Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

Oksidatif stres özellikle dengesiz hücresel redoks durumundan kaynaklanan bir durum olarak tanımlanır. Rutin hücrelerin içinde meydana kompleksinin redoks reaksiyonları hücresel redoks-durumunu belirlemek. Redoks reaksiyonları azaltma ve molekül (yani redoks reaksiyonları) oksidasyonunu üreten biyolojik moleküllerin atomları arasında elektron transferinde oluşan, kimyasal reaksiyonlar oluşur. Bu reaksiyonlar, bir uç yapı kararsızlık ve komşu biyomoleküllerle alışverişi dengesiz elektron kendiliğinden aktivasyonu ile karakterize edilir elektronik aktif bir tür (örneğin pro-oksidatif türleri) ile katalize edilir. Bu düzensiz reaksiyonlar DNA hasarı, protein karboksilasyon ve lipid oksidasyon haline neden ve sonuçta hücre ölümüne ^1. yol açar. Oksidatif stres seviyelerinin artması yaşlanma ve farklı patolojik durumların ^2'nin ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. Oksidatif stres vardiyabet, kalp-damar hastalıkları ^3,4 vasküler değişikliklerden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı nöronal dejenerasyon önemli bir rol oynar ve Parkinson hastalığı ^5. Ayrıca, oksidatif stres kanser ilerlemesini ve metastatik olayları ^6,7 yöneten kritik bir faktör olarak kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, enflamasyon ve immün yanıtları ortaya ve diğer destek oksidatif stres ⁸ olabilir.

Veya nitrojen (RNS; reaktif nitrojen türleri); canlı hücreler olarak, pro-oksidatif oksijen türleri (ROS reaktif oksijen türleri) türetilir. (H ₂ O ₂₎ ve hidrojen peroksit ^- (O ₂₎ ROS superoksit anyon ^(. OH) hidroksil radikali içerir. Birincil RNS nitröz oksit ^(NO). Olduğunu. İkinci reaktif türlerin bir dizi betwee kendiliğinden etkileşimleri ile üretilebilirn ROS ve RNS veya ücretsiz metaller ⁹ iyonların. H ₂ O ₂ ^{Fe2 +} hidroksil radikalleri meydana ile reaksiyona sokulması sırasında, ^- örneğin, süperoksit anyon peroxynitrate (ONOO) oluşturmak için azot oksit ile reaksiyona girer. ROS ve RNS nedeniyle çok biyomoleküller ile tepkimeye yetenekleri için, fizyolojik redoks durumuna ¹⁰ bakımı için tehlikeli bir tehdit olarak kabul edilir. Korumak için redoks durumu hücreleri, anti-oksidan moleküllerini ve detoksifiye edici enzimler, bir dizi ile donatılmıştır. ^{. 11 -} süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glütatyon peroksidaz ve Peroxiredoxins esas _{H2O 2,} OH ve Oono de dahil olmak üzere pro-oksidatif türlerden hücresel koruma sağlayan, anti-oksidan enzimatik-cephanelik oluşturmaktadır. Ayrıca C vitamini ve E, polifenoller ve CoEnzymeQ10 (CoQ10) gibi anti-oksidan moleküller ROS ve tehlikeli DE gidermek için kritik öneme sahip^12,13 türevleri üzerinde. Bununla birlikte, ROS ve RNS, ya da anti-oksidan sisteminde bir fonksiyon bozukluğu, aşırı üretimi oksidatif stres ¹⁴ doğru hücresel redoks durumunu değiştirir.

Onların olumsuz çağrışım yanı sıra, ROS farklı kökenli hücrelerde çeşitli fizyolojik roller oynayabilir. Hücreler normalde böyle konak savunma ve yara onarımı ^15-17 gibi normal biyolojik olaylara aracılık için sinyal molekülleri olarak ROS üretir. Reaktif türlerin normal sinyalizasyon faktörleri, büyüme faktörleri, ve kalsiyum seviyeleri ^18,19 hücre içi dalgalanmalara tepki olarak bu NOx (NADPH oksidaz) ve XO (ksantin oksidaz) gibi hücre içi enzimlerin hücrelerinde üretilir. Bu ROS diferansiyel örneğin p53 ya da ATM-kinaz, DNA hasarı ²⁰ için cevabın bir ana regülatör olarak, hücresel bileşenler olarak önemli bir nükleer faktör aktivitesini modüle edebilir olduğu bildirilmiştir. Benzer ROS kuvvetle inci aracılık ederek hücresel sinyalizasyonu etkileyebilire oksidasyon ve sinyal iletimi ²¹ arasında önemli bir düzenleyici olarak oluşturulan protein tirozin fosfatazlar (PTP), inaktivasyonu. Ayrıca, proteomik göre yöntemler RNS aynı zamanda spesifik protein modifikasyonları ve moleküler sinyallemesinin değişikliklerden sorumlu olduğunu göstermektedir. S-RNS nitrothiols (SNO) içine değiştirerek ve bu enflamatuar ve otoimmün hastalıklarda ^22,23 gibi patolojik durumları ile birlikte moleküler yolları tetikleme sistein tiyol grupları ile reaksiyona girmektedir.

Hücre kültürü deneyleri sadece kısmen in vivo etkili faktörlerin sayıda yeniden beri, hayvan modellerinde ^24,25 redoks çalışmalar gerçekleştirmek için büyük ilgi olduğunu. Bunu başarmak için, zebra balığı oksidatif stres dinamiklerini ²⁶ incelemek için uygun bir omurgalı hayvan modeli olarak kabul edilmiştir. Zebra balığı çeşitli avantajları omurgalı dev sırasında hücresel ve genetik olayları incelemek için izin veren yeni bir model sistemelopment ve hastalık. Embriyolarının büyük kümeler deneysel ihtiyaçları için haftalık oluşturulur ve mevcut olabilir. Ayrıca Zebra balığı embriyolarının olağanüstü optik netlik, hem de kendi küçük boyutu, bütün organizmalar ²⁷ tek hücre görüntüleme ve dinamik bir izleme sağlar. Son on yılda, zebra balığı mutantlar önemli sayıda kanser ve genetik hastalıklar ^28-31 gibi insan patolojik durumları modellemek için oluşturulan edilmiştir. En önemlisi, transjenik soylarda çok sayıda genetik ve biyolojik manipülasyonlar ³² arasında geniş olanaklar sağlamak için hazırlanmıştır. Örneğin, transgenik dokuya özgü zebra balığı hatları düzenli olarak in vivo çalışmalar için kullanılmaktadır. Bu hatlar, in vivo olarak, tek hücreleri tanımlamak için yeteneği, hem de bu ihtiva anatomik yapısını sunan seçilen bir promoterin kontrolü altında bir floresan proteini ifade eder.

Çeşitli toksikolojik çalışmalar zaten t kullanmışo ilaç keşfi ve oksidatif stres ^33-35 alanında için bir hayvan modeli olarak, bu omurgalının uygunluğunu gösteren, redoks homeostazı ile ilgili kimyasalların in vivo etkisini değerlendirmek için zebra balığı. Bazı floresan probları Zebra balığı larvaları ^36,37 oksidatif stresi izlemek için test edilmiş olsa da, Zebra balığı dokulardaki oksidatif stres düzeyleri ve yaşam hücreleri algılamak ve ölçmek için hiçbir kurulmuş tahliller vardır. Burada zebrafish embriyoların canlı hücreler oksidatif stres in vivo ölçümü için bir prosedür tarif eder. Görüntüleme araçları, FACS, flüoresan probları ve pro-oksidatif koşullar her zebra balığı embriyolar ve dokularda oksidatif türlerinin saptanması ve miktarının belirlenmesi için basit bir deney oluşturmak için birleştirilir.

Araçların ve Çalışma Çözümleri 1. Hazırlanması

1. Balık su çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su, 50 ml deniz tuzları "Instant Ocean" 2 g eriterek bir stok çözeltisi yapın. Balık suyu (60 ug / ml nihai konsantrasyon deniz tuzu) kullanıma hazır hazırlamak için 1 L damıtılmış su stok balık su 1.5 ml ilave edilir. Kullanımdan önce balık suyu kullanmaya hazır otoklavlayın. Bu çözüm, zebra balığı, embriyo ortamı olarak kullanılır.
2. Embriyo montaj için metilselüloz hazırlayın. Balık steril 50 ml su içinde 1.5 g metilselüloz çözülür. Bir karıştırıcı plaka üzerinde bir mıknatıs kullanılarak erimesini kolaylaştırmak. Tozun tam çözünme birkaç saat gerekebilir. Küçük tüpler içine netlik ve kısım için çözüm kontrol edin. Ay boyunca -20 ° C'de saklayın ve kullanımda alikotları çözülme. Kullanmadan önce, 5 dakika boyunca 950 x g'de santrifüje metilselüloz. Alikotların donma-erime döngülerinden kaçınmak.
3. Tricaine / etil 3-aminobenzoat m, 50 ml hazırlamak100 ml su içinde, 200 mg tricaine eritilmesi ve Tris-HCl, 1 M (pH 9) ile pH 7.0 'ye ayarlanması ile etansülfonat tuzu (stok çözelti). En fazla 30 gün boyunca 4 ° C'de, bu stok saklayın. DİKKAT: tricaine toksiktir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın.
4. Zebra balığı embriyolar oksidatif stres yaratmadan
   1. Genel oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: H ₂ O ₂ stok çözeltisi (hidrojen peroksit, 100 mM) eklenmesi ile oksidan, çözelti 50 ml olun balık su. 2 mM ile 100 uM arasında bir nihai konsantrasyon ₂ H O ₂ kullanın. Kısa bir süre kullanımdan önce bu çözüm hazırlayın. Oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. Bu çözüm saklamayın. DİKKAT: H ₂ O _2, tehlikeli ve solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Yanıcı maddelerle temasında yangına neden olabilir. Davlumbaz altında işlemek ve uygun pers giymekÖnal koruyucu ekipman.
   2. Mitokondri türevi oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir 2 ml rotenone 3.9 mg çözülmesiyle bir oksidan stok çözeltisi (5 mM) olun. Karanlıkta, oda sıcaklığında, bu çözüm tutun.
      1. Çözümü kullanmak için hazır hale getirmek için balık suda 10 ml rotenone stok solüsyonu çözülür. 5-50 uM arasında bir konsantrasyonda rotenon kullanın. 100 uM daha yüksek konsantrasyonlarda rotenon kullanmayın. Uygun konsantrasyonlarda, bu oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. DİKKAT: Rotenone zehirli ve tehlikelidir. Uygun önlem ifadeleri göre tutun.
   3. Gen tarafından oksidatif strese neden knock-down: Knock-down nrf2a gen ifadesini Zebra balığı embriyolarının morfolinodur mikroenjeksiyon tarafından önceden Timme-Laragy A. ve diğerleri, 2012 ³⁸ tarafından bildirilen..
   4. Oxid Inducedoku hasarı sonrası stres Ative:. önceden Niethammer ve ark, 2009 ³⁹ tarafından açıklandığı gibi 72 hpf Zebra balığı embriyolarının kuyruk yüzgecinin bir yara marjı oluşturur.
5. Tek hücre ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlanması:
   1. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi) 'de genel ROS-duyarlı molekül prob eritin: Genel ROS tespiti için çözümü. Bu çözüm, kısa bir süre kullanımdan önce hazırlanmış olmalıdır.
   2. Mitokondri tarafından uyarılan özgü saptama ROS Çözüm: kullanımdan hemen önce, DMSO, 5 mM stok çözelti yapma ile bir mitokondriyal ROS duyarlı probu çözülür. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla HBSS içinde stok çözeltisi çözülür.
      NOT: ROS-algılama çalışma çözümleri ışık ve oksijen maruz kalma ve kendi stok çözümleri kaçının. Kullanılarak ışık tüpü korumakbir alüminyum folyo. Saklamak veya HBSS'de çözülmüş yeniden kullanımı sondalar etmeyin. Bir ay boyunca -20 ° C 'de stok çözelti saklayın.
      DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar ve DMSO'yu tutun.
6. Bütün montaj ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlayın: bir çalışma çözeltisi (: 2,5-5 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (DMSO içinde stabilize edilmiş) genel ROS duyarlı probu stok çözeltisi içinde çözündürülür. Işık ve oksijen maruz kalmaktan kaçınınız. Işıktan tüp koruyun. Kullanmadan önce bu çözüm hazırlayın. Bu çözümü saklamak veya yeniden kullanmayın. DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar taşıyınız.
7. PBS 1x 15 ml cenin sığır serumu 10 mi eklenerek Durdurma Solüsyonu 25 ml olun. Steril çözüm tutun. 4 ° C 'de, bu çözüm Mağaza ROS algılama yöntemi - Bu çözüm sadece tek bir hücre için gereklidir.
8. 28 ve at Zebrafish hava inkübatör ayarlayın# 176; C.
9. Tek hücre ROS-saptama yöntemi boyunca 4 ° C'de santrifüj ayarlayın.

2.. Yetişkin Balıkların Çiftleşme ve Zebra balığı Embriyolar Seçimi

1. Set-up yetişkin zebrabalıkları çifti standart protokollere göre ⁴⁰ haçlar. Spesifik deneysel ihtiyaçlarına uygun olarak, uygun transjenik çizgi seçin.
2. Yumurta toplamak ve balık su / embriyo orta ile 90 mm çanak içine koyun. Embriyolar geliştirmek ve istenilen gelişimsel aşamada büyüyecek kadar 28 ° C'de yumurta tutmak (örneğin, 48 hpf, 72 hpf; hpf: saat sonra döllenme).
3. Embriyoların geliştirilmesi için ekran. Tüm döllenmemiş yumurta veya az gelişmiş embriyolar dışlamak.
4. 50 ml su içinde balık tricaine (stok çözelti) içinde 1 ml ilave etmek suretiyle embriyolar anestezisi.
5. Stereomicroscope altında Tg floresan embriyolar seçin.

Oksidan Agent ile Embriyoların 3. Tedavisi

1. 48 saat arasında en az 30 embriyolar kullanınpf ve 72 farklı durum başına HPF. Tricaine çıkarmak için taze balık iki kere su ile embriyolar yıkayın.
2. Üç yemeklerin içine floresan embriyolar Split. En fazla 30 embriyo / çanak koymak.
3. Yıkama çözeltisini çıkarın ve oksidan, çözelti 10 ml ya da kontrol çözeltisi gibi balık su 10 ml ekleyin.
4. 28 ° C'de 1 saat 10 dakika boyunca inkübe embriyolar Kuluçka süresi, belirli dokularda indüklendiği oksidatif stres düzeyine göre değişir. Oksidatif stres etkilenen hücreleri ilerleyici hücre ölümünü geçmesi gibi kısa dönemler iyisidir.
5. Dönen tarafından HBSS ve yıkama embriyoları içeren yeni bir çanak içine embriyolar transfer. 28 ° C'de önceden sıcak HBSS

4.. Tüm Dağı ROS Algılama Yöntemi

1. Oksidan tedaviden sonra embriyolar toplayın ve küçük bir tüp içinde en fazla 10 embriyolar koydu. HBSS ile mümkün olduğu kadar yıkayın. Alüminyum folyo kullanarak ışık tüpü koruyun.
2. ROS için algılama çözeltisi 1 ml ilave edilirHer bir tüp.
3. Işık maruz kalmasını önlemek için 28 ° C'de 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe embriyolar.
4. Inkübasyon süresi boyunca bütün embriyo analizi için bir cam slayt hazırlar. Bir "depresyon" cam slayt metilselüloz 300 ul koyun ve bir pipet ile cam yüzeye yayılır. Metilselüloz bırakırken kabarcıkları kaçının.
5. İnkübasyon süresi sonunda, hemen ROS algılama çözüm kaldırmak ve 2 ml HBSS ile iki kez yıkayın. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek embriyolar yıkayın. Pipet veya vorteks etmeyin.
6. Kadar cam Pasteur pipet içine aspire embriyolar. Pipet açılışına yakın ve yavaşça pozisyon embriyolar metilselüloz içine bunları çıkarın. Ince naylon hattı ile uygun embriyolar yönlendirmek.
7. Tedavi edilen embriyolar ile embriyo kontrol floresan karşılaştırın. Tüm embriyolar aynı kullanarak görüntülü böylece Alternatif olarak, flöresanlı bir stereomikroskop veya konfokal mikroskop parametrelerini saptamakgörüntüleme ayarları.

5.. Tek Hücre ROS-algılama Yöntemi

1. 3.5: aşama başlatın. Her durum için en az 35 embriyo var emin olun.
2. Yeni bir çanak içine embriyolar aktarın. Balık suya mümkün olduğunca kaldırın. Buz soğukluğunda PBS 1x 10 ml ve Proteaz İnhibitörleri Kokteyl 400 ul ekleyin. Elle forseps ile embriyolar dechorionate ve ince bir iğne ile yumurta sarısı çuval çıkarın. Not: sarısı çuval Çıkarma aşağıdaki FACS analizi için temiz örnekleri sağlar. Bu adım, FACS alet uygun bir biçimde yok edilebilir.
3. Aktarım de-yolked, 24 oyuklu çoklu gözenekli plakanın içine embriyolar (15 embriyo / çukur) ve tüm balık suyu çıkarmak.
4. HBSS 300 ul, 30 ul kolajenaz P, her bir oyuğa 50 ul tripsin-EDTA ekleyin.
5. Sıkı bir pipet (1.000 ul) ile hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı embriyolar homojenize.
6. 20 dakika boyunca 28 ° C'de inkübe edilir ve her 5 dakikada pipetleme örnekleri homojenize edilmiştir.
7. Doku DISR edinbileşik mikroskobunda homojenat bir kısım gözlemleyerek uption. Pipetleme tek hücre süspansiyonu kolaylaştıracak. Fazla 30 dakika boyunca embriyolar inkübe etmeyin.
8. Durdurma Solüsyonu 200 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. Hafifçe pipetleme karıştırın.
9. Dar bir tabana sahip önceden soğutulmuş bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. Buz üzerinde tüp tutun ve ışık maruz kalmaktan kaçının.
10. 4 ° C'de 250 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj
11. Hafifçe pipetleme buz HBSS ile üst faz ve yeniden askıya hücreleri çıkarmak.
12. Hücrelerin sayısı ve sizin tüm örneklerde hücrelerin aynı numara olduğundan emin olun. Az 2 x 10 ⁶ hücre kullanmayın.
13. 4 ° C'de 250 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri
14. Süpernatantı ve ROS duyarlı probu içeren buz gibi soğutulmuş HBSS 1 ml pelet askıya.
15. Karanlıkta 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü. Oksidatif stres seviyesine göre inkübasyon süresi değişebilir ve tProbun o hassasiyeti.
16. Bir FACS tüpü hücreleri aktarın. Buz üzerinde tüpler tutmak ve FACS analizden önce ışık maruz kalmaktan kaçının.
17. Bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) hücreleri sıralar. Tg doku floresan (örneğin, GFP) ve ROS tespiti (örneğin, belirli mitokondriyal ROS-duyarlı sondalar, genel ROS-duyarlı problar) için kullanılan moleküler prob uyarma / emisyon spektrumları uygun set dalga boyları.
18. Her bir durum için, aynı FACS ayarlarını uygulayarak, aynı deneysel oturumdaki tüm örneklerini ölçmek. Farklı biyolojik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak floresan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Her bir durum için en az iki analiz çoğaltır.

Burada anlatılan yöntemi uygulayarak, kolayca ölçebilir ve zebra balığı embriyonik dokularda oksidatif stres (ve ROS seviyelerini) algılar. Yetişkin zebrafish geçtikten sonra, yumurta toplandı ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 28 ° C'de gelişmeye bırakıldı. Güçlü pro-oksidan reaktifleri ile embriyoların 1) tedavi veya doku yaralanma sonrası 2) teşvik ROS oluşumu: oksidatif strese neden amacıyla, iki farklı yaklaşımı öneriyoruz.

Hidrojen peroksit (2 H O 2), genel hücre ROS oluşturan bir madde olarak, ve rotenon, belirli bir mitokondriyal ROS sürücü olarak: ilk yaklaşım olarak, spesifik ihtiyaçlarına göre iki farklı reaktif maddeler kullanılır. Rotenone Deregülasyonlar oksidatif stres 41 uyarıcılarına olan ETC, karmaşık I'in bir inhibitörüdür.

İkinci yaklaşımda ise, biz bir Zebra balığı embriyo kuyruk yüzgecinin bir yara oluşturularak ROS toplanmasına neden39. Alternatif olarak, oksidatif stres koşulları morfolinodur enjeksiyonu ile oksidatif stresin 38 sitotoksik etkilerine karşı primer hücresel savunma Nrf2 antioksidan tepki yolunu aşağı vurma tarafından zebrabalıkları dokularda teşvik edilebilir.

Oksidatif stres zebrafish embriyolar indüklenir sonra, reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikmesidir aktivasyonu üzerine floresan (örn. oksidasyon) olmak genel veya özel mitokondriyal ROS duyarlı problar kullanılarak ölçülebilir.

Tedavi embriyolar bütün montaj ROS algılama yöntemi ile ya da Şekil 1 'de özetlendiği gibi, tek bir hücre-ROS algılama yöntemine göre analiz edilebilir. Yöntemleri arasında seçim oksidatif stres kalitatif ya da kantitatif ölçümü gerçekleştirmek için ihtiyaç dayanır. Her iki yöntemin temsil edici sonuçları Şekil 2'de temsil edilmektedir Şekil 3.

Tüm Dağı ROS-algılama Yöntemi

Şekil 2, oksidatif stres in vivo görüntüleme için bütün montaj ROS algılama yönteminin uygulanmasını göstermektedir. Özel olarak, bu yöntem, eksojen pro-oksidan tedavi yanı sıra yara yaralanma ya da gen silinmesi üzerine daha fazla fizyolojik koşullar tarafından üretilen "düşük" oksidatif stres tarafından oluşturulan "güçlü" oksidatif stres hem de takip uygulanmıştır.

Oksitleyici türlerin fizyolojik düzeylerinin 72 hpf canlı zebrafish embriyo kuyruk fin bir mikro yaralanma ya da geniş bir yara üretilmesi ile uyarılmaktadır. Bu yaralanma sonrası, 2 H O 2 yara 39. sonra yara kenar 20 dakika ile birikir olduğu gösterilmiştir. Yara kenar da oksidatif stresin birikimi görselleştirmek için, embriyolar, genel ile kuluçkalanmıştırROS-duyarlı prob ve 39 yaralama sonra 20 dakika görüntülü. Yaralı kuyrukları ile sağlam kuyruk yüzgeçleri karşılaştırarak, bu yara kenar (Şekil 2A) de flüoresan probun bir birikimi ayırt etmek mümkündür. Spesifik olmayan zayıf ışıklı sinyal her iki durumda da kuyruk dokusu çevresinde saptanır.

Yara kenar da ROS duyarlı probunun özel birikimi, 2 H, yara O 2 seviyeleri doğrulamak amacıyla bir farmakolojik yaklaşım ile düşürüldü. Bu yara kenar H 2 O 2 birikimi duox-engelleyici VAS2870 39 için son derece duyarlı olduğu gösterilmiş olduğundan, embriyolar yaralama önce bu inhibitör ile ön-muamele edilmiştir. ROS duyarlı floresan sondası karşılaştırılması, VAS ön-muamele edilmiş embriyolar ve ilgili kontroller gelen sinyal, ROS birikimi (örneğin, 2 H O 2 bağımlı olduğunu gösterir) (Şekil 2B).

Buna ek olarak, rotenon ile zebra balığı embriyolar işlenmesiyle zebra balığı dokularda oksidatif türlerin yüksek düzeyde oluşturulur. Rotenone ile tedavi edilen kontrol embriyoları ve özellikle ROS türlerin tespit etmek için genel bir ROS duyarlı probu ile inkübe edildi. Daha sonra, sonda yıkanmış ve embriyolar bir floresan-stereo bir mikroskop altında görüntülendi. Oksidatif stres embriyolar (Şekil 2C) bütün vücutta tespit edilmiştir. Yüksek büyütme görsel sonda başarıyla (Şekil 2B) metabolize edilir anatomik bölgelerini gösterir. Floresan görüntüleri (alt paneller) ROS-pozitif hücrelerini işaret ederken Parlak alan görüntüleri (üst panel), anatomik yapıları ayırt. Floresans görüntüleri ile gösterildiği gibi, esas olarak muamele edilmiş embriyoların sonuçları ile kontrol karşılaştırılmasıyla elde edilir oksidatif stres algılama, niteliksel bir rapor bulunmaktadır.

Tek Hücre-ROS Tespit Yöntemi

Şekil 3 raporlar temsilcisi FACS araziler ve tek hücre ROS algılama yöntemi uygulanarak oksidatif stres ölçümü. Bu yöntem, protokolde belirtildiği gibi pro-oksidan koşullarına tabi tutulur ve şekil açıklama ayrıntılı edildi zebra balığı hücrelerinde oksidatif stres seviyesini ölçmek için adapte edilmiştir. Tarif edildiği gibi, oksidatif stres ROS-duyarlı molekül probu ile tek bir hücre içine ayrışmış zebra balığı dokuları inkübe edilerek ölçülmüştür. Ayrışma işlemi ve FACS kendisi hücre hasarına neden olabilir, bu numunelerin analizi sadece "canlı hücreler" oksidatif stres ölçülmesi için kabul edilir olması gerekir. Bu duruma göre, ayrışmış hücreleri "canlı hücre" fiziksel parametrelerin (Şekil 3A) gösteren hücrelerin kısmını seçerek ve (Şekil 3B), ölü hücreleri hariç ile analiz edilir. Bu nedenle, numuneler için nicelendiriliroksidatif stresin ROS duyarlı prob floresansla ve bu GFP (Şekil 3C) için pozitif olarak endojen floresans için uygun. ROS duyarlı probu için negatif bir kontrol numunesi, taşıma ve teknik işlemleri ile uyarılan oksidatif strese değerlendirmek amacıyla dahil edilmelidir (Şekil 3C; paneli: Kontrol -). Bağıl FACS arsa ölçümü farklı biyolojik çoğaltır (Şekil 3D-E) ölçümlerini gösteren histogramlar gösterdi.

Hidrojen peroksit tedavileri üzerine oksidatif stres düzeyi miktarının yanı sıra, bu yöntem nrf2a morphants ve ilgili kontrol (Şekil 3F) bizim bu tür fizyolojik koşullar altında oksidatif stres seviyesini ölçmek için uygulanmıştır.

Ayrıca, mitokondriyal RO bizim bu tür özel ROS duyarlı prob ile tek hücre ROS algılama yöntemi birleştirerekS-duyarlı sondalar, belirli mitokondri hedefli bir pro-oksidan tedavileri (Şekil 3G) bağlamında, oksidatif stres ölçülmesi de mümkündür.

Şekil 1.. Zebra balığı embriyolarının ROS seviyelerini ölçmek için yöntemin şematik figür. Zebra yetişkin uygun yetiştirme tankları kesilmişlerdir. Döllenmiş yumurta sonra tabaklar içine toplandı ve embriyo tam oksidatif stres. Indüksiyonu ilaç tedavileri veya genetik veya fiziksel saldırılar ile ya da, farklı şekillerde elde edilebilir geliştirmesine imkan vermek için 28 ° C'de saklanır. Alternatif olarak, genetik mutant analiz durumunda, bu inkübasyon atlayın ve ileriye taşımak mümkündür. Bu noktada, iki farklı yöntem, aşağıdaki yöntemi izlemek mümkündür. "Yiyecek m göreseviyesini arttırır ROS algılama "yöntemi (sol), zebra balığı embriyolar hemen bir flüoresan ROS duyarlı bir prob (1) ve daha sonra floresan veya konfokal mikroskobu (2) ile analiz ile inkübe edilir. "Tek hücre ROS algılama" yöntemi (sağ) olarak, zebra balığı embriyolar (1), bir flüoresan ROS duyarlı probu (2) ile birlikte inkübe edildi ve floresan tespit ve miktar tayini (3) için FACS ile analiz tek hücrelere ayrıştırılırlar. "Bütün montaj-ROS tespiti" yöntemi öncelikle Nitel analiz, kalitatif ve oksidatif stres düzeyleri kantitatif ölçümleri hem "tek hücreli göre" yöntemi hibe olarak yaşayan embriyolar oksidatif stres olarak algılanmasını sağlar iken.

72 hpf Şekil 2. Bütün montaj ROS-algılama yöntemi Temsilcisi sonuçları. A) Zebra balığı embriyolar tabi tutulduÖnceden ark Niethammer tarafından açıklandığı gibi yaralama için., 2009 39. Temsilcisi konfokal görüntüler yaralı kuyruk yüzgecinin yara marjı pro-oksidatif türleri (ROS) birikimini (ok) göstermektedir. Oksidatif türleri genel ROS probu ile tespit edilmiştir (CellROX, 2.5 uM) 20 dakika sonra yara yapılmıştır. Ölçek çubuğu 20 mikron. B) 72 hpf Zebra balığı embriyolarının yara marjı gösteren Temsilcisi konfokal görüntüler. Yara yapılmıştır önce embriyolar, 90 dakika boyunca VAS2870 (20 uM) veya DMSO ile işlemden geçirildi. Yara sonra 20 dakika; ROS genel bir ROS duyarlı probu (2.5 uM CellROX) ile tespit edilmiştir. Zebra balığı embriyolarının rotenone açtığı oksidatif stresi gösteren ölçek çubuğu 20 mikron. C) Tüm vücut görüntüsü. Oksidatif stres, kuvvetli şekilde Panel D'de gösterilen embriyoların) kaudal bölgesinde saptanır. Rotenone esas Skel etkileyen mitokondriyal ETC güçlü bir inhibitörü olanZebra balığı diğerleri kas hücreleri. Ölçek çubuğu, 180 mikron.

Şekil 3,. Tek hücreler ROS-saptama yöntemi temsil edici sonuçları. A) zebrafish embriyo tipik bir örneğini gösteren Örnek FACS arsa tek hücrelere ayrışmış. Canlı hücreler FSC-H ve SSC-H parametreleri ile göre R1 bölgede Geçitli. SSC-H: 539 (Gerilim), 1.0 (AmpGain) Modu: doğrusal; FSC-H:. Zebra balığı embriyolarının tipik bir örneği gösteren E00 (Gerilim), 2.1 (AmpGain) B) Temsilcisi FACS arsa tek hücrelere ayrışmış. FACS analizinden önce, numune, Propidium iyodür ile inkübe edilmiş olan (PG, 1 ug / ml) 5 dakika boyunca. Ölü hücreler PI floresan (FL2-H kanal) ile göre R2 bölgeye Geçitli. FSC-H: E00 (Voltaj), 2.1 (AmpGain) Modu: doğrusal, SSC-H: 539 (Gerilim), 1.0 (AmpGain) Modu: liyakın. Gerilim Kanallar: FL-2:. Gösteren 613 Log C) Temsilcisi FACS araziler pro-oksidan tedavi (H 2 O 2) ve ilgili kontrollere tabi Zebra balığı embriyolar ayrışmış. Endotel hücreleri GFP kanalı tarafından görüntülenmiştir. FACS araziler UL ve UR ​​oksidatif stres (ROS) tarafından etkilenen tüm hücreleri temsil eder. Negatif hücreler alt çeyrek (LL ve LR) üzerine çizilir. Tg (Kdrl: GFP) 48hpf de s843 zebra balığı embriyolar, 10 dakika için bir kontrol olarak, H2O 2 (2 mM) ve H2O ile inkübe edildi. Protokolde tarif edildiği gibi FACS analizinden önce, embriyolar işlenir. Oksidatif stres etkilenen hücreler genel bir ROS duyarlı flüoresan probun (, 2.5 uM CellROX) kullanılarak tespit edilir. ROS duyarlı probu ile inkübe olmayan bir numune, negatif kontrol olarak dahil edilmiştir. Ilgili kontrol ile pro-oksidan işlemine tabi örnek karşılaştırıldığında, hücrelerin sayısı, üst çeyrek (UL + UR) üzerine çizilen yüksektir. FACS müktesebataşağıdaki gibi enfraruj ayarları vardı: Gerilim kanalları: FL-1: 582 Log; FL-4:. H 2 O 2 ile tedavi edilen embriyolar ve ilgili kontrol oksidatif stres etkilenen hücrelerin yüzdesini (UL + UR) gösteren 410 Log D) Histogram. Ölçümler C'de gösterilen örnekler ile ilgilidir. Oksidatif stres etkilenen hücreler genel bir ROS duyarlı flüoresan probun (, 2.5 uM CellROX) kullanılarak tespit edilir. Sonuçlar, H2O 2 ile tedavi edilen embriyolar ve ilgili kontrol oksidatif stres (ROS +) etkilenen endotel hücrelerinin yüzdesini (GFP +) gösteren SD. E) Histogram ± n = 2 farklı biyolojik çoğaltır ortalamasıdır. Ölçümler C'de gösterilen örnekler ile ilgilidir. Sonuçlar, n = 2 nrf2a morphants oksidatif stres (ROS +) etkilenen hücrelerin yüzdesini (nrf2a MO) gösteren SD. F) Histogram ± farklı biyolojik tekrarlanmış ve ilgili kontrol ortalamasıdır24 hpf (ctrl MO). 72 hpf DMSO), 10 uM) ve ilgili kontrolleri (Ctrl;. Sonuçlar muameleye tabi tutulan embriyolarda mitokondriyal oksidatif stres etkilenen hücrelerin yüzdesi (SD Rotenone arası G) Histogram ± n = 2 farklı biyolojik çoğaltır ortalamasıdır. Bir hücre içine embriyo ayrıldıktan sonra, mitokondriyal oksidatif stres (mitokondriyal ROS +), bir mitokondriyal spesifik sonda (, 5 uM MitoSOX) ile ölçüldü. Sonuçlar ± SD n = 3 farklı biyolojik çoğaltır ortalamasıdır.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.