Burada canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi ölçmek için bir protokol bildiriyoruz. Bu prosedür, hem tüm embriyo dokularında hem de tek hücreli popülasyonlarda reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespitine izin verir. Bu protokol hem kalitatif hem de kantitatif analizleri gerçekleştirecektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Reaktif oksijen türlerinin (ROS) yüksek düzeyde oksidatif stres durumuna karşı hücresel redoks durumunda bir değişikliğe neden olabilir. Bu durum, moleküllerin (yağ, DNA, protein) oksidasyonuna neden olur ve hücre ölümüne yol açar. Oksidatif stres de etkiler, diyabet, retinopati, nörodejenerasyon ve kanser gibi çeşitli patolojik koşulların ilerlemesi. Bu nedenle, tek hücre düzeyinde değil, aynı zamanda bütün organizmaların bağlamında sadece oksidatif stres koşulları araştırmak için araçlar tanımlamak önemlidir. Burada, bu tür çalışmalar gerçekleştirmek ve in vivo oksidatif stresi ölçmek için bir protokol mevcut in vivo sisteminde yararlı olarak Zebra balığı embriyo düşünün. "I) oksidatif stres nitel ölçümü için" bütün embriyo ROS-algılama yöntemi "ve ii): floresan ROS prob ve zebra balığı transgenik floresan hatlarının yararlanarak, in vivo oksidatif stresi ölçmek için iki farklı yöntem geliştirmekoksidatif stres kantitatif ölçümleri için, tek hücreli bir ROS algılama yöntemi ". Burada, oksitleyici maddeler ve fizyolojik ya da genetik yöntemlerle dokularda oksidatif stresi artırarak bu işlemlerin etkinliğini göstermektedir. Bu protokol, ileri genetik ekranlar için müsait olan ve bu tür nörolojik bozukluklar ve kanser gibi oksidatif stresle ilgili patolojiler hayvan modellerinde ROS adresi neden-sonuç ilişkilerini yardımcı olacaktır.
Giriş
Oksidatif stres özellikle dengesiz hücresel redoks durumundan kaynaklanan bir durum olarak tanımlanır. Rutin hücrelerin içinde meydana kompleksinin redoks reaksiyonları hücresel redoks-durumunu belirlemek. Redoks reaksiyonları azaltma ve molekül (yani redoks reaksiyonları) oksidasyonunu üreten biyolojik moleküllerin atomları arasında elektron transferinde oluşan, kimyasal reaksiyonlar oluşur. Bu reaksiyonlar, bir uç yapı kararsızlık ve komşu biyomoleküllerle alışverişi dengesiz elektron kendiliğinden aktivasyonu ile karakterize edilir elektronik aktif bir tür (örneğin pro-oksidatif türleri) ile katalize edilir. Bu düzensiz reaksiyonlar DNA hasarı, p....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Araçların ve Çalışma Çözümleri 1. Hazırlanması
- Balık su çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su, 50 ml deniz tuzları "Instant Ocean" 2 g eriterek bir stok çözeltisi yapın. Balık suyu (60 ug / ml nihai konsantrasyon deniz tuzu) kullanıma hazır hazırlamak için 1 L damıtılmış su stok balık su 1.5 ml ilave edilir. Kullanımdan önce balık suyu kullanmaya hazır otoklavlayın. Bu çözüm, zebra balığı, embriyo ortamı olarak kullanılır.
- Embriyo montaj için metilselüloz hazırlayın. Balık steril 50 ml su içinde 1.5 g metilselüloz çözülür. Bir karıştırıcı plaka üzerinde bir mıknatıs kullanılarak erimesini kolaylaştırmak. Tozun tam çözünme birkaç saat gerekebilir. K....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada anlatılan yöntemi uygulayarak, kolayca ölçebilir ve zebra balığı embriyonik dokularda oksidatif stres (ve ROS seviyelerini) algılar. Yetişkin zebrafish geçtikten sonra, yumurta toplandı ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 28 ° C'de gelişmeye bırakıldı. Güçlü pro-oksidan reaktifleri ile embriyoların 1) tedavi veya doku yaralanma sonrası 2) teşvik ROS oluşumu: oksidatif strese neden amacıyla, iki farklı yaklaşımı öneriyoruz.
Hidrojen peroksit (2 H O 2), gene.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kritik Adımlar
Burada tarif zebra balığı embriyolar oksidatif stres saptanması için prosedür, iki farklı yöntem ihtiva eder. Tek hücre ROS-saptama yöntemi (Şekil 1), daha özel niceliksel ölçümlerini sağlar iken bütün montaj ROS-saptama yöntemi, esas olarak ROS-nitel olarak saptanması için bir deneydir. Her iki yöntem de Zebra balığı embriyolarının üzerinde in vivo ROS-algılama değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yol sunar. Ancak, her ikisi bazı kritik adımlar mevcu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Massimo Santoro laboratuvarındaki destek HFSP, Marie Curie Action, Telethon ve AIRC'den geliyor. Dafne Gays ve Emiliano Panieri'ye makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hidrojen peroksit çözeltisi | SIGMA | 516813 | DILÜITLERI SAKLAMAYIN |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi 1x | GIBCO | 14025 | |
| Metil selüloz | SIGMA | M0387 | |
| Anında Okyanus Akvaryumu Deniz Tuzu Karışımı | ANINDA OKYANUS | SS15-10 | |
| Trikain | SIGMA | A5040 | |
| Cgeneric ROS'a duyarlı prob: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
| Mitokondriye özgü ROS'a duyarlı prob: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | bir şişeyi 13 & mu ile çözer; l DMSO |
| Hidroetidin | INVITROGEN | D23107 | |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | DMSO'da 5 mM stok çözeltisi hazırlayın. |
| Dimetil sülfoksit | SIGMA | D2650 | |
| VAS2870; 3-Benzil-7- (2-benzoksazolil) tiyo-1,2,3-triazolo (4,5-d) pirimidin | EnzoLifeScience | BML-EI395 | tozu DMSO'da çözer; balık suyunda diluit |
| Propidium İyodür & | Moleküler problar (Yaşam Teknolojileri) | P3566 | |
| 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) | Moleküler problar (Yaşam Teknolojileri) | A1310 | |
| Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref | : Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID: 12167159) |
| Kollajenaz P | ROCHE | 11213857001 | Tozu steril HBSS'de 100 mg / ml'de çözün. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
| Fetal Sığır Serumu | GIBCO | 10082-147 | |
| Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri | ROCHE | Bir tableti 1 ml suda | |
| çözün %0.5 Tripsin-EDTA (10x), fenol kırmızısı yok | GIBCO | 15400-054 | Kullanmadan önce 1x çalışma solüsyonu hazırlayın |
| Bileşik mikroskop ve nbsp; | ZEISS | ||
| Stereo mikroskop | Nikon | AZ100 | |
| Fotoğraf Makinesi | Floresan | AxioCamMRm | |
| yazılımı | ZEISS | ZEN 2011 | |
| Floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı | BD FACSCalibur | ||
| Santrifüjü | Eppendorf | 5417R | |
| FACS tüpleri | BD | 342065 | |
| Çok Kuyulu Plaka | BD Falcon | 353047 | |
| Sterilize edilmiş, işlem görmemiş Petri kapları 90 mm | VWR | 391-1915 | |
| Konfokal mikroskop | Leica | Leica SP5 |
Kaynaklar
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
- Chen, A. F., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
