Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

12.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51669

⸱

6 Ağustos 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Özet

Biz geliştirdik ve fare kemik iliği nakli deneysel model kullanılarak in vivo hematopozun incelemek için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hematopoetik kök hücrelerin (HSPCs) klonal takibi için metodoloji işaretleme floresan valide. Floresan proteinleri (FP) kodlayan Lentiviral vektörleri kullanılarak işaretleme Genetik kombinatoryel ileri mikroskopi görüntüleme yoluyla hücre kaderi haritalama etkin. Beş farklı FPS kodlayan vektörler: Shibuya, EGFP Venüs tdTomato ve MCherry renk işaretlenmiş hücrelerin çeşitli bir palet oluşturma, aynı zamanda HSPCs transdüksiyonu için kullanılmıştır. Konfokal / iki foton hibrid mikroskopi kullanılarak Görüntüleme aynı anda yüksek çözünürlüklü benzersiz işaretli hücrelerin değerlendirilmesi ve dokuların yapısal unsurları ile birleşik olarak da döl sağlar. Hacimsel spektral kodlu HSPC türetilmiş hücreler invasiv olmayan bir kemik iliği dahil olmak üzere çeşitli dokulara, tespit edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır (büyük alanlar üzerinde analiz BM), Transplantasyon aşağıdaki kapsamlı bir süre için. 4D video hızı multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek Canlı çalışmalar nicel bir şekilde dinamik hücresel ve klonal izleme olasılığını göstermektedir.

Giriş

Kan hücreleri olarak adlandırılan hematopoiezin üretimi, hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) küçük bir nüfus tarafından muhafaza edilmektedir. Bu hücreler tüm kendini yenileme ve farklılaşma 1,2 kontrolünde rol, osteoblastlar, stromal hücreler, yağ dokusu ve vasküler yapılardan oluşan bir kompleks microenvironmental niş içinde kemik iliği (BM) içinde bulunur. Sağlam BM doğrudan gözlemlere geleneksel erişilemez olmuştur gibi, HSPC ve mikroçevresinin arasındaki etkileşimler in vivo ölçüde uncharacterized kalır. Daha önce, konfokal floresan ve yansıma mikroskobu 3 kullanılarak sağlam BM'nin 3D mimarisi görselleştirmek için bir metodoloji kurdu. Biz BM EGFP-işaretli HSPCs genişlemesi, özelliği, ancak yalnızca tek bir FP kullanımı klonal düzeyde rejenerasyonu tespiti engellemiştir. Çok yakın zamanda biz kurucu fl ifade Lentiviral Gen Ontoloji (Lego) yararlandı vektörleri aldıuorescent proteinler (FP) hücreleri verimli 4,5 işaretlemek için. 3 ya da 5 vektörlerle HSPC Co-transdüksiyon çoklu bireysel klonların HSPC izleme sağlayan, birleşik bir renk paleti çeşitli oluşturur.

İşaretli HSPC ışınlanmış farelerde BM bireysel HSPC homing ve bütünleşmesini izlemek için izin yeni görüntüleme teknolojisi ile birlikte. Lego vektörler kemik ve diğer açıkça görüntülenmesini sağlayan, (Cerulean, eGFP, Venüs, tdTomato ve mCherry itibaren) 3 veya 5 farklı aile hekimleri ile HSPC işaretlemek ve konfokal ve 2-foton mikroskopi BM zamanla kendi naklini takip etmek kullanıldı matris yapıları ve bunların mikro bileşenlerine HSPC klonların ilişkisi. HSPC lego vektörleri ile transduse edilmiş C57BL / 6 fareleri BM den soy negatif hücreleri gibi arıtıldı ve miyelo ablasyon konjenik farelerine kuyruk damarından enjeksiyon ile yeniden infüze edildi. Sternum BM doku büyük hacimli izleyerek biz erken meydana endesiteal bütünleşmesini görüntülendiBM rejenerasyon. Farklı renkli spektrumları ile hücre kümeleri kemiğe yakın ilk olarak ortaya çıktı ve zaman içinde merkezi olarak ilerledi. İlginç bir şekilde, en fazla 3 hafta sonra kemik iliği, kan akışı yoluyla oldukça yaygın HSPCs yayılması daha yakın olarak kemik iliğinde türetilen bireysel HSPCs hematopoez yayılmasını gösteren makroskopik klonal kümeleri oluşturmuştur. Daha az renk çeşitliliği çok vektörler ile hücrelerin repopulating uzun vadeli transduse güçlük göstermektedir de, geç zaman noktalarında oldu.

Buna ek olarak, HSPCs, dalakta farelerde hematopoez de sorumlu bir organ kümeleri oluşturmuştur. HPSC türetilmiş ayrı ayrı hücreler yanı sıra, timus, lenf düğümleri, dalak, karaciğer, akciğer, kalp, cilt, iskelet kas, yağ dokusu ve böbrek çözülebilirdi. 3D görüntüler dokuların en az değişimleri ile hücrelerinin dağılımını takdir nicel ve nitel olarak değerlendirilebilir. Son olarak, tasvirrezonans tarama multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek 4D canlı dinamik çalışmaların d fizibilite. Bu metodoloji doku rejenerasyonu ve patoloji çalışmada güçlü bir araç sağlayarak, onların bozulmamış 3D mimarisi Işıksal işaretlenmiş hücreler nüfus non-invaziv, yüksek çözünürlüklü, çok boyutlu hücre kaderini izlemeyi sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm fareler ev sahipliği ve Bakım ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Kullanım Kılavuzu uyarınca ele, ve bir UKAKE Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onaylı protokol alındı. Erkek B6.SJL-Ptprc (d) Pep3, (b) / 6-12 haftalık BoyJ (B6.SJL) ve C57BL / 6 fareler, sırasıyla, verici ve alıcı olarak kullanılmıştır.

Malzemeler, reaktifler ve ekipmanın bir listesi Tablo 1'de verilmektedir.

Fare HSPCs 1. Lego İletimi ve Kemik İliği Nakli

Sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) kabin (doku kültürü kaputu) aşağıda açıklanan prosedürleri uygulayın.

  1. Lego Vektörler Kodlama 5fps'dir Üretimi
    1. Lentiviral "Gen Ontoloji" (Lego) vektör plasmitler kullanın Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venüs), Lego-T2 dahil güçlü bir kurucu SFFV destekçisi, farklı bir FP kodlayan her (tdTomato), ve nazik Dr Boris Fehse (Üniversite Tıp Merkezi Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Almanya) tarafından sağlanan Lego-C2 (mCherry); Addgene 5-7 de edinilebilir şimdi.
    2. Lego vektörler, tohum 10 cm tabaklarda (her bir vektör için 12 tabaklar kullanın) 24 saat önce I10, ortam (% 10 FCS ve glutamin / penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş IMDM) içinde 8 ml transfeksiyondan 5 x 10 6 293T hücreleri üretmek.
    3. Biraz değiştirilmiş CAPHOS kiti kullanılarak öneriler Kalsiyum Fosfat ile hücrelerin transfekte:
      1. Her plaka karışımı 15 ug Lego vektörü, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Önceki-TAT ve 50 varlığında ul 2.5 M CaCl2 1 ug pMD2.G-VSV-G plazmidler, ve su ekleyin 500 ul toplam hacim verir.
      2. 2x HeBS (HEPES-Tamponlu Tuzu): 500 ul ile Çökelti, DNA plazmidler ve önce 293T hücreleri, her plaka ilave edilmeden oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
      3. Için inkübe hücreleri37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde 6 saat; medyayı çıkartın ve taze kültür ortamı 6 saat sonrası transfeksiyonunu ekleyin.
    4. 3 gün boyunca, her gün, her plaka, lentiviral partikülleri ihtiva eden kültür süpernatantlar toplayın. Her gün şu süpernatant koleksiyon her plaka taze I10 medya ekleyebilirsiniz.
      1. 0.22 um gözenekler, havuz üzerinden filtre edin ve 71.900 x g ve 4 ° C'de 2 saat boyunca bir SVV28 rotor üzerinde ultra-santrifüj ile süpernatantlar konsantre edilir.
      2. StemSpan 1 ml'lik ortam içerisinde yeniden süspanse edilen süpernatanlan. -80 ° C'de 200 ul ve mağaza lentiviral stokları kısım.
  2. Lentiviral Parçacıkların titrasyonu
    NIH3T3 hücreleri kullanılarak birim / ml transduse kantitasyonu yoluyla toplanan yüzer maddelerin Lego vektörü taneciklerinin titresini belirlemek. Titreler deneysel hedef için enfeksiyon (MOI) istenen rölatif çokluk sebep için gerekli olan her vektör süpernatantın hacminin hesaplanabilmesi içinhücreler.
    1. Levha bir gün önce titrasyon I10, ortam, 2 ml oyuk (12 çukurlu plaka) başına 5 x 10 4 NIH3T3 hücreleri.
    2. (4 mg / ml olan 1,000x) protamin sülfat ile takviye edilmiş ortam içinde I10, vektör yüzer 5-kat seri dilüsyonları hazırlayın.
    3. Hücrelerden Ortamı çıkarın ve konsantre virüs 2, 0.8, 0.32 ve 0.128 ul eşdeğer yüzer seyreltilmiş 500 ul ile değiştirin.
    4. Iyi bir denetim sayma transdüksiyon zamanda oyuk başına mevcut olan hücre sayısını (Resim) belirler.
    5. 6 saat sonra, transdüksiyon, I10, ortam, 2 ml ilave edilir ve 37 ° C'de,% 5 CO2 ile 3 gün inkübe edilir.
    6. Her bir göze tripsin-EDTA kullanarak hücreleri hasat ve akış sitometresi aracılığı ile flüoresan hücrelerin yüzdesi (% FP) belirler.
    7. Resim Titre (vektörü tanecikleri / mL) =: 1 ile% 50 arasında bir% FP ile sonuçlanan her çukura (seyreltme) için elde edilen ortalama titreleri, aşağıdaki gibi titreyi hesaplamakvektör sıvı (ml) x% FP / Cilt. FP% 1 ile% 50 arasında ise, her bir seyreltme için elde edilen ortalama titreleri.
  3. Fare Hücre Toplama, Arıtma, Transdüksiyon ve Transplantasyon (şematik Şekil 1A gösterilmiştir Malide ark. 4 uyarlanmıştır).
    1. Onaylı bir prosedürle verici fareler kurban. Anterior ve posterior bacaklarda Hasat kemik iliği: iyice eklem mümkün olduğunca yakın, her kemiğin sonuna kesen kemiklerden tüm kas, ligament ve aşırı doku kaldırmak ve dışarı kemik iliği yıkayın, humerus, femur ve tibia teşrih I10, ortam ihtiva eden bir şırınga ile bir 27-0 G iğne kullanılarak kemik.
    2. 500 xg, 4 ° C'de 10 dakika boyunca, komple kemik iliği hücrelerini pellet haline getirmek ve 50 ml tampon ile iki kez ACK kırmızı hücreler lize edildi. 10 ml I10 medyada süspanse hücreler.
    3. Değiştirilmiş bir kiti Protoco göre MACS soy tükenme kiti soy negatif (Lin-) progenitör hücrelerinin saflaştırılmasıl:
      1. Anti-Biyotin mikro, 30 ul yerine 10 ul / 10 7 hücreleri kullanır; I2 ortamı (% 2 FCS ile takviye edilmiş IMDM) yerine tampon ile yıkama adımları.
      2. Biyotin-antikor kokteyli ile inkübasyon ve Anti-biotin mikro, ile inkübasyon arasındaki bir yıkama aşamasını kaydedin; ve I10 yerine, tampon ile kolon dengeye getirin.
    4. 10 ng / ml fare IL-3, 100 ng / ml fare IL-11, 100 ng / ml insan Flt-3 ile takviye edilmiş ortam içinde StemSpan 5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir başlangıç ​​yoğunluğunda 48 saat süre ile kültür edilen Lin-hücrelerin ligandı, veya 50 ng / ml fare kök hücre faktörü.
    5. StemSpan mevcudiyetinde 4 x 10 5 hücre 12 oyuklu plakaları, her AP% 50 verim elde etmek için ekspresyon RetroNectin ile kaplanmış ve bir enfeksiyon çokluğu 6-7 (MOI) Lego'nın süpernatanları her transdüse, transfer 1 Ortam ve sitokinler yukarıda ayrıntıları ve 4 ug / ml protamin sülfat.
    6. Hücreleri nakletmekHer Lego vektör ayrı olarak adım 1.3.5 tarif ve iletimi aşağıdaki hücrelerin karışımı ile (Mix adlandırılır) veya aynı anda tüm 5 Lego vektör supernatantlarla hücreleri ko-transduce (Co olarak adlandırılır). , 24 saat sonra hücreleri çıkarmak sitokinler olmaksızın StemSpan medya ile bir kez yıkayın ve nakli için sitokinler olmaksızın StemSpan medyada onları tekrar süspansiyon veya konfokal mikroskopi önce ek 96 saat taze sitokinler ile medya ve kültür aktarmak ve akım sitometri.
      1. 1 'e tekabül fare başına hücre dozda, 100 ul bir hacim içinde, 11 Gy tek doz öncesi ışınlanmış alıcıya (6-18 saat, transplanttan önce) alıcıları olarak kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla Lin HSPCs transduse infüzyonu ile kemik iliği nakli gerçekleştirmek -4 x 10 5 Lin-hücreleri tarafından salgılanan bir iletimi için kaplama. Her deneyde, verici BM hücrelerinin transduse aynı nüfusu ile bütün bir hayvan kohort nakli.
      2. Transdüksiyona H in vitro karakterizasyonu içinSPC, kültür StemSpan ek bir 4-5 gün hücreler, sitokinler ile takviye edilmiş ve transdüksiyon verimliliği için akış sitometrisi ile analiz edilir, ve renk çeşitliliği için mikroskopla.
        1. Bireysel fareler kurban ve çeşitli zaman transplantasyon sonrası 120 güne kadar çiziyor, görüntüleme için doku ve organları almak.
          1. Etanol ile fare kürk sprey ve saç yayılmasını önlemek ventral tarafta cilt insizyon.
          2. Standart prosedürler dalak popliteal lenf düğümleri, akciğer, kalp, deri, yağ dokusu, iskelet kası, böbrek, karaciğer, hem de calvaria erişmek için kafasına göre inceleyin ve tüketim.
          3. Seçenek olarak ise, calvaria kullanımı veya canlı hayvanda deri ve lenf düğümleri gibi zaman 2,8,9 yüzeysel organ veya görüntü üzerinde tekrar tekrar canlı görüntüleme için, kemik kurma penceresi.
        2. 50-100 35 mm numarası 0 cam kapak kültür yemekleri tek tek organlara yerleştirin56, adım 2.5 de tarif edildiği gibi, kesit tespit ya da daha fazla bir işleme tabi tutulmadan, onları etkilemeden onlara görüntülenmesi için PBS.
        3. Volumetrik görüntüleme için, soğuk PBS kullanıma kadar organları tutun. Zaman atlamalı görüntüleme için, 20 mM HEPES ihtiva eden ve% 10 FBS, 37 ° C de DMEM organ görüntüleme hemen devam

2. Eşodaklı ve İki foton Mikroskopi ve Görüntü Analizi

  1. Multi-line Argon, diyot 561 nm, HeNe 594 nm ve HeNe 633 nm görülebilir lazer ile donatılmış bir Leica SP5 beş kanal konfokal ve multiphoton sistemi kullanılarak mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin. 680 dağılım düzeltme ile 1.080 nm uyarma için Sapphire (Ti-Sa) lazer, ayarlanabilir: 2-foton modunda, bir darbeli femtosaniye Ti kullanın. T ile arka arkaya ya da aynı anda, 1,030-1,300 nm kadarıyla çıkış dalga boyu aralığını genişletmek için kırmızı-kaydırılmış fps (tdTomato ve mCherry), bir optik parametrik osilatör (OPO) lazer içeren deneylerinde kullanılmakTi-Sa lazer diye.
  2. -IRAPO-L Hcx 25X / 0.95 NA su daldırma hedefi (WD = 2,5 mm), bir HC-PLAPO-CS 20X / 0.70 NA kuru objektif (WD = 0.6 mm), ya da HC-PL-IRAPO 40X bir kullanarak görüntü değişik dokular /1.1 NA su daldırma objektif (WD = 0.6 mm).
  3. Kontrolün yanı sıra tek bir AP Lego vektörüyle transdüksiyona BM hücrelerinden görünür spektrum 5 nm bant genişliklerinde yayılan ışığın lambda yığınları (xyλ) toplama konfokal floresan spektrumu elde edilir, BM nakledilmiş değildir.
    1. Leica LAS-AF v2.4.1 yazılımı ile işlem görüntüler tüm 5 hekimi referans spektrumları yanı otofloresanm olarak (Şekil 2A) oluşturmak için. Bireysel AP spektrumları ve floresans parlaklık farkı kullanılarak aşağıdaki gibi 5 ardışık görüntü kanalları da Cerulean (% 79), Venüs (156%), tdTomato (283%) ve mCherry (% 47) (EGFP% 'si olarak ifade edilmiştir): Shibuya (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venüs (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm) ve MCherry (594 / 618-670 nm) ( Şekil 2B).
    2. Her bir FP ile transdükte edilmiş hücrelerin geri kalanı (Şekil 2C) için sadece karşılık gelen kanal görünür ve mevcut olmadığı gibi, doğru FP ayırma doğrulama. Buna ek olarak, bu çok-kanallı tanımlandığı yaklaşım sonraki renk analizi ve klonal takip edilmesine olanak sağlar ve spektral görüntüleme yöntemlerine göre toplama zamanı azaltma avantajına sahip olan bir tek-5 kanal "COLORPRINT" oluşturur.
  4. , 2-foton modunda, dört kanalları olmayan descanned dedektörü (NDD) olarak topladığımız özel çift renkli aynalar yüksek verimlilik ve ayrı ayrı floresan emisyon aşağıda: 465 nm renkli aynaya ardından 568 nm'de bir dikroik ayna, ardından Sonohisterografi veya otofloresansı ve Cerulean, tdTomato veya mCherry için EGFP veya Venüs için 525/40 nm emisyon filtresi ve 648 nm dikroik ayna ve 620/60 nm emisyon filtresi için 452/45 nm emisyon filtresi.
    1. İki foton mikroskopi i yapısal bilgiler ortayantrinsic kontrast (780 nm'de uyarılmış) elastin, NADH, doku otofloresanm (yukarıda anlatıldığı gibi) görüntüleme ve ikinci harmonik arka dağılmış toplanan 920 nm ya da 860 nm (uyarılmış kemik ve fibriler kolajen sinyali (SHG) üretilir yönü) 10,11.
  5. 3D volume rendering için, kemik iliği ve diğer dokulara boyunca derinliklerinde bir dizi (150-300 mikron) göre 5 mikron aralıklarla z ekseni boyunca xyz görüntülerin dizi (tipik olarak 1 x 1 x 4 mikron 3 Voksel boyutu) toplamak, yazılımın kiremit işlevini kullanarak büyük bölgeler otomatik olarak tüm bir sternum fossa, yaklaşık 2.5 x 1.2 mm 2 (xy) ve 300 mikron (z) (Şekil 2D-2E) ve Sinema 1 oluşan dikişli birimleri üretmek üzerine.
    1. Görüntü 2, 8, kesit olmadan kafatası yoluyla doğrudan ilik kalvarial.
    2. Sonra sagital düzlemde (İkiye bölme) ve birlikte Bölüm sternumçapraz kesim yüz 3,4,12 2 ile sternum fosse ve görüntü arasındaki birleşme yerinde (Takaku uyarlanmıştır Şekil 1B ve diğerleri genel 3).
  6. 4D zaman atlamalı görüntüleme için 50-100 ul, 35 mm numarası 0 coverglass kültür tabakları üzerine, taze kesilmiş kesilmemiş popliteal lenf düğümleri, dalak, akciğer, veya kalvaryal kemik örnekleri yer 37 ° C 'de 20 mM HEPES içeren DMEM,% 10 FBS ve ~ (z-yığınları alarak konfokal uyarma (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) ve Leica rezonans tarayıcı (8000 Hz / sn) ile birlikte 2-foton Ti-Sa uyarma (860 nm) kullanın kadar 1 saat boyunca 20 saniye aralıklarla 80 um).
    1. Eşzamanlı üç renkli 2P görüntüleme kullanımı Ti-Sa için 860 at ayarlanmış nm anda OPO (tdTomato için 1,130 nm ayarlı veya 1.140 nm mCherry) lazer ile (Film 2).
  7. 3D Hacmi ve 4D zaman dizilerinin İmar ve Analizi
    1. Imaris x64 yazılım bil kullanınDaha önce 3,4 açıklandığı gibi, sürüm 7.6, veya hacim-render (3D) içine ham görüntüleri kiremitli-yığınları dönüştürmek için alternatif yazılım paketleri, kemik iliği ve farklı doku ve 3D-rotasyon filmleri olarak dışa içten floresan hücrelerin veriler (Film 1) adım adım örnek:
      1. Imaris yılında, z-yığın görüntü açın; Seçin 3D ses görselleştirme görüntülemek için "Aşmak".
      2. 360 ° etrafında sesini açmak için "gidin" kullanın.
      3. Bir animasyon oluşturmak için "Animasyon" seçeneğini seçin; Seçilen manzarası, zoom, hacim rotasyonlar eklemek için anahtar kare kullanın; , Film önizleme gerektiği gibi düzenleyin ve istediğiniz bir film formatta dosyayı kaydetmek (örn: avi, mov).
    2. 3D cep ve klon frekansı, Kutup, boyutları ve dağıtım kantitatif değerlendirilmesi, ileri bir işlem için mesafe ölç performans MATLAB uygulamaları entegre Imaris XT modüllerini kullanarak z yığınları(Mesafe, bir transformasyon algoritmasını kullanarak) ölçümler ve kümeler analizi, daha önce tarif edilen 3,4. Imaris x64 yazılımı ile hacim render dört boyutlu (4D) filmlerin içine zamanla görüntü yığınlarının dizileri Transform ve otoregresif hareket algoritmaları kullanarak üç boyutlu hücre motilitesi yarıotomatize takibi için yer ve yüzey analiz kullanmak.
    3. Aşağıdaki gibi hücrelerin çokbantlı analizini gerçekleştirmek: çok renkli yeni bir kanal içine Imaris XT kanal aritmetik aracılığıyla tüm 5 kanal ekleyerek etiketli noktalar ayıklamak; Bütün noktalar (hücreler) 5 bileşen kanalların her biri ortalama yoğunluğu floresan belirler. Tek bir hücrenin her FP (Şekil 2E grafik) nispi% yani eşsiz "COLORPRINT" gösteren grafikler çizmek Excel yazılımı değerleri ihracat. Doku sürüklenme için belirlenen verileri düzeltmek ve hücre hız ve deplasman zamanla, parça uzunlukları, yolları ve mesafeleri hesaplamak; Excel sof ihracat değerlerigrafikler çizmek için tware. Adobe Photoshop CSS 5 yazılımı ile kompozit rakamları birleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tüm montaj 3D konfokal sternum kemik iliği zaman tabii / 2-foton mikroskopi rekonstrüksiyon olağanüstü özelliklere sahip bir desen uyumunu ve nakledilen ko-5fps'dir genişlemesini ortaya: klon açıkça belirlenen, homojen başlangıçta geniş renk paleti ve ilerleme ile işaretlenmiş çıktı zamanla tercihen çoğunlukla tek renk hücreleri içeren. Konfokal mikroskopi kurulum ve sternal kemik iliği görüntüleme 5fps'dir-işaretli HSPC temsili örnekleri, Şekil 2 ve Film 1 ve 2'de

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz canlı dokularda hacimsel ve dinamik görüntüleme elde etmek için tandem confocal ve 2-foton mikroskopi ile 5FP kodlayan LEGO vektörler ve görüntüleme ile işaretleme kombinasyonal tarafından oluşturulan büyük çeşitliliğini birleştirerek, burada son zamanlarda klonal hücre izleme için tasarlanmış güçlü bir metodoloji ayrıntılarını anlatacağız. Bu 5 "farklı" 8-bit kanallarda confocal spektral kimliğini kaydederek işaretleme FP-tabanlı renk kullanımı genişletilmiş. Böylece her bir hücre içinde Cerulean, EGFP Ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer, Kan Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Boris Fehse'ye (Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi, Hamburg, Almanya) beş LeGO vektör plazmidini sağladığı için teşekkür ederiz; Christian A. Combs ve Neal S. Young (NHLBI, NIH) bu çalışma boyunca tartışmalar, destek ve teşvik için ve Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) kuyruk damarı enjeksiyonları konusunda yardım için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Virüs Üretimi
LeGO-Cer2Addgene27338Mavisi
LeGO-G2Addgene25917eGFP
LeGO-V2Addgene27340Venüs
LeGO-T2Addgene27342ifadesi tdTomato
LeGO-C2ifadesiAddgene27339mCherry
Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon KitiSigmaCAPHOS-1KT
Doku kültürü kabıBD Falcon353003
IMDMGibco, Yaşam Teknolojisi12440-053
Fetal Sığır Serumu Isı İnaktive SigmaF4135-500ML
Kalem Strep Glutamin Gibco, Yaşam Teknoloji10378-016
Santrifüj TüpleriBeckman Coulter326823
SW28 UltrasantrifüjBeckman CoulterL60
Millex Şırınga Tahrikli Filtre Ünitesi (0.22 & m)MilliporeSLGS033SS
Fare Hücresi Toplama, Saflaştırma, Transdüksiyon ve Transplantasyon
ACK parçalama tamponuQuality Biologicals Inc.118-156-101
Soy Hücresi Tükenme Kiti (fare)Miltenyi Biotec Inc. ABD130-090-858
LS sütunları + tüplerMiltenyi Biotec Inc. ABD130-041-306
Ön Ayırma Filtreleri (30 ve mikro; m)Miltenyi Biotec Inc. USA, 130-041-407
hematopoetik hücrelerin kültürü ve genişletilmesi için StemSpan SFEM serumsuz ortam (500 ml),StemCell Technologies Inc ve nbsp;9650
Murin IL-11 CFAr-Ge D Sistemleri A.Ş418-ML-025 / CF100 & mikro; g/ml,
Fitzgerald Industries Intl 'ninRekombinant murin SCFRDI-2503100 ve mikro; g/ml 2.000x
Rekombinant murin IL-3R & D Sistemleri A.Ş403-ML-05020 & g / ml 2.000x
FLT-3 LigandMiltenyi Biotec Inc., ABD130-096-480100 &; g/ml 1.000x
12 oyuklu plakadır, CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A/B50 & mikro'da yeniden askıya alın; g/ml
Protamin SülfatSigmaP-40204 ve mikro; g/ml 1.000x
Konfokal ve İki Foton Mikroskobu
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
Cam alt kültür kabı P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
Cam alt kültür kabı P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı #1 Borosilikat kapak camı; 4 kuyuluThermo Scientific155383
Lamelleri 22 mm No 2Thomas Scientific6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS beş kanallı konfokal ve çoklu foton mikroskobuLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph lazer menzili 680-1,080 nmTutarlı
Chameleon Compact OPO lazer menzili 1,030-1,350 nmTutarlı
HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA su daldırma objektifi (WD = 2,5 mm)Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA kuru objektif (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA suya daldırma objektifi (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
Imaris yazılım versiyonu 7.6Bit düzlemi
Gök , . 1.000x RDI Bölümüdür;. ,

Kaynaklar

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
  7. Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
  8. Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
  9. Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
  10. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
  11. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  12. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

Etiketler

Hematopoetik K k Progenit r H crelerFloresan Protein aretlemeKonfokal Mikroskopiki Foton MikroskopisiKemik li i NakliLentiviral Vekt r Transd ksiyonuKlonal zleme Analiziok Renkli G r nt leme4D Zaman Atlamal G r nt lemeSpektral Ayr t rma
Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.