Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Özet

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Özet

Birkaç yıl önce, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kurulması biyomedikal yeni bir dönem başlatmıştır. Insan iPSCs potansiyel kullanımları, insan genetik hastalıklarının modellenmesi patogenezi, gen düzeltme sonrası otolog hücre tedavisi ve hastaya özgü ve belirti gerekli hücrelerin bir kaynağı sağlayarak kişiselleştirilmiş ilaç tarama içerir. Ancak, bu tür bir insan iPSCs üretim sonrası kalan yeniden programlama faktörü transgen ekspresyonunu ortadan kaldırarak üstesinden gelmek için çok engel vardır. Daha da önemlisi, farklılaşmamış insan iPSCs kalıntı transgen ifadesi doğru farklılaşmaları engel ve hastalıktan ilgili vitro fenotiplerinde yorumunu şaşırtıp-saptırırlar olabilir. Bu neden ile, entegrasyon içermeyen ve / veya transgen içermeyen insan iPSCs adenovirüs, piggyBac sistemi minicircle vektör epizomal vektörler, direkt protein temini gibi çeşitli yöntemler kullanılarak geliştirilmiş ve mRNA sentezlenmiştir. Bununla birlikte, reprogra etkinliğientegrasyon-ücretsiz yöntemlerle features çoğu durumda oldukça düşüktür.

Burada, Sendai-virüsü (RNA virüsü) tabanlı yeniden programlama sistemi kullanarak insan iPSCs izole etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, yeniden programlama tutarlı sonuçlar ve düşük maliyetli bir şekilde yüksek bir verimlilik göstermektedir.

Giriş

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ilaç taraması için, hastalık modelleme için potansiyel olarak yararlı olabilir ve hastalık ve doku yaralanmaları tedavi etmek için hücre tabanlı tedaviler geliştirmek için kendini yenilemek in vitro ve sahip pluripotensin bir kapasiteye sahip. Ancak, HESC çünkü, immünolojik onkolojik ve etik engellerin hücre replasman tedavisi için bir sınırlama var, ve hastalık ile ilgili genlerin çalışma, hastalığa özgü HESC pre-implantasyon genetik tanı (PGD) yaklaşımları ile izole edilebilir, ama yine de teknik açıdan zor ve embriyo bağışlar oldukça nadirdir. Bu sorunlar, uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) gelişmesine yol açmıştır kök hücre biyolojisi, ilerleme ile ilgilidir.

İnsan iPSCs genetik yetişkin insan somatik hücrelerinden yeniden programlanan ve onları böyle d gibi rejeneratif tıp için yararlı bir kaynak yapar HESC benzer pluripotent kök hücre benzeri özellikler, liman vardırhalı keşif, hastalık modelleme ve hastaya özgü şekilde ^1,2 hücre tedavisi.

Bugüne kadar, virüs aracılı (retrovirüs ve adenovirüs) dahil olmak üzere insan iPSCs oluşturmak için çeşitli yöntemler, ^3, non-virüs aracılı (BAC sistemi ve vektörler transfeksiyon) ⁴ gen transdüksiyon ve protein dağıtım sistemi ^5-7 vardır.

Virüs-aracılı gen iletim verimliliği belirli bir düzeyde olmak, ancak bunlar, kontrolsüz bir şekilde yeniden programlama genleri ifade etmek için bir ev sahibi kromozomları içine entegre, çünkü viral vektörler, genetik iz bırakabilir. Transkripsiyon faktörlerinin viral entegrasyonu etkinleştirmek veya konak genleri ⁸ inaktive olabilir bile, bu beklenmedik bir genetik sapma ve tümörgenez ^5,9 riskini neden olabilir. Öte yandan, somatik hücrelere protein veya RNA doğrudan katılması bildirilmiştir, ancak bu emek-yoğun, tekrarlı transf gibi bazı dezavantajları vardır edildiection ve ^7,10 yeniden programlama düşük seviyesi. Hatta epizomal olmayan entegre adenovirüs, adeno-bağlantılı virüs, ve plasmid vektörler yine ¹¹ göreli olarak daha az verimlidir. Bu nedenlerden dolayı, iPSC nesil yüksek etkinlik ve daha az genetik anormallikler olmayan entegrasyon yeniden programlama yöntemlerini seçmek için makul. Bu çalışmada, bir-Sendai virüs esasına dayalı yeniden programlama kullanın. Bu yöntem, konakçı genomuna entegre olmayan ve tutarlı bir şekilde, transgen entegrasyon olmadan insan iPSCs üreten olduğu bilinmektedir.

Protokol

1.. Hücre hazırlanması ve Ortam (Gün 1)

1. Kültür ve DMEM ortamı,% 10 FBS ihtiva eden insan fibroblast genişletmek.
2. Plaka insanlara özgü fibroblastlar; transdüksiyon bir gün önce oyuk başına uygun bir yoğunlukta bir 24-yuvalı plaka üzerine (Şekil 1).
   NOT: farklı hücre tipleri farklı bağlanma yeteneği var çünkü şu seri seyreltme (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ve 6.25K) önerilir.
3. Hücreler tamamen yapışmış ve genişletmiştir sağlanması, bir 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde bir gün için hücreler inkübe edin.

2.. İletimi yapın (2. Gün)

1. Transdüksiyon gününde, hücre yoğunluğunu kontrol etmek ve en etkin yoğunluğu kuyu (Şekil 2) seçtik. Yüksek (80 ~% 90), orta (50 ~% 70) ve düşük (20 ~ 40%): Bu üç farklı yoğunlukları almak daha iyidir.
2. En az 1 saat önce transdüksiyon, fibrobl aspireast hücrelerden ortam ve fibroblast ortamın yeni bir 300 ul değiştirin.
3. -80 ° C depolama 4 farklı Sendai virüs tüplerin bir set çıkarın. Birkaç saniye için bir 37 ° C su banyosu içinde, aynı zamanda, her tüp çözülme ve sonra su banyosundan tüpleri alır. Daha sonra, oda sıcaklığına kadar bunları çözülme; santrifüj 10 saniye boyunca 6.000 xg'de tüpler ve kullanıma kadar buz koyun. -Donma yeniden ve titreleri korumak değil çünkü virüs cozundurmeden.
4. Mikro santrifüj tüpüne dört Sendai virüsü boruların (Ekim-4, Klf-4, c-Myc ve Sox-2) her birinin, belirtilen miktarlar ekleyin. Çözelti hafifçe pipetleme iyice karıştırılır olduğundan emin olun.
   Örneğin, transdüksiyon için 24 oyuklu plaka içinde LOOKWELL 50K hücre / bir de:
   (Life Technologies Analiz Sertifikalarını dayalı Titer, partiden diğer partiye farklı olabilir)
   Tüp hOct-4 = 6.0 x 10 ⁷ UKÜ, 3 İçişleri Bakanlığı 5 ul =
   Tüp hSox-2 = 6.5 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4.6 μ; L
   Tüp hKlf-4 = 6.3 x 10 ⁷ UKÜ, 3 İB = 4.8 ul
   Tüp hc-Myc'nin = 7.8 x 10 ⁷ UKÜ, 3 İB = 3.8 ul
   Toplam = 24 oyuklu plakanın dört virüs faktör karışımı / bir de (50K hücreleri) 18.2 ul
5. Hücre yoğunluklarına göre; 2X, 1X ve kuyunun içine virüs karışımı 0.5x hacim eklemek. Yavaşça, plaka önden arkaya sallayın sol ve sağ (2X: virüs karışımı, 1X 36.4 ul: 18.2 ul ve 0.5x: 9.1 ul).
6. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatöründe hücreleri koyun ve bir gece boyunca inkübe edilir.

3.. Kültür Orta Değiştirme (Gün 3 & Day 5)

1. 24 saat transdüksiyon sonra, 500 ul taze fibroblast ortam ile orta yerine.
2. 5. günde, taze fibroblast medya ile Orta değiştirin.

4.. Co-kültür için MEF Yemekleri hazırlayın (Gün 8)

1. % 10 ile 60 mm kültür tabaklarında MEF hücreleri hazırla FBS DMEM ortamı bir da ihtivaMEF besleyici-hücreleri üzerine transdüse fibroblast pasaj önce y.
   Not: Her 60 mm çanak MEF 5 x 10 ⁵ kullanıyorsunuz.

5.. Başlangıç ​​Co-kültür MEF besleyici hücreler (Gün 9) ile Hücreleri kalıt

1. Transduced hücreleri kaplama önce, aspirat% 10 FBS MEF besleyici yemekler DMEM ortamı bulunan ve FBS DMEM ortamı ihtiva eden taze% 10 ekleyin.
2. 24 oyuklu bir plaka içerisinde olan ve D-PBS ile bir kez yıkama hücreleri transduse fibroblastlardan orta çıkarın. 24-çukurlu plaka inthe fibroblast hücreler içine% 0.25 tripsin / EDTA, 200 ul ekleyin. Hücreler plakadan kopmaya başladığından zaman tripsin / EDTA, birlikte en az 5 dakika inkübasyondan sonra, 15 ml konik bir tüp içinde büyüme ortamı ile hücreleri toplamak. Daha sonra 4 dakika boyunca 6,000 x g de santrifüj.
   NOT: 2X, 1X ve 0.5X virüs Havuzlanması transdük fibroblast tavsiye edilir.
3. Süpernatan Ortamı çıkarın ve yeniden askıya yıkamatripsin ile nötrleştirme için taze ortam fibroblast 4-5 ml hücre topağı. Daha sonra 4 dakika boyunca 135 x g'de santrifüj.
4. Örneğin 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 ve 1/128 60 sayısı: seri seyreltme yoğunluğu olarak ve MEF üzerine fibroblast ortam ile birlikte kültür için başlangıç ​​Plaka hücreleri mm çanak. Transdüksiyon ilk haftasında hücre ölüm oranı ile ilgili olarak, bir 1/2 veya 1/128 yoğunluğa seyreltilmesi gerekmeyebilir. Transgen RT-PCR için bir pozitif kontrol olarak, toplam RNA çıkarmak için bir kenara kalan hücrelerin koyun.
5. % 5 _CO2 inkübatör gece boyunca, 37 ° C'de 60 mm yemekler yerleştirin.

6.. İnsan Embriyonik Kök Hücre Orta Yem ve Hücreleri (Gün 10) Monitör

1. Ertesi gün, 10 uM Y-27632, insan ES ortama fibroblast ortamı değiştirmek. Bundan sonra, insan ES ortamı ile günlük orta değiştirin: 800 ml DMEM/F12 + 200 mi Knockout Serum Replacement + 10 ml L-glutamin, 10 mM + 10 minimum MEM esansiyel olmayan amino asitler miTemel Fibroblast Büyüme Faktörü 2-mersaptoetanol + 10 ng / ml + 1 ml.
2. Taze insan ES medya ile bir günlük medya değişiklik yapmak. Bir hafta sonra, koloni ES-benzeri hücre kümeleri oluşumu için bir mikroskop altında bir kez toplam 2 ~ 3 gün bulaşıkları kontrol edin. Koloniler bulundu önce hücre tipine bağlı olarak, kültür daha çok veya daha az zaman alacaktır.

7. Uyarılmış pluripotent hücre kolonileri Kök ve Hücreleri genişletin Toplama (Gün 20 ~)

1. Üç hafta sonra, transdüksiyon, koloni toplama için uygun yetiştirilen görünmelidir.
2. Koloni toplama bir gün önce, 24 oyuklu bir plaka içerisinde MEF besleyici hazırlar.
   NOT: Biz bir 24-plaka içinde MEF 12.5 x 10 ⁵ kullanıyorsanız.
3. Ertesi gün, 10 uM Y-27632, insan ES ortama fibroblast ortamından MEF yemekler orta değiştirin. Elle toplama başlığı içinde mikroskop altında her zaman bir koloni almak ve pipetleme küçük kümeleri yapmak ve bunları aktarmakyeni birçok klon almak için MEF dishes.Try hazırlanan üzerine.
4. Geçidi ve başlangıçta bir 6 yuvalı plakaya bir 24-çukurlu plaka her bir genişletme. Daha sonra, 6-çukurlu plaka yayılımıyla önce, 60 mm tabaklar için.

(10 geçiş sonrası) İnsan iPSCs 8. Karakterizasyonu

1. İmmünofloresan
   1. Günde ortam değişikliği ile 4-5 gün boyunca 24 oyuklu plaka ve kültür Plate insan iPSCs.
   2. Imüno-flüoresan deneyi çalıştırmak için, bir kere D-PBS ile plakayı yıkayın. Daha sonra 30 dakika boyunca% 0.4 paraformaldehid içinde hemen hücreleri gidermek. Daha sonra 5 dakika süre ile D-PBS içinde üç kez yıkayın.
   3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 çözeltisi ile işlem görmüş hücrelerin tedavi.
   4. Permeablization çözeltisi (% 0.1 triton X-100 çözeltisi) aspire, daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.5 BSA bloke çözeltisi ilave edilir.
   5. Nanog'un, Ekim-4, SSEA (evre özgü embriyonik ANTIG bir algılama gerçekleştirinen) ve TRA-1-81,% 0.5 BSA çözeltisi içinde bir anti-insan antikoru kullanılarak (tümör rejeksiyon antijen) (antikor seyreltme oranı için malzeme tablosunu kontrol edin). Oda sıcaklığında 2 saat için primer antikor inkübe edin. Daha sonra 5 dakika her biri için D-PBS içinde üç kez yıkayın.
   6. Oda sıcaklığında% 0.5 BSA çözeltisi içinde 1:2,000 seyreltilmiştir ^2. antikor olarak Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG antikorları ile inkübasyondan 1 saat sonra floresan mikroskobu kullanılarak kontrol edin. DAPI ile her bir besleyici hücreleri ve MEF hiPSCs tüm çekirdek Leke.
2. Transgen Teyit RT-PCR
   1. RNA ekstraksiyon reaktifleri kullanılarak hücre pelletinden toplam mRNA ekstrakte edin.
   2. Ters transkriptaz ile PCR amplifikasyonu için toplam RNA ve elde edilen cDNA alikotları üzerinde bir ters transkripsiyon (1 ug) yapın.
   3. CDNA şablon 2 ul, 2x PCR Master Mix 10 ul, primerler 2 pmol 2 ul içeren PCR karışımları hazırlamak(Ileri: 1 ul ve ters: 1 ul) ve DW 6 ul. Tablo 1 'de sıralanan primerler ile RT-PCR yapmak, gen ekspresyonunu tespit etmek için.
   4. Amplifikasyon reaksiyonları verimliliği için bir kontrol olarak, GAPDH geni ile RT-PCR'ler gerçekleştirin. Görselleştirme ve% 1 agaroz jel elektroforezi ile analiz PCR ürünü.

Sonuçlar

Genellikle enfekte fibroblastlar Sendai virüs iletiminde sonra birkaç gün içinde herhangi bir morfolojik değişiklik görünmüyor, ancak beş gün sonra, farklı şekiller (Şekil 1) sahip başlar. Şekil 1, bir sağ panelde tarif edildiği gibi, hücreler, daha fazla tipik fibroblast morfolojiye sahip değildir. Bunlar sitoplazmada daha yuvarlak bir şekil ve büyük çekirdeği vardır. Transdüksiyon% 80 hücresel confluency gerçekleştirildiğinde bile onlar yeniden programlamak başladıktan sonra onlar kuy...

Tartışma

HiPSCs insan somatik hücreleri yeniden programlama temel biyoloji, kişisel tıp ve transplantasyon ¹² görülmemiş sözleri tutar. Daha önce, insan iPSC nesiller gibi ilaç geliştirme ve nakli tedavileri ¹³ gibi diğer klinik uygulamaları sınırlandıran istenmeyen genetik mutasyonlar oluşturabilir konakçı genomu içine entegrasyon riski DNA virüsü gereklidir. Bu nedenle birlikte, birçok çalışmada çeşitli alternatif yöntemlerle vektör ve transgen-free sistemi, insan iPSCs oluşturmak için rapor edilmiştir, a...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CytoTune-iPS Yeniden Programlama Kiti	Invitrogen	A1378002
CF-6, MEF'ler, neomisin dirençli, mitomisin C ile tedavi edilmiş	Küresel kök	GSC-6105M	5 x 105< / sup> / 6 cm veya 12,5 x 105< / sup> / 24 kuyulu plaka
Tripsin EDTA 4Na ile% 0.25 Tripsin 1X	Invitrogen	25200114
DMEM / F-12 orta	Invitrogen	11330-032
24 oyuklu Hücre Kültürü Plakası, kapaklı düz tabanlı	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (Stok: 10 mM)
temel fibroblast büyüme faktörü	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stok: 100 ug)
Nakavt serum replasmanı	Gibco	10828028
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), sıvı (yüksek glikoz)	İnvitrojen	11965118
Fetal sığır serumu	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamin-200 mM (100X), sıvı	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Merkaptoetanol (1.000X), sıvı	GIBCO	21985023	1/1.000
Hausser Faz Kontrast Hematitometreleri	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax %0.1 Jelatin	Çözeltisi Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Hücre Sinyali	4745S	1/200
fare monoklonal Oct4 antikoru	Santa Cruz	SC-5279	1/1.000
Nanog Ar-Ge	D	AF1997	1/1.000
Alexa Flouor 488 keçi anti-fare	Invitrogen		948492 1/2.000
DPBS (Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin), 1X kalsiyum içermez & magnezyum	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Ters Transkripsiyon Kiti	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
toplama başlığı	NuAire	NU-301
diseksiyon kapsamı	Nikon	SMZ745