Yöntem makalesi

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

DOI:

10.3791/51463

⸱

26 Temmuz 2014

 ,  ,  , 
1Department of Engineering Sciences, Uppsala University, 2Gatan Inc., 3Department of Microbiology, Swedish University of Agricultural Sciences, 4Physics Department, University of Oslo

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada Aspergillus niger sporları cryo-TEM örneklerini hazırlamak için kullanılan bir protokol mevcut, ancak kolayca mikroorganizmalar ya da çözeltilerin herhangi bir sayı için adapte edilebilir. Biz bir özel inşa cryo-aktarma istasyonu ve modifiye cryo-SEM hazırlama odasına 2 yararlanabilirler. Sporlar, bir sıvı azot çamurlu zeminlerde dalma-dondurulmuş ve ilgi bir bölge seçmek için Cryo-SEM gözlenen, bir kültürden alınmıştır. Ince bir lamel daha sonra bir TEM şebekeye bağlanmış ve daha sonra şeffaflık elektron inceltilmiş, FIB ile elde edilir. Izgara bir cryo-TEM tutucu ve yüksek çözünürlüklü TEM çalışmaları için aktarılır. Soğutulmuş nanomanipulator ucu ve bir cryo-aktarma istasyonunun tanıtımı sayesinde, bu protokol TEM örneklerinin rutin kullanılan FIB hazırlık kriyojenik sıcaklığına basit bir uyarlamasıdır. Bu nedenle de mevcut araçlar, kurulumları ve prosedürlere değişiklikler küçük bir miktar gerektiren avantajları vardır; iuygulamak s kolay; prensip Cryo-TEM numune hazırlama gibi aynı, geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir. Bir sınırlama bulaşmaları engellemek veya en aza indirmek için kritik aşamada numunelerin usta işlenmesini gerektirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol daha önce bir cryo-FIB/SEM SEM analizi ile yüksek hassasiyet ile tespit numunenin belirli bir bölge, ikinci TEM örnekleri üretmek için kullanılır. Biyolojik örneklerin elektron mikroskobu (tarama veya iletim) analizi araştırma ve tanı için kullanılan rutin bir tekniktir. SEM oldukça hızlı ve istihdam ve yorumlamak kolay değildir, ancak bilgi sadece numune yüzeyinden ve 1.5 nm aralığında bir çözünürlük elde edilir. TEM daha yüksek bir çözünürlüğe sahiptir, ancak uygulamak daha zordur, görüntü analizi daha basittir ve toplu bir bilgi elde edilir ise, örnekleri (yaklaşık 500 nm kalınlığında daha az) şeffaflık elektron inceltilebilir gerekir. Ek bir sorun, bu araçların bir elektrik gereksinimleri nadiren su-ihtiva eden numuneler ile tolere olmasıdır. Çoğu durumda, biyolojik örnekler kimyasal olarak (polimer, örneğin, su ile ikame edilmesinin) sabit ya da kurutulacak ya sahiptir. Her iki durumda da, önemli değişikliklerNumunenin morfolojisi ve yapısı meydana olasıdır. Hidratlanmış örneklerin Cryo TEM hazırlanması minimal kimyasal değişikliklere neden olur ve bu buz vitrifikasyon 1-6 elde edilir, özellikle, kendi doğal yapısında mümkün olduğu kadar yakın örnekleri üretir.

FIB yaygın olarak sayısız avantajları 7 TEM örnekleri hazırlamak için kullanılır. Birkaç isim: normale yakın sıklığı yüksek enerjili iyonların kullanımı malzeme ilişkili diferansiyel freze oranlarının etkisini en aza indirir; kütle numunesinden ekstre bölgenin bir alt-mikron hassas olarak seçilebilir; malzeme çok az miktarda ekstre edilir. Bazı yeni teknik gelişmeler kriyojenik sıcaklıklarda 2,8-10 de TEM numune hazırlama için de FIB kullanarak mümkün hale getirmiştir. Böyle dilimlenmiş lamelinin mekanik deformasyon eksikliği gibi yumuşak madde örnekleri için ağırlıklı olarak kullanılan kriyo-microtomy 11,12 geleneksel hazırlama yöntemi üzerinde çeşitli avantajları vardırsert / yumuşak arayüzleri veya bileşenleri ile kompozit örnekleri hazırlamak için bıçak işaretleri ve olasılığı olmaması.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol verilen tüm parametreler burada belirtilen araçlar ve modeller için geçerlidir. Başka bir üretici veya model kullanılırsa (metinde de * ile işaretlenen) bu parametrelerin bazıları farklı olabilir.

FIB / SEM 1. Başlangıç

  1. Anticontaminator (AC) Cu örgüler ekleme olmadan özel inşa soğuk nanomanipulator (NM) ucu monte edin. Bunun yerine örgü bileme adım (1.2) sırasında şarjı önlemek için yalıtım noktası üzerinde NM kalanına bağlı olduğundan emin olun.
    1. Yüksek vakum ve görüntü NM ucu için pompa, SEM odasını kapatın.
    2. Ucu, eğik veya künt önceki kullanımı ile kirlenmiş ise, iyon demeti vasıtasıyla bileylemeniz: ucun kenarları boyunca çokgen öğütme desenleri seçin öğütüldükten sonra tip 1 um ya da daha az kadar konik böylece.
    3. Ucun uzak kenarları öğütülmüş sonra, manuel olarak tüm NM çubuk 90 ° döndürmekSEM odasının dışından.
    4. Döndürülmüş ucu uyum ve farklı bir açıdan freze tekrarlamak çokgen freze desenleri ayarlayın.
  2. Ucu az 1 mikron olduğu için bilenmiş edildikten sonra, NM geri çekin ve Gaz Enjeksiyon Sistemi (CBS) iğneyi; (yerine her zamanki 175 um) çalışma mesafesi üzerinde yaklaşık 1 mm olması için iğne yerleştirin.
  3. Pt, bir öncü kullanılıyorsa, (her zamanki yerine 40 ° C), 24-26 ° C'ye kadar çalışma sıcaklığına değiştirin. Bu adımlar, Pt cryo-13 birikimi için gereklidir.
  4. SEM odasını açın ve cryo örnek sahne ve ac montaj tarafından kriyo-modu için FIB / SEM hazırlamak.
  5. Takılı konumuna NM geçin ve AC onun Cu örgü bağlayın. Yanlışlıkla NM ucuna dokunmaz emin olun. Sistem kriyojenik sıcaklıklarda Cu örgü esneklik kaybı NM hareket engel olmayacağından emin olmak için eklenen NM ile soğutulurment.
  6. Birkaç dakika boyunca kuru azot gazı ile soğutma boruları temizleyin.
  7. Cryo hazırlık odası ve yüksek vakum için ana örnek odasını Pompa.
  8. Iki bölmeyi soğutmak için Dewar sıvı nitrojen ekleyin. Istenen sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin.

2.. Örnek Donma

    1. SEM transferi tutucu üzerine FİB iki örneklerin TEM ızgaralar monte edin. Bir tornavida ile ilgili vidaları sıkarak sabitleyin.
    2. Numune için örnek bir saplama uygun düzgün monte ve numune bir kısmını ekleyin. Numune tipine bağlı olarak, numune kriyojenik yapıştırıcı ile ya da bir kelepçe ile tespit edilebilir. Uygun dondurma sağlamak için mümkün olduğu kadar az miktarda kullanın.
    3. Vakum transfer cihazının (VTD) üzerine SEM transferi yuvasını monte edin.
    1. Slushing istasyon içine sıvı azot ekleyin ve azot çamuru elde etmek için aşağı pompa.
    2. Sl açınushing istasyonu ve SEM transferi tutucu dalma-dondurma. Tekrar kaynama tamamlanır ve çamur elde edilinceye kadar tekrar aşağı pompa. Bir etan veya propan hızlı geri dökme ya da yüksek basınç dondurma numunenin camlaşması için daha uygun teknikler olduğu not edilmelidir.
    1. VTD vakum odasına SEM transferi yuvasını çekin ve mühür.
    2. Slushing istasyonu ve cryo hazırlama haznesi hava kilidi Vent.
    3. Cryo hazırlama odasına ve pompa airlock VTD mühür Maç.
    4. İyi bir vakum seviyesi ulaşıldığında, VTD ve dış hava kilidinin mührünü açmak için hava kilidi pimini takın; SEM transferi tutucuya yerleştirin. Serpme ve kırılma için örnek konumu gösteren preparasyon odacıklarda kayar kontaklar işaretler vardır.
  4. Gerekirse, örnek olabilir: soğuk bıçak ile kırık; daha yüksek bir sıcaklık (genellikle -100 ayarlayarak yüceltilmiş6, C); Soğuk sputterer vasıtasıyla Au / Pd veya Pt ile kaplanmış (300 V, 10 mA, 2-3 nm Au / Pd kap için 60 saniye) +. Süblimasyon kendi tekrar-kristalleşmeyi önlemek için vitrifiye edilmiş örnekler için kullanılmamalıdır.
    1. TEM ızgara yuvalarının koruyucu kapaklarını açmak için soğuk bıçak kullanın.
    2. Alıcı yükseklikte (16 mm *) için örnek odası içinde soğuk aşama getirin.
    3. FIB / SEM HT kapatın ve iç hava kilidi açmak.
    4. Numune odası içine SEM tutucu aktarmak için VTD kullanın. Odasında aydınlatma karartma bu adımda yardımcı olabilir.
    5. SEM tutucu soğuk aşamasında sonra, iterek ve çevirerek VTD ayırın.
    6. VTD vakum odası içine VTD çubuktan tüm yol çekin ve iç hava kilidi, dış hava kilidi ile VTD mühür kapatın. Kabinin dış şimdi VTD mührü kaldırmak için havalandırmalı olabilir. Bu son adım gerekli değildir, ancak VTD çubuk kolaylıkla kaza yerinden edilebilir hasara neden olabilir, tavsiye edilirVTD veya basınç kabinine.

3.. İyon Freze

  1. Her iki sütun üzerinde yüksek gerilim açın ve uygun görüntüleme parametreleri (hızlanan voltaj ayarlayın: elektron ışını için 10 kV, iyon ışını için 30 kV; spot boyutu: 3; çalışma mesafesi: 5 mm, iyon demeti akımı: 10-100 görüntüleme için pA, freze için 1-3 nA) *.
  2. Ilgi çekici bir özellik bulmak ve lamelinin ekstre önce numunenin durumlarını saptamak için görüntüler elde etmek için elektron ışını kullanarak.
  3. Ekstraksiyon için ilgi çekici (ROI) bir bölgesi belirlendikten sonra, numunenin kendisinin topografya da Pt çökeltilmesinden sonra ROI kolay tanımlama için izin vermediği sürece, iyon demeti modelleme ile işaretleyin. Artan hassasiyet için, işaretler, derin, geniş ve non-sel olan Cryo-Pt birikimi (kapsadığı sonra hala görünür olmak için yeterli olmalıdır Pettersson ve ark. 14 tarafından açıklanan yöntemi kullanın) yansıtıcı ve numune yüzeyinin birkaç mm 2 kapsayacaktır.
  4. 24-26 ° C'ye kadar ön-ısıtılır ve gaz numune yüzey üzerinde yaklaşık 1 mm kadar bir yüksekliğe CBS iğneyi (ayrıca 1.3 adım bakınız).
  5. Elektron ışını ile görüntüleme iken, birkaç saniye boyunca gaz vanasını açın. Cryo-Pt birikimi oranı CBS iğne, örnek pürüzlülük ve kullanıcının sistem mesafeye bağlı olarak, 100-500 nm / sn veya daha fazladır. Bu optimum parametreleri belirlemek için birkaç deneme yeminli çalıştırmak için tavsiye edilir.
  6. Ham Cryo-Pt birikimi çok kaba ve homojen olmayan bir. Düşük büyütme (örneğin 2,000 X) bir 1,000 Pa iyon ışını kullanarak ROI üzerinde mevduat Cure. Cryo birikimi farklı olarak, bu sertleştirme seçici edilir ve sadece ROI yapılmalıdır. Bu birinci cryo-çökelme amacı, iyon huzmesi zararlardan numunenin yüzeyi korumak için ve iyon inceltme 13 boyunca curtaining azaltmaktır.
  7. Için örnek eğin52 ° yüzey iyon kirişine dik olacak şekilde. ROI iki tarafında değirmen uzak iki teraslı siperler. Siperleri için tipik boyutlar ekstre edilecek olan lamel, dikey yönde (Y) ve bir değişken ile 10-15 um için yön (X) paralel olarak 20-30 um olan, en derin noktası ile, derinlik (Z) eğimli ROI yakın. Eğimi 45-55 ° olmalıdır. Bazı araçlar, teraslı siperler sadece üstüne derin noktası ile öğütülmüş olabilir. Böyle bir durumda, ROI altında bir değirmen, daha sonra 180 ° görüntü ve değirmen diğer tarafında ikinci bir döndürün. Malzemenin püskürtme hızı bilinen durumunda freze derinliği seçilebilir. En dondurulmuş hidratlanmış bir örnek için, buz püskürtme hızı 7 kullanılabilir.
  8. Geri 0 ° örnek eğin ve emin kesme işaretleri (onlar teraslı yamaçlar değirmende öğütme işaretleri bırakmalısınız tüm lamelinin geçmesi yapma, lamelinin kenarlarını ve alt kesip için iyon ışını kullanan) önceki adımda ed. Numunenin geri kalanı için tabakalara bağlanma sadece iki küçük köprüler bırakın.
  9. (Bu biraz örnek kayabilir) CBS iğne takın. Ucu tercihen tarafında, lamel ile fiziksel temas içinde olduğu kadar, NM manevra. NM iki küçük bağlayan köprülerin iyon demeti görünümü engellemekten olmadığından emin olun.
    1. Birkaç saniye için CBS vanasını açın ve elektron ışını ile sürekli görüntüleme ile Cryo birikimini izlemek.
    2. Pt ek bir 1-2 mikron katman kriyo-tevdi olmuştur, vanasını kapatın.
    3. Sadece NM lamel ile temas halinde olan bir nokta etrafında birkaç mikron Pt (adım 2.6) Cure.
    4. Ücretsiz tabakalara kesmek için yüksek bir iyon demeti akımı kullanın. İki bağlantı köprü uzak öğütülmüş, hem de ince tabakanın ve numunenin geri kalan kısmı arasındaki temas noktalarını yeni oluşmuş olabilecek Pt herhangi bir fazla olmalıdır. Henüz CBS iğne geri vermeyin.
  11. Dikkatle siperlerinden tabakalara ayıklamak ve en az 500 mikron numune yüzeyi üzerinde taşımak için NM manevra. Ancak bu aşamadan sonra, CBS iğne geri.
  12. Örnek evre birkaç mm indirin ve TEM ızgaraları biri kadar hareket görünümünde olduğunu. Çalışma pozisyonuna ızgara üzerinde bağlanma alanı taşımak ve CBS iğne takın.
    1. Dikkatlice TEM ızgara üzerinde bağlanma alanı ile fiziksel temas halinde ekli tabakalara getirmek için manevra NM. Lamel, TEM ızgara ve NM arasında basınç veya germe olmalıdır.
    2. Birkaç saniye ve kriyo-mevduat Pt ek bir 1-2 mikron katman için gaz vanasını açın.
    3. Sadece lamel ve TEM ızgara arasındaki temas noktası etrafında birkaç mikron Pt (adım 2.6) Cure.
  14. NM serbest tabakalara kesmek için yüksek bir iyon demeti akımı kullanın. Bu, NM ucu veya numunenin her iki tarafında uzak öğütülerek gerçekleştirilebilmektedir. To ilk durumda, uç aşama 1.2 'de tarif edildiği gibi, bir sonraki kullanımdan önce tekrar bilenmiş gerekecektir.
  15. İSTEĞE BAĞLI: Bu aşamada SEM Transfer tutucu almak ve sıvı azotla dolu bir Dewar O / N saklamak VTD kullanmak mümkündür. Bu transfer ve O / N depolama lamel yüzeyi üzerinde buz oluşumunu yol açabilir ve sıvı azot nemli havaya maruz kalırsa buz kristalleri zaten mevcut olan ve / veya eğer; ancak bu kirlenme, nispeten kısa bir süre içinde bir sonraki adım kaldırılır. Önceki adımlar tamamlamak için birkaç saat almış olabilir gibi şu aşamadan sonra bu depolama O / N önerilmez çünkü (yüceltme dışında buz kontaminasyonu kaldırmak için hiçbir yolu olmaz gibi, bu, bunu yapmak için uygun olabilir ki Numunenin vitrifikasyon muhafaza edilmesi ise) gerçekleştirilemez.
  16. 52 ° örnek eğin ve şeffaflık 7 elektron ince iyon ışını kullanın. Bu yüksek, Roug ile başlamak tavsiye edilirOnun kiriş akımları yığınını çıkarmak ve sonunda da hızlanan gerilimini düşürerek, düşük kiriş akımları ile yüzey parlatma ince devam etmek. Lamelinin son kalınlığı numune bileşimine bağlı olarak, 100-200 kV TEM ince yapı analizi için 100-200 nm ya da daha az ya da bir 300 kV TEM tomografi için en fazla 500 nm olmalıdır. Inceltme sırasında numunenin iç gerilimler de lamel kıvırmak veya bükme neden olabilir. Böyle bir durumda, inceltilmiş bölge kısıtlanmalıdır. Bu durum, Şekil 11 ve 12, örneğin oldu.

TEM 4. Cryo Transferi

    1. Birkaç dakika boyunca kuru azot gazı ile birlikte kriyo-aktarma istasyonuna yıkayın.
    2. TEM AC Dewar ve cryo-aktarma istasyonuna sıvı azot ekleyin.
    3. Cryo-aktarma istasyonu uygun yuvaya Cryo-devret TEM duyunu yerleştirin ve aynı zamanda onun Dewar doldurun. Her comp kadar bekleyinonent istenen sıcaklığa (yaklaşık 15 dakika) ulaşmıştır. Mümkünse, cryo transfer TEM sahibinin kontrolör transferi sırasında sıcaklığını izlemek bağlı olmalıdır. Bu (sıcaklık sensörü bulunur) TEM sahibinin ucu Cryo-aktarma istasyonu ile temas halinde olacak ve bu nedenle TEM sahibinin geri kalanından çok daha hızlı soğumasını fark etmek önemlidir. Bu nedenle soğumasını tüm cryo transferi TEM tutucu için gerekli süre önceden ölçülmüş ve sistem zaman en az bu miktar için ısıtmaları için izin verildiğini tavsiye edilir.
    4. Sıvı nitrojen ile bir kriyojenik bardağı doldurun ve içine batırmak: istenilen sıcaklığa kendi ipuçları soğuması için TEM numune sıkma aracı, bir tornavida ve cımbız,. Operatörün elinde soğuk yanıklara neden olmayacak şekilde tüm araçları düzgün diğer ucunda izole edilmelidir.
  2. Dış basınç kabinine VTD maç. Soğuk Geyiği getirtransfer yüksekliği (16 mm *) e. Yüksek gerilimi kapatın.
    1. VTD mühür, dış hava kilidi ve iç hava kilidi açın.
    2. Saat yönünde iterek ve çevirerek SEM transferi tutucu içine kilitlemek için VTD çubuğunu kullanın.
    3. Cryo hazırlık odasına SEM transferi yuvasını geri çekin.
    4. TEM ızgaraları koruyucu kapaklarını kapatmak için soğuk bıçak kullanın. Bu aktarma esnasında olası buz kirlenmeyi azaltmak için gereklidir.
    5. VTD vakum odası içine örnek taşımak için VTD çubuk kullanın.
    6. Hava kilitlerini ve mühür kapatın.
  4. Dış airlock havalandırma ve VTD ayırmak. Cryo-aktarma istasyonu SEM noktasına VTD maç. Kuru azot ile yıkarken, VTD mührünü açıp cryo-aktarma istasyonu Dewar içine SEM transferi yuvasını kaydırın için istasyonda iğne kullanın.
    1. Cryo-aktarma istasyonunda seviyesi yeterince yüksek olduğunu bu nedenle yeterli sıvı azot ekleSadece örnek daldırın.
    2. Kapaklarının birini açın ve yerine TEM ızgara tutuyor gelen vidayı gevşetmek için önceden soğutulmuş tornavida kullanın.
    3. TEM ızgara almak ve TEM tutucu içine yerleştirmek için önceden soğutulmuş cımbız kullanın.
    4. TEM tutucu üzerine TEM ızgara tutturmak için soğutuldu hexring kullanın.
    5. Cryo-devret TEM sahibinin deklanşöre kapatın. Numune aktarım adım çok önemlidir ve küçük TEM örnek görünürlüğünü azaltarak azot gazı engel olabilir.
    6. Pompalama sisteminden Cryo-aktarma istasyonu çıkarın ve birlikte cryo transfer TEM sahibinin ısıtıcı denetleyicisi ile, TEM yakınında taşımak.
    7. TEM basınç kabinine destek hattı pompa TEM turbomoleküler Pompayı başlatın.
    8. -70 ° 'lik bir eğim * için TEM örnek sahne.
    9. Kuru azot gazı ile tasfiye sadece bir döngüsü ile, hava kilidi (30-60 sn) için kısa pompalama zamanı ayarlayın.
  6. Cryo-devret TEM tutucu üzerinde koruyucu kapak kapalı olduğundan emin olun. Cryo-aktarma istasyonuna TEM yuvasını çıkarın ve (sıvı azot TEM tutucu Dewar fışkıracak) eğik gonyometresi takın. Pompalama döngüsü başlayacaktır. Döngüsü tamamlandıktan sonra, 0 ° 'ye geri yatırmak için gonyometre ayarlanır ve, bu gonyometre ile dönmez, böylece, aynı zamanda, TEM tutucu tutun. TEM içine tam olarak yerleştirin. Bu adım sırasında, cryo-TEM aktarma tutucu sıcaklığını ölçmek için olan ısıtıcı kontrolöre bağlı olmalıdır. TEM numune tutucu eklemek için prosedür farklı dardı arasında değişebilir. Bu nedenle uygun yordamı almak için TEM üreticisine başvurmanız tavsiye edilir.
  7. Cryo-devret TEM tutucu Dewar doldurun. Kabul edilebilir bir seviyeye ulaşmak için TEM vakum için bekleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada biz kullandı: Bir nanomanipulator ve cryo-hazırlık odası ile donatılmış bir çift kiriş FİB / SEM; cryo-aktarım tutucu ile TEM; Bir prototip cryo-aktarma istasyonu. Anticontaminator (AC) cryo hazırlık odasının küreme nanomanipulator (NM) ucu Gatan tarafından modifiye edildi. Standart bir cryo-hazırlama odasına ile ilgili olarak, AC bıçaklar NM ucu için daha büyük bir ısı alıcı temin etmek üzere daha büyüktür. Ayrıca, AC NM ucu ile, ısı değişimi için Cu örgü bağlamak için kelepçeler ile donatılmıştır. FIB / SEM pnömatik NM olmasını sağlamak için modifiye edildi ve numune, oda gevşetildi bile takılı kalır. Bu çalışmada kullanılan parametreler iyi yukarıda listelenen ekipman için uygun olduğunu belirtmek gerekir; Bu parametreler, diğer ekipmanlardan çalışırken ayarlanabilir için gerekli olabilir. Bu protokol ile çalışmak, kriyojeni işlemek için normal önlemler, sıvı azot ve vakum sistemleri olmalıdırizlenmelidir.

Yöntem, çözeltiler veya nano-tanecikleri içeren bir polimer matrislerinden, nematodlara karşı tek hücreli organizma kadar, iyi sonuçlar numune farklı tipleri üzerinde test edilmiştir. Prosedürün çeşitli adımlar örnekleri, A., Şekil 1-12 ile ilgili olarak tasvir edilmiştir niger sporları osmiyum tetroksit ve potasyum permanganat ile boyanmıştır. Sporlar ilk çıkarılması için siteyi tanımlamak için (Şekil 1) SEM ile görüntülenmiş. Bu durumda, herhangi bir sporlu bir kesit yeterli olduğu, ancak, alt-mikrometre hassasiyet ile ekstre için ROI pozisyon, örneğin, hücre zarından belirli bir mesafede belirli bir hücre dilim mümkündür. Ilgi çekici bir özelliği tespit edildikten sonra, cryo-Pt çökelme ilk adımı iyon öğütme ışınlamak hasardan korumak için örnek (Şekil 2) uygulanmıştır. Numune, ilk adımlar o devam etmek için 52 ° eğildiğif freze (Şekil 3): lamelinin her iki tarafında iki açmalarının püskürtme. Numune, daha sonra geri çevrilmiş ve daha fazla toplu bağlayarak sadece iki küçük köprü (Şekil 4) geride bırakmak üzere öğütülür. Soğutulan nanomanipulator lamel ile temas eder (Şekil 5) ve Pt bir kriyo-çökeltme birbirine lehimler (Şekil 6) haline getirilir. Küçük bağlayan köprüler sonra uzakta öğütülür ve NM TEM ızgara eki alanının o Pt nihai cryo-birikimi (Şekil 8) ile lehimli (Şekil 7), yakın olan tabakalara hareket edilir. NM daha sonra iyon demetiyle saydamlık (Şekil 10 ve 11) elektron aşağı doğru incelir, lamel (Şekil 9) ayrılır. Lamel son olarak TEM (Şekil 12) transfer edildiği durumlarda, yüksek çözünürlüklü spektroskopi, bilgisayarlı tomografi ve diğer teknikler can kullanılabilecektir.

figure-results-1
Şekil 1. A. sporlarının Cryo-SEM görüntüsü Pt birikimi önce niger,.

figure-results-2
Şekil 2,. Pt yerleştirilmesinden sonra Şekil 1 'de kurumadan önceki aynı alan.

figure-results-3
Şekil 2'de, aynı alan Şekil 3,. Cryo-SEM resmi, siper öğütme ile, Pt birikimi ve sertleştirme sonrası, 52 ° eğimli devam(3.7 adıma bakınız).

figure-results-4
Asansör-out için hazır Şekil 4. Lamella.

figure-results-5
Şekil 5. Soğuk nanomanipulator ucu lamel ile temas eder.

figure-results-6
Şekil 6,. Ikinci bir Pt cryo-çökelme nanomanipulator ve tabakalara birlikte lehim için kullanılır.

: fo içerik-width = "5in": fo mg alt = "Resim 7"
Şekil 7,. Soğuk nanomanipulator TEM ızgarasının bağlanma alanına tabakalara transfer etmek için kullanılır.

figure-results-7
Şekil 8. Cryo-birikim TEM şebekeye tabakalara takmak için bir kez daha kullanılır.

figure-results-8
Şekil 9. Lamella nanomanipulator serbest kesilmiş ve artık depolama veya şeffaflık elektron inceltme ya hazırdır.

figure-results-9
Şekil 10. Incelme bir ara adım, enine kesitte görülebilir birkaç sporlarla.

figure-results-10
. Son inceltme sonra numunenin 11 Cryo-SEM görüntüsü Şekil; Diğer sporların çoğu lamel kıvrılmaya başlayana için uzak öğütülecek gerekiyordu.

figure-results-11
Şekil 12.. Lamelinin bir kompozit kriyo-TEM resim. Al saplama kısmı dahil edilmiştiryapraklardan (siyah ok).

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, oda sıcaklığında malzeme biliminde kullanılan standart FIB / TEM numune hazırlama kriyojenik sıcaklıklara oldukça basit bir uyarlamasıdır. Numune yüzeyi ise homojen olmayan bir perdeleme oluşabilir, ancak bir yöntem olup, bir deformasyon ve bıçak işaretleri (microtomy en önemli dezavantajı) serbest TEM örnekleri üretir. Pürüzsüz ve 13 özelliksiz kadar bu tedavi, bir kapatma tabakası (Bu çalışmada kullanılan Pt), kriyo-birikimi ile azaltılabilir. Çok farklı sertlik bileşenleri olan örnekler bu hazırlama esnasında stres altında kıracak riski olmadan de hazırlanabilir. Iç gerilmeler hala ince lamel bölümün boyutu azaltılmalıdır, bu durumda, viraj ya da bükülmesine neden olabilir. Diğer yönteme göre bir dezavantajı nedeniyle iyon kiriş ve numunedeki iyonlarının olası implantasyon maruziyete biyolojik yapısını değiştirmek için olasılığıdır. Bu sakıncalar da örnek HAZIRLIK oda sıcaklığında meydana gelirmalzeme bilimi 15. lenmesi. Bu iyonlar (500-1000 V) için en düşük hızlandırma gerilimi son bir cilalama aşaması ile incelme tamamlayarak azaltılabilir. Bu çok nazik parlatma adım lamel hasarlı tabakayı ortadan kaldırır.

Nedeniyle Cryo-birikimi (3.5, 3.10 ve 3.13 adımları) doğası gereği, numunenin büyük parçalar böylece orijinal yüzey görünümü engellemekten, işlenecektir. Bu adımda 3.3 önerildiği gibi birden işaretler kullanılmadığı sürece zor, ROI takip yapabilir.

Adımlarla hava ile temas 4.5 ve 4.7 ince lamel riskler sırasında. Bu muhtemelen önemli özellikleri örtücü noktasına, numunenin yüzeyi üzerinde buz kristallerinin oluşturulması için havada nem neden olur gibi kaçınılması gerekir. Bu adımlar, mümkün olduğu kadar çabuk yapılması gerekir, ama aynı zamanda da aktarımı sırasında bir yanlış ele numunenin kaybına yol açması muhtemeldir itkendini. Bu kullanıcı gerçek bir örnek üzerinde bir girişim yapılmadan önce boş TEM ları kullanarak bu adımları uygulamaları önerilir.

Malzeme bilimi, FİB enstrüman ticarileştirilmesi bir on yıl içinde TEM numune hazırlama baş yöntem haline gelmiştir. Hemen hemen her türlü örnek kullanılabilir olduğundan, numune tipine göre hazırlama tekniği uyarlamak için gereksinimini ortadan kaldırır. Önemle aynı, kriyojenik sıcaklıklarda burada ayrıntılı prosedür sayesinde olabilirdi inanıyorum. Büyük numuneler için uygulama hala kriyo korumak bir vitrifiye devlet onları yeteneği tabidir, ancak, 3,5 donma gibi dalma-donma veya yüksek basınç gibi teknikler bu sorunun en iyi çözüm olarak kanıtlamak olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma 7.ÇP Kapasiteler Programı (Grant No INFRA-2010-262163) kapsamında Avrupa Topluluğu Araştırma Altyapıları tarafından finanse QNano Projesi http://www.qnano-ri.eu destek aldı.

Biz de mali destek için araştırma konseyi FORMAS teşekkür ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Strata DB 235FEIFIB/SEM
Omniprobe 100Oxford InstrumentsNanomanipülatör
Alto 2500GatanCryo hazırlama odası
Cryo tutucu model 626GatanCryo transfer TEM tutucu
Tecnai F30FEITEM

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Echlin, P. Low Temperature Microscopy and Analysis. , Plenum Press. New York. (1992).
  2. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. J. Struct. Biol. 180, 572(2012).
  3. Studer, D., et al. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285(2001).
  4. Umrath, W. Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy. J. Microsc. 101, 103(1974).
  5. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, 34(2003).
  6. Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. , Academic Press. London. (1989).
  7. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. Introduction to Focused Ion Beams. , Springer. New York. (2005).
  8. Marko, M., et al. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy. Nat. Methods. 4, 215(2007).
  9. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 172, 180(2010).
  10. Rigort, A. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).
  11. Hsieh, C., et al. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. J. Struct. Biol. 153, 1(2006).
  12. McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. J. Microsc. 131, 1(1983).
  13. Hayles, M. F., et al. A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens. J. Microsc. 226, 263(2007).
  14. Pettersson, H., et al. A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision. Microsc. Microanal. 19 (1), 73(2013).
  15. Wätjen, J. T., et al. Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact. Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902(2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kriyo TEM rne iFIB LamellasKriyo SEM Haz rlamaNano Manip lat rTEM Izgara TransferiKriyo Transfer stasyonuElektron effafl

İlgili makaleler