Yöntem makalesi

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

DOI:

10.3791/51356

⸱

17 Nisan 2014

 ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-910, Aix-Marseille University, 2Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro protokol embriyonik veya pluripotent kök hücre-türevlerinin kaderini test edilmesi zorunlu olarak in vivo potansiyel yansıtmaz tartışmalı sonuçlara yol açmıştır. Tercihen, bu hücreler, belirli bir fenotip elde etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmelidir. Ayrıca, boya veya retroviral vektörler ile hücrelerin etiketlenmesi sonra fare çalışmaları izleme hücre soyu hala az gelişmiş organları ile erken evre fare embriyoları çoğunlukla sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaları aşmak için, E9.5 ve gelişiminin sonraki aşamalarında fare embriyosunda kalp hedeflenen bölgelerde çeşitli maddeler enjekte etmek, standart ve ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokolleri tasarlanmıştır. Embriyonik eksplant ya da embriyolar ya da daha fazla kültürlendi utero geliştirmeye bırakılır. Bu maddeler, fluoresan boyalar, virüs, shRNAs veya hücre-türevi projenitör hücrelerini içerir. Bizim yaklaşımlar fu korunması için izinorganın nction göçünü ve işaretlenmiş ve / veya enjekte edilen hücrelerin kaderini gözlenerek. Bu teknolojiler diğer organlara uzatılabilir ve gelişim biyolojisinde önemli biyolojik soruları için çok yararlı olacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha on yıl önce, insan embriyonik kök hücreleri (HuESCs) insan blastosistlerin 1 elde edilmiştir. O zamandan beri, bu hücreler, insan gelişim biyolojisi karşılanmamış sorular adresleri önemli bir araştırma alanının konusu haline gelmiştir. HuESCs ayrıca rejeneratif tıpta umut sağladı. Son yıllarda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 2 genetik hastalık modelleri sağlayan, hastaya özgü somatik hücrelerinden elde edilmiştir. Kalp soy 3 de dahil olmak üzere çeşitli hücre soyları, doğru ya da embriyonik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin farklılaşması için in vitro protokol birçok rapor edilmiştir. Farklı....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Hazırlık

Hayvan Prosedürleri

Bir hayvan etik kurul onay almak ve virüs ile çalışmak için kurumsal yönergeleri izleyin, HuESC ve / veya iPSC (varsa) yanı sıra, fare kullanımı, fare embriyo elde edilmesi, ve fare ameliyat. Zamanlı eşleştirmesi için, tıpanın gün embriyonik gün (E) 0.5 / 0.5 gün post-coitum olarak kabul edilir.

  1. Mikroenjeksiyon iğneler:
    Ex utero mikroenjeksiyon için, 1 ya da 10 mikron iç uç çapını ve sırasıyla, DNA veya hücreleri enjekte etmek için keskin ve konik ucu şeklini almak için bir pipet çektirmenin / beveller kullanılarak cam pipetler (1.2 mm dış çaplı boros....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tarif edilen enjeksiyon protokolleri kullanılarak, hücreler, 'etiketlenmiş ve / veya embriyonik fare kalp içine enjekte edilebilir. Kavramının kanıtı olarak, birkaç örnek enjeksiyon protokolü ve ex vivo AVC eksplant, izole edilmiş kalp veya bir bütün olarak embriyo kültürü (Şekil 1) bir araya getirilmiş olduğu gösterilmiştir.

Şekil 1, hücre enjekte edilmeden önce embriyonun hazırlanışını göstermektedir. Yumurta sarısı kese (Şekil 1A.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tarif edilen intra kardiyak ex vivo enjeksiyon protokolleri orta aşama (E9.5-E11.5) fare embriyo en az 48 saat boyunca miyokard fonksiyonu korumak için tasarlanmıştır. Bu enjeksiyon yaklaşımlar DNA ya da hücre konumsal hedeflenen enjeksiyon için izin verir. Şekiller 1-3 de gösterilen birkaç örnek ex vivo ve bu endokardiyal veya epikardiyal hücre EMT olarak kısıtlı kalp bölgelerinde yer alan gelişimsel süreçlerinin vivo moleküler mekanizmalar tasvir konseptini.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Vakfı Leducq (Mitral) ve Agence Nationale bu araştırmalara fon la Recherche (ANR Specistem hibe) dökün kabul.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Setups/Donanım
40 MHz DönüştürücüVisualSonicsMS550S
Mikroenjektör VisualSonics
Mikroenjektör Eppendorf5242
Mikromanipülatör Eppendorf5171
Enjektörü basınçlandırmak için gerekennitrojen
Ray sistemiVisualSonics
inkübatörün içindeki embriyolarla cam tüpü döndürmek için
Standart inkübatör% 5 CO2< / sub>, 37 & 176; C
stereomikroskopZeissKeşfi. V8
Vevo 2100VisualSonics
Mikroenjeksiyon
Borosilikat kılcal borularDünya Hassas EnstrümanKTW-120-61.2-μ m dış çap
Pipet çektirmeSutterModel P87
Mikroenjeksiyon iğneleriOrigio-HumagenC060609OD/ID 1,14 mm/53 mm, 50/35 & mu ile; m OD / ID ucu
Hamilton şırıngaları ve nbsp;
Petri kapları10 cm çap
Mineral yağSigmaM8410
Silikon membranVisualsonics4,3 x 4,3 cm
Play-Doh
IsofluraneVet Bir
tüy dökücü madde Nair
Eye yağlayıcıOptixcare31779
Elektrot jeli (Signa)Parker
SutureSofsilk 5-0S1173
Ultrason jeliAquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorfin hidroklorür)Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.NDC 12496-0757-1tuzlu suda 0.05-0.1 mg
< güçlü>Diğer< / güçlü >
Silikon ElastomerDow CorningSylgard 184
Cam petrisaplarGüzel Bilim Aletleri60 mm çap
Böcek pimleriGüzel Bilim Araçları26002-20
< güçlü > Medya ve kültür reaktifleri< / güçlü>
Optimem ortaYaşam Teknolojileri51985026
M2 ortaSigmaM7167
Dulbecco' s Eagle MediumLonzaBE12-640Fyüksek glikoz ve% 50 sıçan serumu
M16 ortaSigmaM7292
Sıçan serumuJanvierODI 7158
Pennicilin / streptomisinYaşam Teknolojileri15140-12
oksijen %40Embriyo kültür ortamını oksijenlendirmek için gerekenhava sıvısı
Fetal buzağı serumuFisherRVJ35882
MatrigelBD356230
Kollajen tip IBD354236eksplant kültürü için kültür kaplarını kaplamak için
Kültür kaplarıDutcher / Turuncu131020
Enjekte eder< / güçlü >
CDCFDA-SEİnvitrojen / Moleküler ProblarC116525 mg / ml DMSO. -20 & # 176; C'de saklayın Kullanmadan önce 1: 100-200 oranında tuzlu su ile seyreltin.
PGK-GFP eksprese eden lentivirüs ~8E9 dönüştürücü birim/ml DMEM
Lipofektamin 2000Yaşam Teknolojileri11668019
döndürücü,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre EnjeksiyonuUltrason Arac l MikroenjeksiyonFloresan BoyalarKonfokal MikroskopiKardiyak Geli imK k H cre T revleriEpitelyal Mezenkimal Ge iIn Utero K lt rH cre Soy Hatt zleme

İlgili makaleler