Bu protokol, farelerin kurban edilmesini gerektirmeden femur kemik iliğinin (BM) seri örneklemesi için bir prosedürü tanımlar. Bu prosedür, farelerin BM bileşiminin zaman içinde uzunlamasına çalışmalarını kolaylaştırır ve ex vivo ve transplantasyon çalışmaları için BM içindeki hücrelere seri erişim sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Kemik iliğinin (BM) hücresel bileşiminin seri örneklemesi, klinik hematoloji için kritik olan rutin bir prosedürdür. Bu protokol, BM'de bulunan hücrelerin seri karakterizasyonuna izin veren canlı farelerde benzer bir prosedür için ayrıntılı bir adım adım teknik prosedürü açıklar. Bu prosedür, örneğin ksenogreft çalışmalarında olduğu gibi, farelerin BM'si içinde eksojen olarak uygulanan hücrelerin varlığını tespit etmeyi amaçlayan çalışmaları kolaylaştırır. Ayrıca, bu prosedür, hematopoietik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) gibi BM'de zenginleştirilmiş hücrelerin farelerden fedakarlık edilmeden alınmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Periferik kanın hücresel bileşiminin, kemik iliğinde bulunan kök ve progenitör hücrelerin oranlarını ve tiplerini mutlaka yansıtmadığı göz önüne alındığında, farelerin sonlandırılmasını gerektirmeden bu bölmeye erişim sağlayan prosedürler çok faydalıdır. Femoral kemik iliği aspirasyonunun kullanımı, kemik iliği hücrelerinin sitolojik analizi, hematopoietik kök / progenitör kompartmanın akış sitometrik karakterizasyonu ve konvansiyonel ilik hasadı ile karşılaştırıldığında femoral BM aspirasyonu ile elde edilen sıralanmış HSPC'lerin kültürü için burada gösterilmiştir.
Giriş
Tüm kan hücreleri hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) türetilir. Farelerde ve insanlarda HSC'lerin büyük çoğunluğunun bulunduğu kemik iliğine (BM) hayvan kurban etmeye gerek kalmadan erişime izin veren prosedürler, hematopoez kaynağını seri olarak izlemek için bir kaynak sağlar. Burada açıklanan prosedürün genel amacı, farelerin feda edilmesi yoluyla BM hücrelerinin geleneksel olarak toplanmasıyla elde edilecek hücrelerin materyal temsilini sağlayan canlı farelerin uyluk kemiğinden BM hücrelerinin örneklenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlamaktır. Bu prosedürün BM hücrelerinin konvansiyonel hasadına göre avantajı, bu prosedürün farelerin feda edilmesini gerektirmemesi ve bu nedenle farelerin kemik iliği bölmesinin zaman içinde uzunlamasına çalışmasına izin vermesidir.
Her ne kadar bu murin kemik iliği aspirasyon prosedürü bir dizi çalışmada kullanılmış ve daha önce tarif edilmiş olsa da (bakınız Sundberg ve ark. Tarihsel bir inceleme için1), bu tekniği gösteren resmi adım adım prosedürler daha önce yayınlanmamıştır. Bu protokol, fareye eksojen olarak sokulan hücrelerin BM'sindeki aşılamanın değerlendirilmesi (örneğin ksenogreft çalışmalarında yapılacağı gibi) gibi amaçlar için BM'nin rutin seri örneklemesini mümkün kılar (örneğinksenogreft çalışmalarında yapılacağı gibi), periferik kanınkiyle karşılaştırmak için BM'deki kimerizmin analizi (sonuçların mutlaka uyumlu olmadığı durumlarda), hematopoietik kök ve progenitör hücreler gibi normalde ilikte zenginleştirilmiş spesifik hücre tiplerinin bolluğunun izlenmesi, ve ex vivo kültür ve / veya transplantasyon için BM hücrelerinin alınması. Ek olarak, ilik içeriğinin değerlendirilmesi, hematolojik hastalığın murin modellerinde çok yararlı olabilir, çünkü aspirasyon, periferik kanda hastalığın belirgin olmadığı zaman noktalarında hematolojik hastalık yükünü değerlendirmede yardımcı olur3-5. Ayrıca bu teknik, kemik iliğindeki hematolojik hastalığın terapötik çalışmalarda kullanılan ilaçlara yanıtını değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu nedenle, burada açıklanan prosedür, sitolojik analiz, akış sitometrik analizi, in vitro kültür ve / veya in vivo transplantasyon çalışmaları için farelerden kemik iliği hematopoietik hücrelerine farelere fedakarlık veya zarar vermeden erişim elde etmek isteyen araştırmacılar için idealdir.
Burada tarif edilen BM örnekleme protokolü, materyalin doğrudan kemik iliği boşluğuna intrafemoral enjeksiyonu için kullanılan tekniğe oldukça benzer3,6. Temel fark, bu protokolün, intrafemoral enjeksiyonda olduğu gibi materyali doğrudan kemik iliği boşluğuna damlatmak yerine, hücrelerin ilikten çıkarılması prosedürünü detaylandırmasıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolü açıklanan tüm hayvan prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber uyarınca yapılmıştır ve Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUCs) tarafından onaylanmıştır.
Femur Kemik İliği 1. Aspirasyon (BM) Hücreler
- Hassas bir buharlaştırıcı ile uygulanan izofluran (% 1-4) ile femur kemik iliği aspirasyonu geçirecek fare anestezisi. Anestezi derinliği cerrahi manipülasyon ve / veya kulak, ayak ve kuyruk tutam ile ilişkili solunum hızında herhangi bir değişiklik olmadığını gözlemleyerek işlem boyunca her 5-10 dk izlenmelidir. Anestezi izofluran ile indüklenen ve izofluran ile işlem boyunca korunur. 0.05-0.1 mg bir dozda buprenorfin bir rüçhan işlem öncesi doz / kg deri altından, her 6-12 saatte bir adj tarif edilen prosedür ile bağlantılı ağrıyı önlemek için kullanılabilirCarprofen için UNCT.
- Kornea kurumasını önlemek için anestezi fare aşağıdaki indüksiyon gözleri oftalmik merhem sürün.
- Kürk dikkatli bir şekilde amaçlanan aspirasyon sitenin alanından daha yaklaşık olarak% 150 daha büyük bir deri bölgesinden kırpılır. Gevşek kürk nemli bir gazlı bezle kaldırılır. İşlem sırasında hipotermi önlemek için dolaşan sıcak su yastığı veya başka güvenli bir termostatik kontrol yüzeyi üzerinde fareyi tutun lütfen.
- (Povidon-iyot (Betadinede) veya klorheksidin (Nolvasan) çalılık ve% 70 izopropil alkol veya% 70 etanol batırılmış gazlı bez ve sünger ile ya dönüşümlü) alternatif scrubs üç set ile aspirasyon geçirecek femur içeren tüm bacak dezenfekte edin.
- BM aspirasyon önce steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile:,: 0.5 ml tüberkülin şırınga (27.5 G ölçer 0.5 cc hacim) ıslatın. PBS 200-500 ul şırınga doldurun ve hemen PBS kovmak. Bu işlem 2-3 t tekrarlayınimes.
- Yüzük parmağı veya beşinci parmak biriyle tibia iterek femur tibia bükük tutun. Uygun anestezi uçak elde edildiğini teyit. Şırınga başparmak ve işaret parmağı kullanılarak yapılır. Bu kondil maruz sağlar ve iğnenin yerleştirilmesini kolaylaştırır.
- İğne femur iki kondillerin arasında güvenli bir şekilde açılmış, böylece şırınga ıslatma sonra patellar tendon boyunca iğne takın. Baş parmak ve işaret parmağı ile femur epifiz yakın gövdesini tutarak, iğne kolayca femur şaft içine sokulur.
- Bu femur şaft ile paralel olacak şekilde dışarı ve yukarı doğru iğne çevirin. Bu eylem, femur milinden kemik iliği içeriğinin alma kolaylaştırır.
- Femoral kemik iliği boşluğuna yavaşça iterken saat yönünün iğne saat yönünde çevirin ve. Nazikçe sy hareket ettirerek iğnenin doğru konumlandırılmasını onaylayınyanal Ringe.
- Ileri ve geri BM boşluğu içinde iğne hareket ederken nazikçe, negatif basınç oluşturarak, geri iğne pistonu çekin. Not: BM aspire hacmi, tipik olarak 0.4-0.8 x 10 6, tek çekirdekli hücreler karşılık gelen yaklaşık 5 ul olacaktır. Başarılı aspirasyon şırınganın tabanında iğnenin üst kan görünümü görsel olarak teyit edilecektir. Kan şırıngaya görülür ise küçük bir kemik veya doku parçası iğne kalmış olması muhtemeldir. Bu, (bu, şırınga BM aspire önce PBS ile doldurulmuş olmalıdır bir nedeni de budur), PBS içinde yukarı ve aşağı hareket eden piston ile iğne kaldırılabilir. Doku şırınga yerinden olamaz, yeni bir iğne ve şırınga (tekrar PBS 200-500 ul şırınga ıslak) kullanın.
- BM başarıyla femur aspire edildikten sonra, femur ve fareden iğne ve şırınga çıkarın.
- Bir mikrofuge'de tüp pr aspire BM Taşı500 ul PBS ile efilled. Bir çok uygulama için, BM Hücreler daha sonra daha fazla işlem mümkünse kadar buz üzerinde tutulmalıdır.
- İşlemin tamamlanmasından sonra, 5 mg / kg deri altından karprofen ile analjezik yönetmek. Sonra anestezi fareyi kaldırmak ve tamamen iyileşti kadar ısıtılmış bir yastık üzerine yerleştirin. NOT: düzgün yapılmazsa eğer aspirasyon prosedürü izleyerek deneyimli hiçbir komplikasyon veya sıkıntı olmamalıdır.
- Konut alanına fareler dönmeden önce, yiyecek ve su yürümelerine ve ulaşabiliyorlar sağlamak. Sonraki 24 saat içinde sıkıntı ya da enfeksiyon sonrası prosedür belirtileri fareler gözlemleyin. Belirtileri şunlardır: sürekli kanama, anemi, uyuşukluk. Bu belirtilerden herhangi sonrası prosedürü görülürse, hayvan (lar) ötenazi olmalı. Not: BM aspirasyon / numune tekrar edilebilir, ancak tekrar prosedür aynı bacağa tekrar travma önlemek için karşı femur üzerinde gerçekleştirilmelidir. Fr ile ilgili çok az bilgi vardırequency ki BM aspirasyon yapılabilir. Femoral Kemik iliği aspirasyonu genellikle artık daha sık her 2 haftadan daha tekrarlanır.
Emişli BM hücrelerinde hücresel İçerik 2. Değerlendirilmesi
- 4 o C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile bir mikrofüj tüpüne BM aspirasyon ve yerden alınan Pelet hücreleri.
- Süpernatan aspire ve ACK alyuvar lisiz tamponu ("amonyum-klorür, potasyum-" lizis tamponu) içinde 500 ul pelletini.
- 10 dakika boyunca, kırmızı hücre lisis tamponu hücreleri inkübe edin ve daha sonra PBS içinde 1 ml ekleyin ve o 4 C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar karışımı aşağı doğru döndürün. Not: Kırmızı kan hücresi lize topağı hemen BM mononükleer hücrelerden oluşur. Bu FACS boyaması, hücre sayımı, transplantasyon, sitospin analiz ve / veya herhangi bir başka kullanım (öldürülür farelerden toplanan BM hücrelerinin kullanılacak gibi) için yeniden süspanse edilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Canlı bir C57/B6 fare femur BM aspirasyon kurban etme işleminden sonra, aynı fare BM geleneksel hasat ardından BM mononükleer hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Her iki yöntem ile elde edilen BM mononükleer hücreleri daha sonra, BM hücrelerinin (1), sitolojik analizi ile analiz (2) hematopoietik kök / progenitör hücrelerin nispi frekansı (HSPCs) belirlenmesi ve sıralanmış HSPCs (3) ex vivo kültür edilmiştir. Ikinci deney, soy-negatif SCA1 + c-KIT In + (LSK'ya) hücreleri BM aspirasyon ile hem de BM ge...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Seri BM aspirasyon insanlarda hematolojik hastalıkların klinik araştırma için kritik bir rutin bir işlemdir. Uzun deneyler boyunca hücresel bileşiminde ve BM bileşenlerinin karakterizasyonu için farelerde DM'nin benzer bir seri örnekleme gerçekleştirme yeteneği aynı şekilde çok değerlidir. Bu prosedür, fare ödün vermeden, aynı zamanda periferik kan içeriği BM yaşayan hücrelerin yansıtıcı olmayabilir durumda BM ek hücre tiplerinin varlığını tespit etmek için HSPC en karakterizasyonu için yararlıdır. Seri BM aspirasyo...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
O.A.-W., NIH K08 Klinik Araştırmacı Ödülü (1K08CA160647-01), ABD Savunma Bakanlığı Kemik İliği Yetmezliği Araştırmalarında Doktora Sonrası Araştırmacı Ödülü (W81XWH-12-1-0041), Josie Roberston Araştırmacı Programı ve Evan's Vakfı'nın desteğiyle Damon Runyon Klinik Araştırmacı Ödülü ile desteklenmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Sığır serum albümini | PAA | K41-001 | |
| ACK lizis tamponu | ev yapımı | pH 7.2 ~ 7.4'ü ayarlayın ve 0.22 & mu ile steril filtreleyin; m vakum filtresi. | |
| 8.3 g Amonyum klorür | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potasyum bikarbonat | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 & mu; l 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tüberkülin şırıngası 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Steril hücre süzgeci 70 & mu; m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| İzofluran, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Künt uçlu iğne | Kök Hücre Teknolojileri | 28110 | |
| PrecisionGlide iğne 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Şırınga Luer-Lok ucu | Becton Dickinson | 309657 | |
| Doku kültürü ile muamele edilmiş plaka, 6 Kuyu | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tüpler | Becton Dickinson | 352054 | FACS boyama |
| 12 x 75 mm 5 ml tüp hücre süzgeç kapaklı | Becton Dickinson | 352235 | FACS boyama |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G ve Ly-6C (Gr-1) APC-CY7 | Biyoefsane | 108423 | |
| Ter119 APC-CY7 | Biyoefsane | 116223 | |
| CD19 APC-CY7 | Biyoefsane | 302217 | |
| CD4 APC-CY7 | Biyoefsane | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | Biyoefsane | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-CY7 | Biyoefsane | ||
| CD34 APC Biolegend | 128612 | ||
| CD16 / 32 e450 eBioscience | 48-0161-82 | ||
| DAPI (4 & prime ;, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Metoselüloz kültürü için |
| Carprofen | Crescent Chemical Şirket | C11045850 | 1 doz (5mg / kg) & nbsp; |
| Akış sitometresi, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube veteriner merhemi (steril vazelin oftalmik merhem) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Kaynaklar
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
