Hücresel ve moleküler neotissue oluşumu hakkındaki bilgi geliştirmek için, TEVG bir fare modeli yakın zamanda geliştirilmiştir. Greftler C57BL / 6 farelerinde Infrarenal vena kava araya girme greft olarak implante edildi. Bu model bizim klinik araştırmada elde edilenlere benzer sonuçlar elde, ama çok kısaltılmış zaman zarfında.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Modeli Inferior Vena Cava İnterpozisyon Greft İmplantasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Kemik iliği mononükleer hücreler (BMCS) ile ekildi biyobozunur iskelelerinin genellikle doğumsal kalp anomalileri tedavi rekonstrüktif cerrahi için kullanılır. Uzun süreli klinik sonuçları darlık önemli insidans, ancak mükemmel açıklık oranları gösterdi. Vasküler neotissue oluşumu hücresel ve moleküler mekanizmalarının araştırılması ve doku mühendisliği damar grefti (TEVGs) içinde darlık gelişimini önlemek için, biz yaklaşık 1 mm iç çapı ile greft bir fare modeli geliştirdi. İlk olarak, TEVGs bir poliglikolik asit dokunmamış imal edilmiş biyolojik olarak parçalanabilir boru şekilli iskeleler monte edilmiştir ε-kaprolakton ve L-laktid kopolimeri ile kaplanmış ağ hissetti. Iskeleler, daha sonra bir dondurarak kurutucuda yerleştirilen 24 saat boyunca vakumlu ve hücre tohumlama kadar bir desikatör içinde depolanmıştır. İkinci olarak, kemik iliği donör farelerden toplandı ve tek çekirdekli hücreler yoğunluk gradyan santrifüjü ile izole edilmiştir. Üçüncü olarak, yaklaşık bir milyon hücre idibir yapı iskeleti üzerine ekildi ve O / N inkübe Son olarak, tohumlanmış iskeleler sonra C57BL / 6 farelerinde Infrarenal vena kava araya girme greft olarak implante edildi. Implante greftler tromboembolik komplikasyonlar veya anevrizmal oluşum kanıt olmadan mükemmel açıklık (>% 90) gösterdi. Bu fare modeli anlayış bize yardım ve TEVG içinde neotissue oluşumu hücresel ve moleküler mekanizmaları miktarının olacaktır.
Giriş
Konjenital kalp kusurları ABD'de canlı doğumların yaklaşık% 8 etkileyen ciddi durumlardır. Konjenital kalp kusurları veya 2.4 1.000 canlı doğum olan bebeklerin yaklaşık% 25'i, hayatlarının 1 ilk yıl invaziv tedavi gerektirir. Konjenital kalp hastalığı için en etkili tedavi rekonstrüktif cerrahi olduğunu. Ne yazık ki, mevcut vasküler kanalların kullanımından kaynaklanan komplikasyonlar ameliyat sonrası morbidite ve mortalitenin en önemli nedenidir.
Bu sorunu çözmek için, klinik kullanım 2 için ilk doku mühendisliği vasküler greft (TEVGs) geliştirdi. TEVGs otolog kemik iliğinden elde edilmiş tek-çekirdekli hücreleri (BM-MNC) ile tohumlandı ve konjenital kalp ameliyatı venöz kanalları olarak implante edilen biyolojik olarak parçalanabilir polyester tüplerden inşa edilmiştir. Sonuçlar takipte 1-3 yıldır mükemmel açıklık oranları gösterdi, ama darlığının önemli insidansı 3,4 kadar. Bu vasküler neotissue oluşumu ve TEVG darlık gelişimini altında yatan mekanizmanın daha iyi anlaşılması gerektiği açıktı. Daha TEVGs gelişimini ve darlık gelişme mekanizmasını anlamak için, bir koyun bir model 5,6 oluşturuldu. Bu modelde, TEVGs başarılı bir şekilde canlı damarları içine transforme edildi ve morfolojisi ve ana damarlar fonksiyonu hem de benzerdi. Büyük bir hayvan modelinin bu kullanımı TEVGs klinik kullanımını destekli önemli klinik öncesi bilgi veren iyi bir ilk adım oldu. Ancak, büyük hayvan modelleri kullanılarak TEVGs vasküler neotissue oluşumu hücresel ve moleküler mekanizmaları tam anlaşılması nedeniyle türlerin spesifik moleküler araçlar eksikliği nedeniyle vasküler hücre fenotipleri moleküler karakterizasyonu kısıtlamalar sınırlıdır. Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, TEVGs bir murin modeli fare genetik hızlı ilerleme ve geniş Molecula nedeni ile geliştirilmiştirdaha kısa bir zaman ölçek ilave avantajı ile r karakterizasyonu.
Sıçangil modeli IVC araya girme sadık büyük hayvanlarda ve insanlarda meydana neoveseller oluşum sürecini değinmeyecek ama çok daha kısa bir zaman süreci boyunca 6-9. Burada, biyolojik olarak parçalanabilir yapı iskelesi kullanılarak küçük ölçekli aşı üretimi için ayrıntılı bir protokol, BM-MNC hasat ve izolasyon, bir platform üzerinde BM-MNC tohumlama ve bir murin modelinde greft tarif edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bütün hayvan prosedürleri Nationwide Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1.. Greft İmalat
- Bir davlumbaz altında 2 ml dioksan içerisinde 100 mg P (LA / CL) eklenerek ε-kaprolakton ve L-laktid kopolimeri P (LA / CL) çözeltisi olun. Bir girdap çözüm yerleştirin ve tamamen erimesi için 1-1.5 saat boyunca sürekli olarak karıştırınız.
- Bu arada, (PGA) dondurucu hissettim poliglikolik asit tabakasını kaldırmak ve birkaç 5 x 8 mm bölümleri kesip. Ayrıca sadece filtrenin üstünde bir 0.1-10 ul pipet ucu kesilmiş.
- Bir pipet ucunun uzak ucunda bir 19 G iğne (1.5 uzunluk) takın ve PGA mikro forseps kullanılarak iğnenin keçe sarın.
- 19 G iğne içine takıldığında ise dikkatlice, lümen bir kör 18 G iğne kullanılarak, yakın kısmı daha düz bir pipet ucu, distal ucuna keçeyi itin.
- Pipet40 ul P (CL / LA) üst ucu içine pipet çözeltisi. PGA çözümü ile hissetti doyurabilecek. Sonra pipet dağıtıcı kullanarak hava kabarcıkları dışarı itmek. Gerekirse bu işlemi tekrarlayın.
- Yer, 50 ml bir tüp içinde greft ve 20 dakika boyunca -80 ° C dondurucu içine yerleştirin. Iğnelerin baş aşağı doğru karşı karşıya olduğundan emin olun.
- Bir liyofilizerde içine tüp transferi ve 24 saat için vakum. Hava akımı oluşturacak şekilde tüpün kapağını açmak için emin olun.
- Greft dışarı atın ve iğnelerden çıkarın. A ~ 5 mm bölümünü terkeden greft iki ucunu kesme ve şeklini korumak için, iğnelerin üzerine geri koyun. Desikatörde greft tutun.
- Bir biyogüvenlik kaput O / N önce hücre tohumlama UV ışık altında iskele yerleştirin.
2.. Kemik İliği Mononükleer Hücre Hasat ve İzolasyon
- Ketamin / ksilazin aşırı dozda (ketamin 200 mg / kg ketamin hidroklorid ve 20 mg / kg) ile fareler Euthanize.
- Kaldır kemikler (femur bir10 cc RPMI sahip bir Petri kabındaki 10 greft implantasyonu ve yer 3 fareden d tibias). 3 cc RPMI ile yeni bir Petri kabı, bir 25 G iğnesi olan bir şırınga kullanılarak, kemik ve kemik iliği gömme iki ucunu kesin. 15 cc tüpte kemik iliği ve RPMI çözeltisi toplayın ve BM arasında kalan toplamak için ek 2 cc RPMI ile petri yıkayın.
- Örnek (5-10 ul) alın ve bir otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre kullanarak hücre saymak. Sonucu kaydedin.
- 15 cc santrifüj tüpüne 5 cc Ficoll koyun ve kemik iliği ve RPMI çözüm ekleyin. Ficoll'ün ile karıştırma önlemek için çok nazikçe çözüm ekleyin.
- 24 ° C'de "HAYIR FRENİ" ile 30 dakika boyunca 528 x g'de santrifüj
- Üst pembe katmanı kaldırın. MNC katmanı orta berrak tabaka Şekil 1, toplayın, ve PBS 01:01 ile sulandırmak.
- 24 ° C'de 10 dakika boyunca 528 x g'de santrifüj solüsyonu inceltilmiş MNC
- Süpernatantı ve di kaldırud 5 ml PBS ile pelet.
- 24 ° C'de 10 dakika boyunca 528 x g'de topak çözeltisi santrifüj
- Süpernatant kaldırmak. RPMI (~ 200 ul) uygun miktarda pelet seyreltin.
- 5-10 ul örnek almak ve bir otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Sonucu kaydedin. Bir kez daha sayım hücreyi tekrarlayın ve ortalama hücre sayısını hesaplamak.
- RPMI kullanarak ul 1.000.000 cells/10 hücre konsantrasyonu sulandırmak.
3.. Hücre Serpilmesi
- 5 dakika boyunca luminally 5 ul RPMI ilave edilerek ön ıslatılmış iskele, sonra RPMI çıkarın.
- Iskele lümen Adım 2.12 RPMI 10 ul kemik iliğinden elde edilen mono nükleer hücreleri ekleyin ve 10 dakika hücreleri iskele üzerine takmak için izin için bekleyin.
- 1 cm uzunluğunda bir 19 G iğne Kesme ve iskele şeklini korumak için, skafoldun lümeni içine iğne koydu. Bir 24-çukurlu plaka içindeki örnek yerleştirin.
- Her kuyuya 1.000 ul RPMI ilave edin ve bir kuluçka makinesi içinde O / N inkübe edin.
4. Greft İmplantasyonu
- Ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler otoklava sokun: ince makas, 3x mikro forseps, 2x mikro vasküler kelepçeler, 1x kelepçe uygulayarak forseps, 1x mikro iğne tutucu, 1x yaylı makas, 1x ekartörünü 1x.
- 6-8 haftalık dişi C57BL / 6 doku mühendisliği damar grefti alıcı olarak kullanılır. Kafesinden fare çıkarın ve ağırlık, daha sonra bir ketamin / ksilazin kokteyl (ketamin 100 mg / kg ketamin hidroklorid ve 10 mg / kg) ile karnın alt sağ çeyrek dairesi içine bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla anestezi. Ketoprofen (5 mg / kg, IP) bir ön anestezi analjezik olarak kullanılır.
- Masal sıkıştığı tarafından sedasyon seviyesini kontrol edin, sonra karın saç klibi. Steril Oftalmik merhem ile gözleri yağlayın ve bir yastık üzerinde bir dorsal recumbence pozisyonda fare yerleştirin. Betadine ve alkol pedleri ile karın dezenfekte edin. Costeril bir örtü ile fareyi ver ve sadece kesi alanı açığa.
- Suprapubik bölgeye xiphoid aşağıdan bir orta hat laparotomi kesi yapmak ve bir öz-istinat ekartörünü yerleştirin. Tuzlu çözelti ile nemlendirilmiş gazlı bez bağırsakları sarın. Açık açık infrarenal aorta ve vena kava tanımlar.
- Proksimal ve aort ve vena kava distal taraflarında iki mikro vasküler kelepçeler yerleştirin sonra açık açık vena kava transekt vena kava gelen aort ayrı. Gerekirse, konik iğne üzerinde 10-0 monofilament sütür ile abdominal aort dalları Arter.
- Steril 10-0 sütür kullanılarak anastomoz sonuna yakın ve uzak ucu ile alt vena kava interpozisyonundan greft dikiniz. Fare anatomisine bağlı greft, genellikle 1-2 mm, Trim. Proksimal ve distal uçlarında hem bir tane dikiş greft elde edin ve greft diğer taraftan 4-5 stiches sürekli dikiş başlar. Ön tarafı bitirdikten sonra, kelepçeler ve greftler çevirmekdiğer tarafa ve greft arka tarafını dikin. Implantasyon sırasında, akut trombozu önlemek için sık sık heparin solüsyonu ile greft yıkayın.
- Proksimal kelepçesini çıkarın ve bir topikal emilebilir steril hemostat ajanı uygulayarak kanamayı kontrol. Kanama tamamen durduğunda, distal kelepçesini çıkarın ve kanama aynı şekilde kontrol. Greft içinden emin kan akışları olun.
- Dahil dişli bir iğne ile 6-0 siyah bir poliamid monofilament dikiş ile iki kat olarak abdominal kas ve deri kapatın.
- 0.5 ml serum fizyolojik subkutan enjekte edilir ve fare tamamen mobil kadar bir ısınma pad üzerinde bir kurtarma kafes fare yerleştirin. Kurtarma üzerine, kağıt yatak ile yeni kafesine fareyi dönmek. 48 saat boyunca ağrı ilaç (ibuprofen, 30 mg / kg, içme suyu) ver.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TEVG implantasyonu şematik, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kemik iliği, verici bir fare hasat edilmiştir ve mono nükleer hücreler yoğunluk santrifüj ile izole edildi ve daha sonra biyolojik olarak parçalanabilir bir yapı iskeleti üzerine ekildi. Numaralı seribaşı iskeleleri O / N bekletilir ve bir alt vena kava greft interpozisyonu gibi bir alıcı fareye implante edildi.
Şekil 2, PGA-P (CL / LA) iskele taramalı elektron mikroskobu göstermektedir. Iç çapı yak...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
TEVG fare modeli neotissue stenoz oluşumu ve geliştirilmesi hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir araçtır. Tohumlanmış BM-MNC greft 11 tohumlanmış hücreleri hem histolojik ve SEM görüntüleri gösterilmiştir. Hücre Ekme etkinliği, bir DNA deneyi 7 ile gösterilmiştir. Bu model sistemi kullanarak biz cep tohumlama insan klinik deneme 3 başarısızlık birincil modu oldu TEVG stenoz, gelişiminin insidansını azalttığını göstermiştir. Tohumlanmış hücreleri hızla bir parakr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma CKB için NIH (RO1 HL098228) bir hibe, kısmen desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Poliglikolik asit (PGA) keçe | Biyomedikal Yapılar | Custome sipariş | |
| edilen Pipet ucu, 0.1-10 μ l | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Liyofilizatör | Labconco | 7070020 | |
| RPMI ortamı 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| Petri kabı | BD | 353003 | |
| 24 kuyulu plaka | Corning | 3526 | |
| 15 cc tüp | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | 'Histopak' olarak da |
| adlandırılırDPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Littauer kemik kesici 4.5 "Düz | Roboz | RS-8480 | BM hasat |
| Forseps için 4.5" | Roboz | RS-8120 | BM hasat |
| için Makas 4.5 " | Roboz | RS-5912 | BM hasat |
| Mikroskobu | için Leica | M80 | |
| C57BL / 6J (H-2b), Kadın | Jackson Laboratuvarları | 664 | 8-12 hafta |
| Ketamin hidroklorür enjeksiyonu | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Ksilazin steril çözeltisi | Akorn Inc. | NADA # 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Hayvan Sağlığı | NDC 0856-4396-01 | |
| İbuprofen | Hassas Doz | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin sodyum | Sagent Farmasötikler | NDC 25021-400 | |
| Tuzlu su çözeltisi (steril% 0.9 sodyum klorür) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| %0.9 Sodyum klorür enjeksiyonu | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum oftalmik merhem | Dechra Veterinerlik Ürünleri | NDC 17033-211-38 | |
| İyot hazırlama pedleri | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alkol hazırlama pedleri | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Pamuk uçlu aplikatörler | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| İnce makas | FST | 14028-10 | |
| Mikro adson forsep | FST | 11018-12 | |
| Forsep uygulayan kelepçe | FST | 00072-14 | |
| S & T Vasküler kelepçe | FST | 00396-01 | |
| Yaylı makas | FST | 15008-08 | |
| Colibri ekartörleri | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 forsep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - ince forseps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 forseps | FST | 11251-35 | |
| Tish iğne tutucu/ forseps | Micrins | MI1540 | |
| Siyah poliamid monofilament sütür, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Greftin dikilmesi için |
| Siyah poliamid monofilament sütür, 6-0 | AROSurjik Aletler | SN-1956 | Kas ve cilt kapanması için |
| Dokumasız süngerler | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Emilebilir kanama | durdurucu Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Şırınga | BD | 309659 | |
| 3 ml Şırınga | BD | 309657 | |
| 18 G 1,5 inç, İğne | BD | 305190 | |
| 25 G 1 inç, İğne | BD | 305125 | |
| 30 G 1 inç, İğne | BD | 305106 | |
| Sıcak su sirkülatörü | Gaymar | TP-700 | |
| Isıtma pedi | Gaymar | TP-22G | |
| Düzeltici | Wahl | 9854-500 |
Kaynaklar
- Heart Association, A. merican Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
- Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
- Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
- Shin'oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
- Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
- Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
- Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
- Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
- Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
- Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
- Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
