Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu

Antiviral konak savunmasında çok önemli bir etkinlik sözde görüntü tanıma reseptörleri (PRR) ^1,2 patojeni hızlı tespit edilmesidir. RNA virüs enfeksiyonu tespiti, iki hücre içi sitoplazmik RNA sarmallara Rig-I (retinoik asit olarak uyarılabilir bir gen I) 'in ve MDA5 (melanoma farklılaşma ilişkili protein 5) ^3-5 bağlıdır. Rig-I, iki N-ucu kaspaz alım alanları (kart), merkezi bir Dech kutu tipi RNA helikaz etki alanı ve bir C-terminal alanının (CTD) ^4,6 oluşmaktadır. CTD ve sarmal etki non-self (viral) RNA'lar tanınması için gerekli ise, kARtlARI bir antiviral sahibi durumundaki kurulmasına yol açan aşağı sinyalizasyon aracılık.

Rig-I, belirli bir RNA ligandın yokluğunda yani sessiz durum içinde ise, ikinci bir kart merkezi sarmal alanı ile etkileşime girer ve bir otomatik engelleyici konformasyonunda ^7-11 Rig-I tutar. Rig-Ben kısa bağlanır çiftbir 5'-trifosfat (5'PPP) ve uzun dsRNA, polyU ve / UC açısından zengin RNA, birçok DNA virüsünün ^12-16 genomlarında üzerinde mevcut olan klasik imza yapıları taşıyan iplik (ds) RNA. Rig-I aktivasyonu iki temel özellikleri kapalı konformasyon ^6,17 ve homo-oligomerizasyonun ^6,18,19 bir anahtar vardır. Yapısal anahtarı, RNA bağlayıcı geliştirir aşağı sinyalizasyon için kartlar ortaya, ve aktif bir ATPaz sitesi ^8,9,11,20 yeniden oluşturulmasını. Oligomerik Rig-I komplekslerinin oluşumu antiviral sinyal iletimi ¹¹ için bir platform oluşturmak için aşağı doğru sinyal adaptör moleküllerinin gelişmiş işe yol açar. Rig-I-regüle sinyal zinciri sonunda transkripsiyon faktörünü aktive IRF-3 için yukarı-regülasyonu tam bir antiviral karşılık ^21,22 için interferon (IFN-alpha/beta) genleri ve interferon uyarılan genlerin dolayısıyla gen ifadesi (ISGs) arasında . En iyi karakterize edilmiş ISGs bir RNA ile aktive olan Protein kinaz (PKR) ^23. PKR ökaryotik translasyon başlatma faktörü alfa 2 (eIF2α) kinazları ailesine ait olan ve bir N-terminal çift-şeritli RNA bağlama alanı ve bir C-terminal kinaz oluşmaktadır. Kinaz etki PKR dimerizasyon aktivasyonu için önemli bir arayüz oluşturur ve proteinin katalitik işlevleri yerine getirir. Viral dsRNA PKR bağlanması, bunun yapısal değişiklik diğer artıklar arasında yer Thr 446 dimerizasyonu ve oto-fosforilasyonunu izin yol açar. PKR sonra bu şekilde viral mRNA ^23-27 çevirisini bloke eIF2α fosforilasyonunu aracılık eder.

Rig-I ve PKR her ikisi de, önemli bir yapısal yeniden düzenlemeleri geçmesi oligomerik kompleksler oluşturmak ve post-translasyonel fosforilasyon / defosforilasyon ve ubikitinasyon ^{10,11,19,23,24,26-29} ile tadil edilmiş metilalümoksandır. Viral RNA yapıları Rig-I ve PKR'yi aktive edilir (ve hangi aşamada viral antagonist b olabilecek daha iyi anlaşılması içine) müdahale, bu tam etkinleştirme durumunu belirlemek için önemlidir. Her iki PRRS için bir önceki aktivasyon trypsin'e dirençli protein fragmanlarının ^6,17,30 ve daha yüksek dereceden oligomerlerin ^6,18,19 ortaya çıkmasına yol açar tanımlanmıştır. Ancak, antiviral konak yanıtının ^1,2,24 bu anahtar faktörlere edebiyatının zenginliği göz önüne alındığında, doğrudan yöntemler uygulama nispeten nadir görünüyor. Geniş kullanım uyarıcı umuduyla olarak, sağlam Rig-I ve PKR'nin aktivasyon durumları analiz etmek için uygun ve hassas protokolleri sağlar. IFN yetkin insan hücre hattı A549 Rig-I ve PKR, zayıflatılmış Rift Valley ateşli virüsü mutant klonu 13 (Cı-13) ^31,32 yerleşik bir aktivatör ile enfekte edilir. Basit bir parçalama işleminden sonra, enfekte olmuş hücrelerin ekstreleri konformasyonel geçiş değerlendirmek için sınırlı tripsin sindirim / western blot analizi ile test edildi ve mavi olan yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) / Western blot analizi çalışan tarafındanoligomerlerin oluşumunu ölçmektir.

Enfeksiyon için A549 Hücrelerinin 1. Tohum

1. 37 ° C'de A549 hücrelerinin bir T75 şişesi yetiştirmek ve% 5 hücre kültür ortamı içinde _2, CO (DMEM,% 10 FCS, 526.6 mg / L L-glutamin, 50,000 U / L penisilin ve 50 mg / l streptomisin ile takviye edilmiştir).
2. Hücreleri toplamak için başlamadan önce, 37 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosu içinde, hücre kültür ortamı, PBS ve% 0.05 tripsin-EDTA ısıtmak
3. Ortamı çıkarın ve 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın. Yeniden PBS çıkarın.
4. Tripsin-EDTA 3 ml eklenir ve şişeye eşit olarak dağıtır. 37 ° C bir inkübatörde şişeyi aktarın ve% 5 _CO2.
5. Tüm hücreler müstakil zaman, hücre kültür ortamı 7 ml eklemek hücreleri tekrar süspansiyon ve bir 15 ml Falcon tüpü içine hücre süspansiyonu aktarın.
6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüje hücreleri, süpernatant kaldırmak ve 10 ml taze kültür ortamı hücre pelet tekrar süspansiyon.
7. Bir sayım bölmesi ile hücre sayımı.
8. İki T25 şişelerinde her hücre kültür ortamı içinde 5 ml 2.5 x 10 ⁶ hücreleri ekleyin. 37 ° C'de 16 saat boyunca inkübe edin ve% 5 _CO2. Bir şişe, yalancı kontrol ve Cı 13 bulaşmasına biri için karşılık vermektedir.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Clone 13 2. Enfeksiyon (13 Cl)

1. Not: Cl 13 Almanya'da BSL2 koşullar altında işlenebilir zayıflatılmış bir virüs mutantıdır. Ilgili ulusal kılavuzlara bakın. Diğer tipik IFN indükleyicilerinin Sendai virüsü (suşu Cantell) veya Newcastle hastalığı virüsü olacaktır.
2. % 5 FCS ihtiva eden ön sıcak PBS, serum içermeyen ortam, ve hücre kültür ortamı.
3. 5 'lik çoklu enfeksiyon (MOI) ile 2.5 x 10 ⁶ A549 hücrelerini enfekte etmek için, serum barındırmayan ortam içinde 13 Cl, 1.25 x 10 ⁷ PFU / ml hazırlayın. Hesaba katmak için gerekli olandan daha az (yaklaşık% 10) daha büyük bir miktarda hazırlanması pipet hataları.
4. 1.3 altında tarif edildiği gibi hücrelerin PBS ile yıkayın.
5. 1 Cl 13 ml seyreltme ya da eklemeserumsuz ortamın hücrelerine (enfekte edilmemiş kontrol, mock) ve 37 ° C'de 1 saat ve% 5 _CO2 inkübe edilir. Sırasıyla Cı 13 seyreltme ve serumsuz ortam içinde eşit dağılımını sağlamak için her 15 dakika dikkatlice şişeyi hareket ettirin.
6. Enfeksiyon 1 saat sonra, inokulum kaldırmak% 5 FCS ile önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı 5 ml eklemek ve 37 ° C'de 5 saat ve% 5 _CO2 inkübe edilir.

Hücre lisatları 3. Hazırlanması

1. 4 ° C'de PBS /% 0.5 Triton X-100 hazırlanması Serin proteaz inhibitörleri katmayın.
2. Soğuk PBS ile yıkayın ve taze 10 ml PBS ilave edin.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'de hücre bir Falcon tüpüne süspansiyon ve santrifüj transfer hücreleri kazıyın.
4. Süpernatantı ve 30 ul PBS /% 0.5 Triton X-100 hücre pelletini. Yeni bir 1.5 ml tüp içine aktarın ve lisat, 4 ° C'de en az 10 dakika boyunca inkübe
5. 10.00 Lisatı santrifüj0, 4 ° C'de 10 dakika boyunca x g ve yeni bir tüp içine berraklaştınlmış hücre lizatı (süpernatant) aktarın.
6. Başka bir yerde tarif edildiği gibi ³³ Bradford tahliliyle protein konsantrasyonunu belirleyin.
7. -20 ° C'de saklayın veya tripsin sindirim (4.1) veya doğal PAGE (5.1) geçin.

Örüntü tanıma reseptörleri Konformasyonel Değişiklikler 4. Belirlenmesi

1. Hücre lisatları içinde TPCK-tripsin tedavisi
   1. 2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar çalışma PBS içinde L-1-tosilamido-2-feniletil klorometil keton ile muamele edilmiş (TPCK) tripsin seyreltin.
   2. İki yeni tüplere PBS ile 9 ul'lik bir nihai hacim içinde (mock veya Cı 13) her bir protein lizat 25 ug bir son protein konsantrasyonu olarak ayarlayın. Bu nedenle, bu iki kat sahte ve iki defa Cı 13 enfeksiyonu, 25 ug lizat her dört tüpler olmalıdır. Bir giriş kontrol (tedavi edilmemiş) ve TPCK-tripsin ile muamele etmek için, bir set olarak ayarlayın.
   3. PBS 1 ul (işlenmemiş)1 ya da 2 ug / ml TPCK-Tripsin (son konsantrasyon: 0.2 ug / ml) içinde ul, hücre lizatlarına ve pipetleme reaksiyonları karıştırın. Bu sindirim etkinliğini tehlikeye çünkü, donma ve TPCK-tripsin bölüntülerin çözülme ETMEYİN.
   4. 25 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin lizatları. 5x (250 mM Tris-HCl pH 6.8,% 10 SDS,% 50 gliserol,% 25 β-merkaptoetanol,% 0.5 bromfenol mavisi) bir numunesi, denatüre edici tampon ilave edilerek ve 95 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatılarak reaksiyonu durdurun Bu tripsin kuluçka süresini uzatmak değil önemlidir. No peptidaza dayanıklı fragmanları tespit edilebilir durumda, tripsin sindirim süresinin kısalması gerekir.
   5. Kaynatıldıktan sonra numuneler -20 ° C'de muhafaza edilebilir
2. SDS poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve Western Blot
   1. Sodyum dodesil sülfat,% 12 çözme jeli üzerinde% 5 istif ihtiva eden (SDS)-poliakrilamid jel üzerinde örnekleri yerleştirin. Kadar, jel başına 25 mA'da proteinleri Ayrıbromfenol mavi biterse.
   2. , Metanol ile 30 saniye boyunca bir poliviniliden florür (PVDF) membran aktive ve transfer tampon maddesi (48 mM Tris, 39 mM glisin, 1.3 mM SDS,% 20 metanol) koydu.
   3. Bir yan-kuru blot sistemi ile blotting hazırlayın ve 1 saat için 10 V de proteinlerin transferine izin verir. , Membran çıkarıp suyla kısaca durulayın ve kurumaya bırakın.
   4. Kısa bir süre metanol içine aktararak zarını yeniden etkinleştirin. TBS ile 5 dakika süreyle yıkanır. Oda sıcaklığında ya da 4 ° CO / N. 1 saat için, TBS içinde% 10 yağsız süt ile bloke 5 dakika TBS ile her biri için zar 3 kez yıkayın.
   5. Tablo 1 'de tavsiye edildiği gibi antikor seyreltme hazırlayın ve oda sıcaklığında ya da 4 ° CO / N 1 saat boyunca membran inkübe
   6. 10 dakika TBS-T ile her biri için zar 3 kez yıkayın. TBS içinde% 1 yağsız süt içinde bir 1:20,000 seyreltide yaban turpu peroksidazı ile birleştirilmiş uygun ikincil antikor ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
   7. 10 dakika TBS-T ile her biri için zar 3 kez yıkanır, ve oTBS ile ne ek süre.
   8. Sinyal tespiti için ticari Kimyasal ışığın kiti ve dijital jel görüntüleme sistemi kullanın.
3. Coomassie Parlak Mavi G-250 Boyama
   1. 4.2.1 'de tarif edildiği gibi SDS-PAGE gerçekleştirin. Bromfenol mavi biterse kadar yük bir SDS poliakrilamid jel üzerinde örnekleri ve jel başına 25 mA jel çalıştırın.
   2. Oda sıcaklığında Coomassie Parlak Mavi G-250 lekeleme gerçekleştirin. Sürekli sallayarak altındaki tüm inkubasyon yapmak.
   3. % 40 metanol ve 30 dakika boyunca,% 10 asetik asit içeren sabitleme çözeltisine jel aktarın.
   4. Destaining solüsyonu (% 25 etanol ve% 8 asetik asit) ile tampon değişimi ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
   5. % 40 metanol ve 1 saat% 10 asetik asit içinde% 0.2 Coomassie Brillant Blue G-250 ile jel leke.
   6. Destaining solüsyonu ile jel destain ve 10 dakika, 30 dakika ve 60 dakika sonra tampon değişimi.
   7. 4 ° C'de% 25 etanol,% 8, asetik asit ve% 4 gliserol içinde jel saklayın 4.2.8 altında açıklandığı gibi görüntüleme ve analizi yapın.

Örüntü tanıma reseptörleri Oligomerik Devletleri'nin 5. Analizi

1. Yerel PAGE
   1. PBS ile 10 ul'lik bir nihai hacim içinde, hücre lizatı, 50 ug hazırlanması ve bir nihai konsantrasyona kadar 5 x yerel numune tamponu (250 mM Tris-HCl pH 6.8,% 1 sodyum deoksikolat,% 50 gliserol,% 0.5 bromfenol mavisi) ekleyin 1x.
   2. Istifleme olarak% 5 ve çözücü jel gibi% 8 ile yerli poliakrilamid jel üzerinde HEMEN örnekleri yükleyin. Herhangi bir gecikme yerli kompleksleri ³⁴ kaybına neden olur.
   3. Anot ve 50 mM Tris, pH 8.3, 384 mM Glycin, katot tampon madde olarak,% 1 sodyum deoksikolat gibi 50 mM Tris-NaOH, pH 9.0, 384 mM glisin ile 4 ° C'de jel başına 20 mA'da jel çalıştırın. 1.5-2 saat sonra elektroforez bittiğinde (bromfenol mavi bant yaklaşık 45 dk önce jel bıraktı).
2. Western Blotting
   1. Bir polyv etkinleştirin, metanol ile 30 saniye için florür (PVDF) membran inylidene ve Towbin tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS,% 20 metanol) koydu.
   2. Üreticinin talimatlarına göre, ıslak leke haznesi monte ve Towin tamponu ile doldurun.
   3. 4 ° C 'de 1.5 saat boyunca 250 mA olan blotting işleminin gerçekleştirilmesi
   4. Blot ne zaman 4.2.3 dan açıklandığı gibi devam bitti.

Rig-I ya da PKR ile bir viral agonistinin tanınması konformasyonel anahtarlama 6,17,30 ve oligomerizasyon 6,18,27 tetikler. Biz ise, sınırlı bir proteaz sindirimi ve yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile bu iki etkinleştirme işaretleri analiz edilmiştir.

Insan A549 hücreleri, IFN antagonist NSS 35,36 bir mutasyon ile karakterize Rift Valley ateşli virüsü klon 13 (CI 13) ile enfekte edilmiştir. Nedeniyle fonksiyonel NSS olmaması için, Clone 13 şiddetle hücrelerde 12,31,32,37 sağlam bir antiviral devletinin kurulmasına yol açan, Rig-I ve PKR'yi uyarmaktadır.

Rig-I hızlı bir bozunma ile sahte enfekte edilmiş hücre lizatları sonuç tripsin sindirim, Cı-13 enfeksiyonu, 30 kDa'lık bir dirençli Rig-I fragmanı, Şekil 1A sebep olur ise. Ayrıca, PKR ile fosfatazlar ile çakışmaktadır enfekte örneklerinde, içinde tiripsin sindirimine direnç gösterir kısmiorylation Şekil 1A. Tripsin hazmı etkinlik ve spesifikliği izlemek için, j eller, Coomassie Parlak Mavi G-250 ile boyandı. Tedavi edilmeyen numuneler yüklü proteinlerin Şekil 1B eşit miktarda göstermektedir. Tiripsin sindirimine, sahte ve Cı 13 hücre lizatları tabi tutulması küresel protein miktarlarının bir karşılaştırılabilir azalmasına yol açar. Bu, tripsin ve tedavi mock Cı 13 ile enfekte olmuş örnekler için aynı verimliliğe sahip olduğunu göstermektedir.

, Oligomerik kompleksleri oluşumu doğal PAGE ile analiz edilmiştir. Enfekte edilmemiş hücrelerde, Rig-I ve PKR'nin sadece monomerleri Şekil 2 tespit edilmiştir. Gibi ek bir kontrol bir monomer olarak mevcut, ancak, örneğin, Rig-I 38 ile aktivasyon üzerine dimerize bilinen transkripsiyon faktörü IRF-3 dahildir. Cl 13 enfeksiyonu, yayma ve PKR ve belirli bir protein bandı gibi IRF-3 dimerler / oligomer şeklinde teçhizat-I, oligomerik kompleksleri güçlü birikmesine neden olur.

class = "jove_content"> Bu sonuçlar, kısıtlı sindirim ve tripsin yerel PAGE konformasyonel değişiklikler ve enfeksiyonu üzerine Rig-I ve PKR'nin oligomer oluşumunu izlemek için yararlı araçlar olduğunu göstermektedir.

Şekil 1. Rig-I ve PKR konformasyonel anahtarı. A549 hücreleri, sahte enfekte olan ya da 5 saat sonra, hücreler PBS içinde lize edilmiştir. 5'te MOl'de Cl 13 ile enfekte edildi,% 0.5 Triton X-100 ilave edilmiş ve hücre lizatları temizlenir Tedavi edilmediği veya tripsin ile muamele edilmiş ya da. Numuneler Batı (A) ya da Coomassie boyama (B) blot ve ardından SDS-PAGE tabi tutulmuştur. Lekeler Rig-I, PKR, fosforile PKR (Thr 446) karşı, sırasıyla RVFV nükleoprotein (RVFV N) ve enfeksiyon ve yükleme kontrolü olarak beta-aktin, karşı boyandı._blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,. Rig-I, PKR'nin oligomerizasyonu ve IRF-3. Mock ve Cı 13 ile enfekte hücre lizatlarının hücre lizatları, Western blot analizi ile, ardından yerel PAGE tabi tutulmuştur. Boyama Rig-I, PKR, IRF-3 ve yükleme kontrolü olarak beta-aktine karşı antikorlar ile gerçekleştirildi. PKR Oligomerlerin büyük olasılıkla dimerlerini 27 temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Çıkar çatışması ilan etti.