

1. 6-delikli plakalardaki L-askorbik asit 2-fosfat ile takviye edilmiş ortam içinde fibroblast (20,000 hücre / cm ²⁾ iyi tohum başına 200,000 fibroblastlar. Ortam 2-5 ml her 2-3 günde Tekrar beslemeli. (Not: Refeeding frekans ve hacim farklı hücrelerin bireysel ihtiyaçlarına uygun şekilde ayarlanabilir "Tartışmalar" bölümüne bakın.).
2. Hücre dışı matris içine gömülü hücrelerin kalın bir tabaka, çıplak gözle görülebilir 6 hafta, (sonunda oluşturacak
3. Yerli matris şamandıra edelim ve her 2-3 gün medya değişiyor, 5 gün boyunca pişmanlık. Nedeniyle gerilme mukavemeti ve matris içinde içsel yeniden için, matris ölçüde sözleşme ve daha küçük, ama daha kalın yerel matrise düşük hale gelir ve işgal tahlil için kullanılmak üzere hazırdır.

3. Tümör SCC Keratinositler ile Invasion Deneyi

1. Künt forseps ile yavaşça yerli matrisi Pick up ve Naylon net transfer. Bir kez Naylon net, 1 ml mikropipet kullanarak mümkün olduğunca düz yalan yavaşça matris yayıldıucu ve künt forseps.
2. Bir ucunda steril vazelin küçük bir miktar lekelenme ile steril klonal silindirleri hazırlayın.
3. Vazelin aşağı yüzü, yerel matrisi üzerinde klonal silindirleri yerleştirin. Bu yerli matrisi ile klonal halkaları arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için.
4. Klonal silindir (keratinosit büyüme ortamı içinde 100 ul 250,000 hücre) için CSCC hücreleri ekleyin.
5. CSCC hücreler yerli matris üzerinde yerleşmiş zaman 6 saat sonra klonal silindirleri çıkartın.
6. Bükülmüş paslanmaz çelik tel örgü destek üzerine hava-sıvı arayüzü yerli matris ve CSCC hücreleri ile Naylon net kaldırın.
7. Ortam seviyesi yerli matrisin alt temas edene kadar askorbik asit ile takviye edilmiş keratinosit büyüme ortam ekleyin.
8. 7 her 2-3 gün ve hasat ortamı değiştirmek ve CSCC hücrelerin 14 gün sonrası tohumlama.

4. 3D Kültürlerin Hasat ve Histoloji Hazırlık

1. % 4 par saptamakOda sıcaklığında gece boyunca aformaldehyde.
2. Kesim yüzeyi dışa bakacak şekilde formalin fikse parafin bloklar için balmumu örnekleri ve embed, ikiye bölmek.
3. Alternatif olarak, OCT bisected örnekleri embed ve snap-donma hemen taze dondurulmuş doku blokları için sıvı azot içinde.
4. Mikrotom ve mumunun 4 mikron bölümleri (gerekirse) kesin. Standart hematoksilen ve eozin ile Leke. CSCC hücreleri görselleştirmek için, keratin 14 karşı fare monoklonal antikoru (LL001, in-house) immünohistoloji lekeleme kullanılabilir.

Bu teknik, incelenmesi ve farklı 3D stromal ortamlarda (bu durumda CSCC olarak) tümör hücrelerinin invaziv davranışlarını karşılaştırmak olasılığını açar. Bu tekniği kullanarak, RDEB dermal çevre değinmeyecek C7-eksikli yerel matrisler sadece üretilen, aynı zamanda genetik olarak aşırı ifade C7 18 için tasarlanmış olan ek matrisler olabilir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, RDEB CSCC keratinositlerin istilası C7-eksikli RDEB kontrol ile karşılaştırıldığında C7-aşırı ifade yerli matrisler önemli derecede geri oldu. Bu işgal jeller, sabit parafin bloklara gömülü ve sonra kesitler ve immunohistokimyasal standart histolojik yöntemler aracılığıyla görüntülenmiştir. Boyama için kullanımı önerilen antikorlar CSCC hücreleri ve fibroblastlar için anti-vimentin (V9), anti-keratin 14 (LL001) bulunmaktadır.

p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 1. Fibroblast türevli yerli matris ve tümör işgali testinin nesil iş akışı. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. C7 fibroblast eksikliği kontrol RDEB türetilen doğal matrisine CSCC istilasının Keratin 14 (LL001) boyama (ai ve bi) veya RDEB fibroblastlarda aşırı eksprese eden tam uzunlukta C7 ifade (aii ve bii), açık bir şekilde göstermektedir ki yeniden ifade hücre dışı matriks içinde C7 CSCC keratinosit işgali geciktirebilir. Çekirdekleri (mavi) DAPI ile lekeli ve bi ve BII içinde (yeşil) vimentin ile fibroblastlar.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.