Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Biz geliştirdik ve fare kemik iliği nakli deneysel model kullanılarak in vivo hematopozun incelemek için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hematopoetik kök hücrelerin (HSPCs) klonal takibi için metodoloji işaretleme floresan valide. Floresan proteinleri (FP) kodlayan Lentiviral vektörleri kullanılarak işaretleme Genetik kombinatoryel ileri mikroskopi görüntüleme yoluyla hücre kaderi haritalama etkin. Beş farklı FPS kodlayan vektörler: Shibuya, EGFP Venüs tdTomato ve MCherry renk işaretlenmiş hücrelerin çeşitli bir palet oluşturma, aynı zamanda HSPCs transdüksiyonu için kullanılmıştır. Konfokal / iki foton hibrid mikroskopi kullanılarak Görüntüleme aynı anda yüksek çözünürlüklü benzersiz işaretli hücrelerin değerlendirilmesi ve dokuların yapısal unsurları ile birleşik olarak da döl sağlar. Hacimsel spektral kodlu HSPC türetilmiş hücreler invasiv olmayan bir kemik iliği dahil olmak üzere çeşitli dokulara, tespit edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır (büyük alanlar üzerinde analiz BM), Transplantasyon aşağıdaki kapsamlı bir süre için. 4D video hızı multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek Canlı çalışmalar nicel bir şekilde dinamik hücresel ve klonal izleme olasılığını göstermektedir.
Giriş
Kan hücreleri olarak adlandırılan hematopoiezin üretimi, hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) küçük bir nüfus tarafından muhafaza edilmektedir. Bu hücreler tüm kendini yenileme ve farklılaşma 1,2 kontrolünde rol, osteoblastlar, stromal hücreler, yağ dokusu ve vasküler yapılardan oluşan bir kompleks microenvironmental niş içinde kemik iliği (BM) içinde bulunur. Sağlam BM doğrudan gözlemlere geleneksel erişilemez olmuştur gibi, HSPC ve mikroçevresinin arasındaki etkileşimler in vivo ölçüde uncharacterized kalır. Daha önce, konfokal floresan ve yansıma mikroskobu 3 kullanılarak sağlam BM'nin 3D mimarisi görselleştirmek içi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm fareler ev sahipliği ve Bakım ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Kullanım Kılavuzu uyarınca ele, ve bir UKAKE Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onaylı protokol alındı. Erkek B6.SJL-Ptprc (d) Pep3, (b) / 6-12 haftalık BoyJ (B6.SJL) ve C57BL / 6 fareler, sırasıyla, verici ve alıcı olarak kullanılmıştır.
Malzemeler, reaktifler ve ekipmanın bir listesi Tablo 1'de verilmektedir.
Fare HSPCs 1. Lego İletimi ve Kemik İliği Nakli
Sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) kabin (doku kültürü kaputu) aşağıda açıklanan prosedürleri uygulayın.
- L....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tüm montaj 3D konfokal sternum kemik iliği zaman tabii / 2-foton mikroskopi rekonstrüksiyon olağanüstü özelliklere sahip bir desen uyumunu ve nakledilen ko-5fps'dir genişlemesini ortaya: klon açıkça belirlenen, homojen başlangıçta geniş renk paleti ve ilerleme ile işaretlenmiş çıktı zamanla tercihen çoğunlukla tek renk hücreleri içeren. Konfokal mikroskopi kurulum ve sternal kemik iliği görüntüleme 5fps'dir-işaretli HSPC temsili örnekleri, Şekil 2 ve Film 1 ve 2'de
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz canlı dokularda hacimsel ve dinamik görüntüleme elde etmek için tandem confocal ve 2-foton mikroskopi ile 5FP kodlayan LEGO vektörler ve görüntüleme ile işaretleme kombinasyonal tarafından oluşturulan büyük çeşitliliğini birleştirerek, burada son zamanlarda klonal hücre izleme için tasarlanmış güçlü bir metodoloji ayrıntılarını anlatacağız. Bu 5 "farklı" 8-bit kanallarda confocal spektral kimliğini kaydederek işaretleme FP-tabanlı renk kullanımı genişletilmiş. Böylece her bir hücre içinde Cerulean, EGFP Ve.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer, Kan Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Boris Fehse'ye (Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi, Hamburg, Almanya) beş LeGO vektör plazmidini sağladığı için teşekkür ederiz; Christian A. Combs ve Neal S. Young (NHLBI, NIH) bu çalışma boyunca tartışmalar, destek ve teşvik için ve Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) kuyruk damarı enjeksiyonları konusunda yardım için.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Virüs Üretimi | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Mavisi |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Venüs |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | ifadesi tdTomato |
| LeGO-C2 | ifadesiAddgene | 27339 | mCherry |
| Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon Kiti | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Doku kültürü kabı | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Yaşam Teknolojisi | 12440-053 | |
| Fetal Sığır Serumu Isı İnaktive Sigma | F4135-500ML | ||
| Kalem Strep Glutamin Gibco | , Yaşam Teknoloji | 10378-016 | |
| Santrifüj Tüpleri | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Şırınga Tahrikli Filtre Ünitesi (0.22 & m) | Millipore | SLGS033SS | |
| Fare Hücresi Toplama, Saflaştırma, Transdüksiyon ve Transplantasyon | |||
| ACK parçalama tamponu | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Soy Hücresi Tükenme Kiti (fare) | Miltenyi Biotec Inc. ABD | 130-090-858 | |
| LS sütunları + tüpler | Miltenyi Biotec Inc. ABD | 130-041-306 | |
| Ön Ayırma Filtreleri (30 ve mikro; m) | Miltenyi Biotec Inc. USA | , 130-041-407 | |
| hematopoetik hücrelerin kültürü ve genişletilmesi için StemSpan SFEM serumsuz ortam (500 ml), | StemCell Technologies Inc ve nbsp; | 9650 | |
| Murin IL-11 CF | Ar-Ge D Sistemleri A.Ş | 418-ML-025 / CF | 100 & mikro; g/ml, |
| Fitzgerald Industries Intl 'nin | Rekombinant murin SCF | RDI-2503 | 100 ve mikro; g/ml 2.000x |
| Rekombinant murin IL-3 | R & D Sistemleri A.Ş | 403-ML-050 | 20 & g / ml 2.000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc., ABD | 130-096-480 | 100 &; g/ml 1.000x |
| 12 oyuklu plakadır, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | 50 & mikro'da yeniden askıya alın; g/ml |
| Protamin Sülfat | Sigma | P-4020 | 4 ve mikro; g/ml 1.000x |
| Konfokal ve İki Foton Mikroskobu | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Cam alt kültür kabı P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Cam alt kültür kabı P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı #1 Borosilikat kapak camı; 4 kuyulu | Thermo Scientific | 155383 | |
| Lamelleri 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS beş kanallı konfokal ve çoklu foton mikroskobu | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph lazer menzili 680-1,080 nm | Tutarlı | ||
| Chameleon Compact OPO lazer menzili 1,030-1,350 nm | Tutarlı | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA su daldırma objektifi (WD = 2,5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA kuru objektif (WD=0,6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA suya daldırma objektifi (WD=0,6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris yazılım versiyonu 7.6 | Bit düzlemi |
Kaynaklar
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
