Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Özet

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Özet

Çoğu protein, diğer proteinler ile geçici olarak etkileşebilir ya da biyolojik işlevi gerçekleştirmek için, çok-protein kompleksleri halinde entegre edilmiştir. Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC), bitki hücrelerindeki bu tür etkileşimlerin görüntülenmesi için bir in vivo bir yöntemdir. Sunulan protokol, incelenen aday proteinlerin floresan proteinleri tamamlayıcı yarılarına kaynaşmış ve ilgili yapılan, Agrobacterium aracılı transformasyon yoluyla bitki hücrelerine dahil edilir. Daha sonra, proteinler, geçici tütün yapraklarının olarak ifade edilmiştir ve geri floresan sinyalleri sağlam hücrelerde konfokal lazer tarama mikroskobu ile tespit edilebilir. Bu etkileşimin kendisinin sadece görselleştirme sağlar, aynı zamanda protein komplekslerinin hücre içi lokalizasyonu belirlenebilir. Bu amaçla, bir fluoresan etiketi ihtiva eden marker genleri böylece bu t olarak hücresel yapılarının görselleştirme, BiFC konstruktları ile birlikte eksprese edilebilirO retikulum, mitokondri, Golgi aygıtı ya da plazma zarı endoplazmik. Flüoresan sinyal ya doğrudan yaprak epidermal hücrelerde ya da kolayca dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilebilir tek protoplastlar içinde izlenebilir. BiFC ideal olarak canlı hücre içinde kendi doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri incelemek için uygundur. Bununla birlikte, bu ifade, güçlü promotörler ile tahrik edilecek ve etkileşim ortakları nedeniyle etkileşim mekanizması ile etkileşebilir nispeten büyük floresan etiketler, füzyonu için modifiye olduğu olduğu kabul edilmelidir. Bununla birlikte, bu tür BiFC coimmunoprecipitation gibi protein-protein etkileşimleri, in vitro pull-down testleri ya da maya iki-hibrid deneylerini araştıran diğer yaygın olarak uygulanan yöntemler için mükemmel tamamlayıcı bir yaklaşımdır.

Giriş

Protein komplekslerinin oluşumunu incelenmesi ve in vivo olarak bitki hücrelerinde hücresel lokalizasyonu ağları araştırmak için gereklidir, sinyalizasyon ve metabolik süreçleri. BiFC doğrudan canlı bitki hücresine ^1-5 içinde, doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri görselleştirme ^sağlar.

BiFC bir yeniden floresan protein için bir floresan protein kurşun iki özelliğine sahip olmayan N-ve C-terminal parçalarının tamamlanmasını yaklaşım. Birçok farklı floresan proteinlerin fragmanları da bu, yeşil floresan proteini (GFP), kimyasal olarak üç farklı artıkları ⁶ tarafından oluşturulduğu bir kromofor, örneğin, protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılmıştır. Floresan proteinleri ilgi iki proteinlere kaynaştırılabilir iki nonfluorescent parçalarının neden olduğu bir ilmek ya da beta-iplikçik içinde yarıya indirilebilir. Deney, bir hücre içi compartme etkileşimleri tespit etmek için kullanılabilirgenetik füzyon proteinleri ifade etmek için modifiye edilebilir bir aerobik olarak büyüyen bir organizmaya veya hücrelerde nt. , Iki proteinin hücre içinde yakın ilişkiye de zorlamaktadır geliyorsa, floresan kurulur ve dışsal florofor veya boyalarla ³ ilavesi olmadan mikroskobu ile izlenebilir.

Proteinler, kolaylıkla üretilen tütün konstruktları ile yaprak arasında Agrobacterium aracılı transformasyon kullanılarak ifade edilebilir çünkü Tütün (Nicotiana benthamiana), bitki protein etkileşimini görselleştirmek için uygun bir model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Agrobacteria bitki hücrelerine ilgi konusu genin iletimine aracılık enzim için kodlama yapan bir sözde Ti plazmidi (tümör indükleyici) kullanın. BiFC çözünür hem de bütün hücre bölmesi içinde zar proteinleri için de uygulanabilir olduğunu ve in vivo olarak başarılı bir şekilde etkileşen proteinleri tespit etmek hem de etkileşim bölgelerine analiz etmek için son yıllarda kullanılmıştır^7-9 proteinler içinde. Katılan genlerin sentezlenmesi üzerine, floresan protein etkileşimi gibi, endoplazmik retikulum (ER), plazma membranı veya kloroplast gibi daha büyük hücre yapıları için uygun olan, yaprak doğrudan görselleştirilebilir. Ancak, daha fazla rafine yapılarda lokalizasyonunu izlemek için, örneğin kloroplast zarf, bu dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilmiş protoplastlarda floresan görselleştirmek için tavsiye edilir. Bir C-terminal veya N-terminal floresan etiket bitkiler ¹⁰ BiFC yaklaşım için kullanılacak olan ya da ihtiva eden BiFC vektörler bir dizi. Aşağıda açıklanan protokol tetratricopeptide tekrar yanaşan proteinleri Toc64 ve AtTPR7 kloroplast dış zarf ve sırasıyla endoplazmik retikulum, ^11-13 ikamet içeren (TPR) etki ile sitozolik ısı şok proteini 90 (HSP90) etkileşimini incelemek için kullanılmıştır. Bu amaçla, HSP90 Ct kaynaştırılmıştırSCFP (SCFP ^C) erminal parçasıdır. Etiket, N-terminal TPR etki tipte kelepçe HSP90'ın C-terminal MEEVD bağlanma motifi erişim sağlamak için şaperon kaynaşmış oldu. Buna paralel olarak, Venüs (Venus ^N) en N-ucu kısmı yerleştirme proteinleri sırasıyla Toc64 ve AtTPR7 içeren TPR etki sitosolik etki ile kaynaştırılır. Negatif kontrol olarak, sitosol içinde yer alır ve bu nedenle, uygun bir kontrol olarak yalnızca SCFP ^C çözünür C-terminal parçası klonlandı.

Üzerinde çalışılan proteinlerin floresan etiketler yakın ve bu şekilde floresan sinyalinin sulandırma izin vermek üzere, aynı hücre bölmesi yüz vardır. Farklı bir floresan etiket ile kaynaşmış bir işaretleyici protein etkileşimi hücre içi lokalizasyonu göstermek için ortak transforme edilebilir yeniden floresan sinyalinin lokalizasyonunu belirlemek. MCherrry kaynaşık bir ER markör proteinin aynı anda dönüştürülmüştürAtTPR7 ¹⁴ bulunan ER durumda. Klorofil otofloresansı Toc64 durumunda kloroplast marker olarak görev yaptı. Bu sayede sadece sitosolik HSP90 ile, sırasıyla şaperon Toc64 ve AtTPR7, in vivo etkileşim tütün yapraklarının doğrudan izlenebilir değil, aynı zamanda etkileşim hücre içi lokalizasyonu araştırılabilir.

BiFC, protein-protein etkileşimlerini incelemek için diğer yöntemler için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak uygundur. Coimmunoprecipitation ya da nitro pull-down deneylerde göre, örneğin, herhangi bir özel antikorlar ilgi konusu proteinleri için kullanılabilir olması gerekir, ve proteinler, özellikle membran proteinleri için, zor olabilir, in vitro olarak rekombinant ifade edilmesi gerekmez. Proteinler kaynaşık floresan etiketler ¹⁵ etkileşimi ile yakalanır Üstelik, aynı zamanda geçici etkileşimler, BIFC kullanılarak izlenebilir.

Protokol

1.. BiFC transformasyonu, Agrobacterium içerisinde oluşturur

1. BiFC yapıların klonlanması
   1. Yan attB siteleri içeren oligonükleotidler kullanılarak uygun bir şablonundan ilgilenilen geni yükseltin. Bir düzeltme polimeraz kullanılarak, bir PCR gerçekleştirin. Tasarlanan primer kombinasyonu tavlama aşamasının uzunluğunu ve parça büyüklüğüne göre uzama aşamasının uzunluğu ayarlayın. Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü kontrol ediniz ve bir PCR Temizleme Kit kullanılarak kendisini saflaştırmak.
   2. Elde edilen fragmanı ile BP reaksiyonu ve bir BP rekombinaz kullanılarak giriş vektörü yapın. Giriş 150 ng vektör ile attB-PCR ürününün 15-150 ng karıştırın, BP rekombinazın 2 ul ekleyin ve 8 ul bir toplam hacme TE tampon maddesi ile doldurmak. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve reaksiyonu 37 ° C'de 10 dakika boyunca 2 ul Proteinaz K eklenerek reaksiyonu durdurmak
   3. , Yeterli E. içine tüm reaksiyon Transform coli DH5a, Hücreleri ve vektör içine DNA fragmanının sokulması için doğru bir koloni PCR ile elde edilen koloniler ekran. Pozitif DNA sekanslama plasmidlerin mutasyonların varlığını doğrulamak için gerçekleştirilir.
   4. Bir LR recombinase kullanarak uygun hedef vektörü ile LR rekombinasyon için elde edilen giriş klonu kullanın. Hedef vektör 150 ng giriş vektörü 50-150 ng karıştırın, 1 ul LR rekombinazı ilave edin ve 5 ul bir toplam hacme TE tampon maddesi ile doldurmak. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve reaksiyonu 37 ° C'de 10 dakika boyunca 1 ul Proteinaz K eklenerek reaksiyonu durdurmak
   5. Vektöre DNA fragmanının sokulması için doğru koloni PCR ile elde edilen koloniler, yeterli E. coli DH5a hücreleri ve ekran içine tüm reaksiyon dönüşümü. DNA diziliş analizi, bu aşamada gerekli değildir.
   6. Yüksek bir saflık derecesine ulaşmak için bir plazmid mini kiti ile plazmid DNA izole edilir.
2. Kimyasal olarak yetkili Agrobacteria (hazırlanmasısuşu AGL1, Rifampisin ve Carbenisilin direnci)
   1. Çizgi Bir stok kültüründen Agrobakterium ve 28 ° C'de 24 saat için büyümeye
   2. Tek bir koloni, 5 ml LB ortamı aşılamak ve 28 ° C de bir gece inkübe
   3. Inoküle 50 2, gece boyunca kültürün ml ve 1.0 OD ₆₀₀ ile 28 ° C de yaklaşık 4 saat için büyümeye sahip ml LB ortamı.
   4. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ve hücreler buz soğukluğunda _CaCl2 (10 mM) steril 1 ml pelletini. Bu adımdan sonra hücreleri buz üzerinde tutun.
   5. -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza hemen dondurma, hücrelerin alikotları (100 ul) hazırlayın
3. Kimyasal olarak yetkili Agrobacterium transformasyonu
   1. Buz üzerinde yetkili AGL1 hücrelerinin bir kısım Çözülme. Hücrelere plasmid DNA 1-2 ug ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika, 37 ° C de sıvı azot ile 5 dakika içinde 5 dakika boyunca inkübe Hücre ve s 600 ul LB ortamı ilave edin28 ° C'de 4 saat boyunca 650 rpm'de hake
   2. 8,000 xg'de 1 dakika için hücreler santrifüj ve süpernatant atılır. Uygun antibiyotikler ihtiva eden LB plakaları üzerinde kalan LB ortamı ve plaka 50 ul pelet tekrar. Plakları kapatın ve 28 ° C'de 2 gün boyunca inkübe Koloni PCR ile plazmidin varlığı için ekran kolonileri.
   3. Uygun antibiyotik içeren 5 ml LB ortamı içinde bir pozitif koloni inoküle ve gece boyunca 28 ° C'de inkübe edin. 500 ul% 50 gliserol ile sterilize edilmiş, gece boyunca kültürün 500 ul karıştırın ve -80 ° C'de dondurularak
   4. Tütün yapraklarının geçici transformasyon için gliserol stoğundan doğrudan uygun bir antibiyotik ihtiva eden LB ortamı içinde Agrobacteria'yı inoküle.

2. Tütün Yapraklarının geçici Dönüşüm

1. Agrobacteria'ı büyüme
   1. Aşağıdaki stok çözümleri hazırlayın: Acetosyringone (150 mm, 70 çözülür-20 ° C 'de parçalar olarak% EtOH), mağaza MES / KOH (0.1 M), pH 5.7, 4 ° C (daha uzun süre depolama sırasında bakteri gelişimini önlemek için bir 0.2 uM filtre aracılığıyla steril filtre) saklayın, _MgCl2 (1 M), hisse senedi, oda sıcaklığında saklayın.
   2. Bir steril 50 ml tüp içinde, ilgi konusu plazmidi içeren AGL1 gliserol stok kültüründen 50 ul ile uygun bir antibiyotik ihtiva eden 10 ml LB ortamı aşılamak ve en az 24 saat 1.0 arasında bir OD ₆₀₀ kadar, 190 rpm'de çalkalanarak 28 ° C'de inkübe -2.0 ulaşılır.
   3. Santrifüj bakteriler 15 dakika boyunca 3.000 xg'de. Taze infiltrasyon ortam içinde pelet _[MgCI2 (10 mM), MES / KOH (10 mM), pH 5.7, Acetosyringone (150 uM)] yeniden süspanse edin ve 1.0 OD ₆₀₀ için süspansiyon ayarlayın.
   4. Karanlıkta, 2 saat için bir havai çalkalayıcıda Agrobacteria hücreleri inkübe edin. Hücreler daha sonra sızma için kullanılabilir.
2. Tütün yaprakları Sızma
   1. Üç kullanınhaftalık tütün (Nicotiana benthamiana) bitkileri. Süzülmesi için birkaç eski yaprakları seçin.
   2. Ilgilenilen yapıları (her biri 3 mi) taşıyan agrobakteri eşit hacimlerde karıştırın. Infiltrasyon için bir iğne olmayan bir 5 ml şırınga al. Çeşitli yerlerde yaprakların alt tarafında şırınga basarak tütün yaprakları dikkatli bir hücre süspansiyonu sızmak.
   3. Bitkilerin su ve iki gün boyunca karanlıkta onları bırakın.

3. Protoplast Hazırlık

Tütün yapraklarının Protoplast hazırlanması Koop et al. ¹⁶ uyarlanmıştır ve biraz değiştirilmiştir.

1. Tampon hazırlanması
   1. F-PCN orta hazırlayın: makro tuzları, _[3 (1012 ug / ml) KNO, _CaCl2 • 2H ₂ O (440 ug / ml), MgSO ₄ • 7H ₂ O (370 ug / ml), KH ₂ PO ₄ ( 170 ug / ml), NH _4-süksinat [(20 mM, bir 2 M stok eriyiği hazırlamakution] (süksinat (236 ug / ml) ve _NH4CI (106 ug / ml), çözünmesi için pH 5.8 'e ayarlayın), mikro tuzları [EDTA-Fe (III), Na-tuzu (40 ug / ml) x KJ (0.75 ug / ml), ₃ H BO ₃ (3 ug / ml), ₄ MnSO • _H2O (10 ug / ml), ₄ ZnSO • 7H ₂ O (2 ug / ml), Na ₂ MoO ₄ • 7H ₂ O (0.25 ug / ml), • ₄ CuSO 5H ₂ O (0.025 ug / ml), _CoCl2 • 6H ₂ O (0.025 ug / ml)], MES (390 ug / ml), glikoz (yaklaşık 80 ug / ml), ozmotik basıncı 550 mOsm, pH 5.8 (KOH). -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın
   2. F-PIN orta hazırlayın: F-PCN olarak yerine glikoz kullanımı sukroz (yaklaşık olarak 110 ug / ml), osmolarite 550 mOsm, pH 5.8 (KOH) bütün katkı maddeleri. -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın
   3. W5 orta hazırlayın: 150 mM NaCI, 125 mM _CaCl2, 5 mM KCI, 2 mM MES, osmolaritesi 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). 4 ° Mağazası, C (daha uzun depolama sırasında bakteri gelişimini önlemek için bir 0.2 mikron filtre içinden, steril filtre).
   4. Protoplast izolasyonu (0.1 g selülaz, 10 ml F-PIN 0.03 g macerozym) için taze enzim çözeltisi hazırlayın. 10 dakika ve oda sıcaklığına soğutun boyunca 55 ° C'de çözelti inkübe edin. 10 ml çözeltiye,% 10 BSA, 100 ul ekleyin.
2. Protoplastların izolasyonu
   1. Bir Petri kutusu içine bir infiltre yaprak koyun ve taze enzim çözeltisi ekleyin. Yaklaşık olarak 0.5 cm büyüklüğünde parçalar halinde ² yaprak kesmek için yeni bir jilet kullanın. Bir vakum-infiltrasyon şişeye enzim çözeltisi ile yaprak parçaları transfer ve hava kabarcıkları (çok dikkatli bir şekilde serbest bırakma vakum) yaprakların ortaya kadar vakum yaklaşık olarak 20 saniye boyunca sızmak.
   2. Karanlıkta 40 rpm'de 90 dakika boyunca çalkalanır.
   3. 90 rpm'de 1 dakika boyunca çalkalanarak protoplast serbest bırakın. Bir 15 ml santrifüj tüpüne (yuvarlak alt) içine gazlı bez (100 uM) ile solüsyon filtre.
   4. 70 x g'de oda sıcaklığında (yavaş hızlanma ve yavaşlama) 10 dakika boyunca 2 ml F-PCN tampon ve santrifüj ile protoplast çözelti Yerleşimi.
   5. Bozulmamış protoplastlar enzim çözeltisi ve F-PCN arayüzünde birikir. Yeni bir santrifüj tüpü içine sağlam protoplastlarını aktarmak ve W5 tamponu ile doldurmak için geniş bir delik 1 ml pipet alın. Protoplast pelet 100 x g (yavaş hızlanma ve yavaşlama) 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
   6. Protoplast miktarına bağlı olarak, yaklaşık olarak 200 ul W5 tamponu içinde bir pipet ve pelet tekrar süspansiyon kullanılarak dikkatli bir şekilde süpernatantı.
   7. Her zaman olduğu gibi protoplast yırtılmasının önlenmesi için geniş delikli ipuçlarını kullanın.

4. Lazer Tarama Mikroskopi

1. Örnek hazırlanması
   1. Bir mikroskop lamı etrafında sızdırmazlık iki küçük şeritler (2 cm arayla) yapıştırın. Şeritler arasındaki protoplast çözeltisinin 20 ul koyun ve dikkatli bir şekilde bir cam kapak yerüstüne. Sızdırmazlık şeritleri Protoplastlar cam kapak tarafından ezilmiş olmadığından emin olun.
   2. Toplam yaprak örnekleri yaprak 1 cm parça kesip yukarı bakacak yaprağın alt tarafı ile bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin için. , Yaklaşık 30 ul H ₂ O ekleyin üstüne bir kapak cam yerleştirin ve her iki tarafta yapışkan bantla sıkıca sabitleyin.
2. Konfokal görüntüleme ve mikroskop ayarları
   1. TCS SP5: Görüntüleme Leica, Tipi konfokal lazer tarama mikroskobu ile yapılır. Büyütme için görüntüleme ortamı olarak gliserol ile 63X bir şiddetinde bir objektif (HCX PL APO CS) kullanın. Sayısal açıklık 1.3 ayarlayın. Değerlendirme için Leica Application Suite / Gelişmiş Flüoresan yazılımını (Ek Bilgi S1 bakınız) kullanın.
   2. 515 nm 'de yeniden BiFC sinyalinin izlenmesi ve bir PMT 495-550 detektör emisyon bant genişliğini ayarlamak için% 18 oranında bir yoğunluğu 488 nm'de% 30 Argon lazer ve lazer gücü.
   3. Klorofil otoflüoresanı izlemek için 650-705 ikinci PMT detektör emisyon bant genişliğini ayarlayabilirsiniz.
   4. MCherry sinyali HeNe lazer kullanmak 561 izlemek için, lazerin yoğunluğu 561-18 ve% 587-610 üçüncü PMT detektörün emisyon bant genişliği ayarlanır.
   5. Tüm PMT detektör kanallarına fotoğraf aynı kazanç ayarları (kazancı arka plan sinyallerini dışlamak 800-900 arasında olmalıdır) ile alınır emin olun.
   6. 100 Hz tarama hızı ile 1024 x 1024 piksel bir biçim genişlik / yükseklik fotoğraflar çekin.
   7. Z-stackings her yığını arasında 0.5 mikron maksimum mesafe kullanmak için.

Sonuçlar

Bu örnekte, zar proteinleri yerleştirme AtTPR7 ve Toc64 ile sitosolik moleküler şaperon HSP90'ın etkileşimini izlemek için BiFC yöntemi kullanılır. AtTPR7 Sec translokon bir parçası olan ve muhtemelen ER membranına translasyon sonrası translokasyon için salgılama preproteins teslim sitosolik şaperonlar, ile etkileşime girer. Aynı şekilde, kloroplast dış zarfa Toc64 HSP90 ilişkili kloroplast preproteins alarak post-translasyon ithalat davranır. Her iki protein de HSP90'ın C-terminal MEEVD motifi ile etkileşim ara...

Tartışma

Bir BiFC deney planlama üzerine birkaç nokta dikkate alınmalıdır. Ilgilenilen protein ile ilgili yapısal bilgi gerekli olduğundan, topoloji zar kapsayan proteinleri ile çalışan bilinen zorundadır. Floresan proteinleri aynı hücre içi kabininde bulunan ya da etkileşim sağlamak için bir zarın aynı yan yüz gerekir. Bir N-terminal hedefleme sekansı gerekli proteinleri analiz Doğal olarak, yalnızca C-ucu işareti olarak kabul edilebilir. Bu etiket, bir GFP-etiketli proteini ifade ile, örneğin, daha önce hücre içi lokalizasyonu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3',5'-Dimetoksi-4'-hidroksiasetofenon	Sigma-Aldrich	D134406	Asetosiringon
Selülaz, Onozuka-R10	Serva	16419	Trichoderma viridae
Makrozym R-10	Rhizopus sp.GATEWAY'den	Serva	28302
, BP Klonaz II, Enzim Kiti	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Klonaz II, Enzim Kiti	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kiti	Qiagen	27106
NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme Kiti	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Ağ Geçidi klonlama
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Ağ Geçidi klonlama
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Ağ Geçidi klonlama