Yöntem makalesi

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

23.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51719

⸱

17 Ağustos 2014

 ,  ,  ,  , 
1Broad Institute

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Genetik raportör testi, DNA dizileri ve gen düzenleyici aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemek için iyi kurulmuş ve güçlü bir araçtır. Aday düzenleyici elemanların, tanımlayıcı dizi etiketlerini taşıyan raportör genlere bağlanması, bu tahlillerin büyük ölçüde paralelleştirilmesini sağlar.

Özet

Genetik raportör testi, DNA dizileri ve gen düzenleyici aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemek için iyi kurulmuş ve güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, bu tahlilin potansiyel verimi, düzenleyici aktivite için bir vekil olarak protein floresan veya enzimatik aktivite kullanılarak ilgilenilen her bir dizinin aktivitesini ayrı ayrı klonlama ve test etme ihtiyacı ile sınırlandırılmıştır. Yüksek verimli DNA sentezi ve dizileme teknolojilerindeki ilerlemeler, son zamanlarda büyük muhabir yapı kütüphanelerinin inşasını ve sorgulanmasını çoğullayarak bu sınırlamaların üstesinden gelmeyi mümkün kılmıştır. Bu protokol, tek bir hücre kültürü kabında yüz binlerce varsayılan düzenleyici dizinin doğrudan karşılaştırılmasına izin veren bir Kütle Paralel Raportör Testinin (MPRA) uygulanmasını açıklar.

Giriş

Büyük ölçekte paralel Raportör Tahliller (MPRA) DNA dizilerinin 1- 7 yüz binlerce binlerce transkripsiyonel düzenleyici faaliyetlerinin birden fazla mesaj göndermiş ölçümüne izin verir. En genel bir uygulamasında, çoklayıcı bir açık okuma çerçevesinin alt tanıtıcı bir dizi etiketi içeren bir sentetik raportör gene, ilgilenilen her sekansı birleştirilmesi ile elde edilir (ORF, Şekil 1). Transfeksiyon, RNA izolasyonu ve raportör gen transkriptlerinin 3 'uçları arasında derin dizilemesi sonra, birleştirilen dizilerin relatif aktiviteleri, bunların belirlenmesi etiketlerin görece bolluğu sonucu çıkarılabilir.

figure-introduction-1
MPRA Şekil 1. Genel Bakış. MPRA raportör bir kütüphane sentetik varsayımsal düzenleme sekansları şekilde birleştirilmesi yoluyla yapılandırılır konstruktlarıtanımlayıcı bir dizi etiketi ve ardından (örneğin, lusiferaz, GFP ve gibi) bir "etkisiz" ORF oluşmaktadır raportör genler. Kütüphane kültürlenmiş hücrelerin bir popülasyonunun içine transfekte edilir topluca ve kopyalandığı raportör mRNA, daha sonra elde edilir. Derin sıralama muhabiri mRNAların ve nakledilen plazmidlerden arasında her etiket yineleme sayısını saymak için kullanılır. Plazmid sayısı ilgili düzenleyici dizi aktivitesini belirlemek için de kullanılabilir fazla mRNA oranı sayar. Melnikov izni ile uyarlanmıştır, ve ark 2.

MPRA ilgi konusu bir lokus üzerinde yeni bir düzenleyici elemanlar için tek tek gen düzenleme elemanlarının 1) geniş mutajenezi, 2) tarama dahil olmak üzere deney tasarımları çeşitli adapte edilebilir, 3) farazi bir dizi doğal genetik farklılaşmasının etkisinin test edilmesi uyarıcının veya susturucular ve sentetik düzenleyici elemanlar 4) yarı-rasyonel mühendislik. Lidizi varyantlarının braries dejenere oligonükleotidler 1,4, birleştirici ligasyon 8 ve genomik DNA 5 parçalanma oligonükleotid mikrodiziler kütüphane programlanabilir 2,3,6,7 üzerinde sentezi (en küçük kareler), montaj dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir.

Bu protokol, promotör bir kütüphanesinin yapımını da tarif eder varyantlarının en küçük kareler ve pMPRA1 ve pMPRAdonor1 vektörleri (sırasıyla Addgene kimlikleri 49349 ve 49352; http://www.addgene.org) kullanılarak kültürlenmiş memeli hücrelerine ve daha sonra kantitatif olarak bu kütüphanenin geçici transfeksiyon ilişkili etiketleri derin sıralama (Etiket-Dizi) tarafından promotör faaliyetleri. Bu protokolün önceki sürümleri (2013) Araştırma 23, 800-811 Melnikov ve ark. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) ve Kheradpour ve ark. Genome bildirilen araştırmada kullanılmıştır.

Protokol

1. Dizi Tasarımı ve Sentezi

  1. Dizilerin tasarımı ve sentezi ile başlar MPRA düzenleyici aktivitesi için tahlil edilecek. PMPRA vektör serisi ile uyumluluk için, aşağıdaki şablonu kullanarak her sekansı tasarımı: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- etiketi -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 var denenecek diziyi temsil eder ve etiketi bir veya daha tanımlayıcı etiketleri gösterir '.
  2. Iki değişken bölgeleri (var ve etiket) aralarında bir raportör gen fragmanının ligasyonu yönsel kolaylaştırmak için Kpnl (GGTACC) ve Xbal (TCTAGA) kısıtlama sitelerinin bir çift ile ayrılır. Buna ek olarak, iki ayrı Sfil (GGCCNNNNNGGCC) siteleri pMPRA omurgasına yönlü bağlanmasını sağlamak için, PCR ile eklenir. Bu değişken bölgeler restriksiyon siteleri ek kopyalarını içermemelidir. Gerekirse, bu sınırlama enzimlerinin bir veya daha fazla ikame edilmiş olabilir, Uzun ve yedek olarak 1) yakın bir DNA moleküllerinin uçları etkili kesme sağlar, ve 2) vektör dizisi dışında kesme. Ek ayrıntılar için Tartışma bakın.
  3. Ticari bir satıcıdan Tablo 1'de listelenen gerekli primerler elde edilir.
MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

Tablo 1. Primer dizileri. [Index] çoğullanmış dizileme için kullanılan bir 6 ila 8 nt endeksi diziyi temsil eder. Farklı endeksleri ile en az 8 TagSeq-P2 primerler edinin. TümPrimerlerin HPLC veya PAGE ile arındırılmalıdır.

  1. Oligonükleotid kütüphaneler ticari bir satıcıdan veya çekirdek tesisinden elde edilen, ya da üretici tarafından tarif edildiği gibi, bir programlanabilir mikro-dizi-bazlı oligonükleotit sentezleyici kullanılarak üretilebilir. 100 ul TE 0.1 tamponunda EKK ürünleri süspanse.
  2. Denatüre edici poliakrilamid jel% 10 TBE-Üre üzerinde oligonükleotid kütüphaneleri çalıştırın. Kalite (Şekil 2A) değerlendirmek için ssDA duyarlı floresan boyası ile şeritli ve leke başına yaklaşık 1 pmol yükleyin.
  3. Tam uzunlukta oligonükleotitlerin karşılık gelen ayrı bir bant görselleştirilebilir durumunda (Şekil 2A, kulvarlar 1 ve 2), karşılık gelen akrilamid jel dilim kesip ve çalkalama ile oda sıcaklığında gece boyunca 100 ul TE 0,1 oligonükleotitlere aynlır. Aksi takdirde, en küçük kareler ham süspansiyonu kullanılarak devam edin.
  4. Yükseltmek ve PCR 9 emülsiyonu kullanılarak oligonükleotid kütüphaneye Sfil kuyrukları eklemek > sup.
  5. Tablo 2'de tarif edildiği gibi 50 ul PCR reaksiyon karışımları ayarlayın. Daha sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 ul DNA, Micellula Emülsiyon yağ ve yüzey aktif madde karışımı ile saflaştırma kiti ve vorteks ile birleştirir.
Reaktif 1x Hacmi (ul)
Herculase II Füzyon DNA Polimeraz 0.5
5x Herculase II Reaksiyon Tamponu 10
dNTP (10 mM) 1.25
BSA (20 mg / ml) 1.25
Astar MPRA_SfiI_F (25 uM) 0.25
Astar MPRA_SfiI_R (25 uM) 0.25
EKK şablonu (1-10 attomol) değişir
Nükleazlar içermeyen su 50
ve_content "> Tablo 2. Emülsiyon PCR reaksiyon karışımı (su fazı).

  1. Eser ortaya çıkmadan amplifikasyon ürünlerinin azami bir verim sağladığını konsantrasyonunu kullanarak (bölüm 1.12 bakınız).
  2. PCR tüpleri içine koyun ve elde edilen emülsiyonun 95 ° C (2 dakika, 20 PCR döngüsünden yerine, 20 cm x [95 ° C'de 20 saniye, 55 ° C, 72 ° C de 30 sn 20 sn], 95 ° C'de 3 dakika ° C).
  3. Havuz vorteks kısa bir süre 1 mi izobütanol ilave edilmesi ve her bir 350 ul emülsiyon PCR reaksiyonunu kırmak, ve daha sonra bir DNA arıtma kolonu kullanılarak amplifikasyon ürünün arıtılması ve.
  4. Artifakt amplifikasyon (Şekil 2B) kontrol etmek için bir% 2 veya% 4 agaroz jel üzerinde bir kesir çalıştırın.

figure-protocol-1
Oligonükleotit sentezi kütüphanelerinin Şekil 2. hazırlanması a.) Üç farklı ham oligonükleotid sentezi kütüphaneleri (EKK)% 10 TBE-Üre poliakrilamid jelleri üzerinde çalıştırın. Tam uzunlukta oligonükleotitlerin (*) karşılık gelen bantları görsel ve kütüphanelerden 1 den kesilmiş ve 2. Library 3 SAYFA arıtma müdahale kontaminatlar edilebilir. Bu durumda ise, bir agaroz jel üzerinde, aynı oligonükleotid kütüphane çalışmasının açık ve emülsiyon PCR amplifikasyonu PCR amplifikasyonu. Ürünler, b) doğrudan devam edin. Karmaşık oligonükleotid kütüphanelerin PCR sık kimerik ürünler ve daha yüksek ve daha düşük bantları gibi görünebilir diğer eserler oluşturur. Emülsiyon PCR, bu eserler en aza indirebilirsiniz.

2. Kütüphane İnşaatı

  1. , Bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır, 2 saat için, 50 ° C de bir Sfil ile sindirilerek vektör pMPRA1 ile doğrusallaştırılmış plazmit omurga hazırlanması (Bu durumda, 2,5-kb olarak) bant kesip omurga ve bir jel saflaştırma spin-sütunu kullanarak arıtın.
  2. Digest2 saat boyunca 50 ° C'de bir Sfil ile adım 1.4 emülsiyon PCR ürünleri ve DNA saflaştırma kolonları kullanılarak saflaştırılması.
  3. , Doğrusallaştırılmış vektör omurgasına promotör-etiketi kitaplığı birbirine bağlamak için sindirilmiş PCR ürünü, 100 ng, lineerize vektör omurgası ve T4 DNA ligazı ihtiva eden 50 ng tepkileri oluşturmuştur. 20 dakika ligazı inaktivasyonu için 65 ° C sıcaklıkta daha sonra ısı 16 ° C de bir gece inkübe ve.
  4. E. Transform Ligasyon reaksiyonu E. coli ile. Kütüphane karmaşıklığı korumak için, tasarlanan kütüphanede farklı promotör-etiketi kombinasyonları vardır en az 10x daha cfu elde etmek hedefliyoruz.
  5. Etiketler toplam sayısı yaklaşık 100,000 olduğunda, tipik haliyle, hedef CFU kütüphane başına 6-8 paralel dönüşümlerinin gerçekleştirilmesi suretiyle elde edilebilir.
  6. Her bir dönüşüm, E. elektrouyumlu 50 ul birleştirme Buz üzerinde ligasyon karışımı 2 ul E. coli hücreleri. 800 ul SOC hücreleri elektroporasyon ile transforme kurtarmakParalel dönüşümler hücreleri birleştirir sonra 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak ve orta tarafından.
  7. Transformasyon etkinliğini değerlendirmek için, 50-100 ug / ml karbenisilin LB agar plakaları üzerinde elde edilen hücreler bir alinquot kadar seri seyreltiler plaka ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. / V V v ve elde edilen hücreler toplam hacmi olan seri seyreltiler için alınan kan hacmi olan - toplam CFU olarak (gözlenen cfu), x (seyreltme faktörü) x (v V) tahmin edilmesi.
  8. Aynı zamanda, geri kalan hücrelerin 100 ug / ml karbenisilin ile desteklenmiş 200ml LB aşılamak için kullanılır. Çalkalamalı bir inkübatör içinde gece boyunca 37 ° C'de hücrelerin büyümesine ve sonra standart yöntemler kullanılarak, plazmid DNA izole eder.
  9. 2 saat boyunca 50 ° C'de bir Sfil ile izole edilen plazmid kütüphanesinin bir kısım sindirimi ve insertlerin varlığı teyit etmek için bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır.
  10. C plazma kütüphanesi linearizeKpnl ve Xbal kullanarak promotör varyantları ve etiketleri arasında esme. Sindirim verimliliğini maksimize etmek için, seri sindirimler gerçekleştirin:
  11. İlk olarak, 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ile sindirmek ve manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırılması. İkinci olarak, 2 saat boyunca 37 ° C 'de, 1 U karides alkalin fosfatazı ilavesiyle Xbal ile sindirilmesi, ısı 5 dakika boyunca 65 ° C'de etkisiz hale ve daha sonra manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırılması.
  12. Tam doğrusallaştınlmasının kontrol etmek için bir% 1 agaroz jeli üzerinde bir kesir çalıştırın. Kesilmemiş plazmid görülebiliyorsa, doğrusallaştırılmış fragmanı jel arındırılmalıdır.
  13. Memeli hücreleri içine transfeksiyonu için uygun bir MPRA kütüphanesi oluşturmak için, ara doğrusallaştırılmış kitaplığa Kpnl / Xbal uçları ile uyumlu bir bir ORF ligate.
  14. PMPRAdonor1 uyumlu bir luc2 ORF fragmanını hazırlamak için, 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ve Xbal ile sindirimi plasmid ve bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır. ORF parçasını kesip (1.7 kBu durumda, b) ve bir jel saflaştırma spin kolon kullanılarak saflaştırılması.
  15. 2,3-2,8 adımda tarif edildiği gibi doğrusallaştırılmış ara kitaplığa ORF parçası, klon.
  16. 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ile MPRA kütüphanenin (1-2 ug tekabül eden) bir tümbölen sindirmekte ve ürünleri bir% 1 agaroz jel üzerinde yapılmıştır. Sindirilmiş kütüphane tek bir bant olarak çalışıyorsa, ilave bantların (tipik olarak ara yapıların taşınmadan karşılık gelir), kütüphanesi aşağıdaki gibi bir daha antılabilir gözlenirse, Bölüm 3. edin:
  17. 1 saat boyunca 37 ° C'de Kpnl ile kirlenmiş kütüphanenin 3-5 ug sindirimi ve 4 ° C'de gece boyunca,% 0.8 agaroz jel üzerinde yapılmıştır.
  18. , Doğru kitaplığı grubu kesip çıkarmak jel saflaştırma spin kolon kullanılarak DNA'nın arıtılması ve 1 saat boyunca 37 ° C 'de yüksek konsantrasyonlu T4 DNA ligazı kullanılarak kendi kendine bağlanmasını gerçekleştirmek. Adım 2.8 'de açıklandığı gibi Sonra dönüşüm ve nihai kütüphane DNA izolasyonu tekrarlayın.

3. Transfection, Perturbasyon, ve RNA İzolasyonu

  1. Her bir bağımsız transfeksiyon, kültür, uygun bir ortam içindeki hücre istenilen sayıda (MPRA kütüphane karmaşıklığı ile tespit edildiği üzere, Tartışma) için. Örneğin DMEM kültür HEK293T / 17 hücreleri,% 10 FBS ve L-glutamin / penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. Her bir kütüphaneden ve deneysel koşul için en azından iki bağımsız Transfeksiyonlar için kültür hücreleri.
  2. MPRA plazmid ile kültürlenmiş hücrelerin transfekte. Transfeksiyon yöntemi ve koşulları, her hücre tipi için optimize edilmelidir. Her transfekte edilmiş bir örnek için, eşleştirilmiş bir kontrol olarak plazmid DNA bir kısım (50-100 ng) muhafaza eder.
  3. Örneğin, 0.5 x 10 7 HEK293T / yetişen 17 hücrelerini transfekte etmek için 30 ul ul Lipofektamin LTX'i ve 10 ul Plus tepkin maddesi kullanılarak İndirgenmiş Serum Ortamı 1 mi Opti-MEM içinde 10 ug plazmit DNA'sı ile 10 cm'lik bir kültür kabı içinde% 50 birleşir. 5 saat sonra transfeksiyon karışımı çıkarın ve sağlarhücreler 24-48 saat kurtarmak için.
  4. İsteğe bağlı olarak, tasarlanan kütüphanede, bağlama veya sinyal bağımlı düzenleyici sekansları aktif hale getirmek için gerekli olan herhangi bir karışıklığa gerçekleştirin.
  5. Hücreler hasat ve üreticinin talimatlarını kullanarak standart oligo (dT) selüloz sütunları veya boncuklar kullanılarak poli (A) + mRNA izole eder.
  6. Sütun veya boncukların maksimum bağlama kapasitesi Toplanan hücrelerden mRNA beklenen toplam miktarını aşan emin olun. Örneğin, bölüm 3,3 beklenen verim yaklaşık 0,5-2,5 mikrogram mRNA.

4. Etiket-Sıra

  1. Transfekte edilmiş hücre lizatları vektör DNA taşınmasını ortadan kaldırmak için, önceki 2.4 ul turbo DNaz inaktivasyonu reaktifi, 1 saat boyunca 37 ° C 'de 1 ul Turbo DNaz (2 U) ve 2.3 ul 10x turbo DNaz tampon maddesi ile her biri 20 ul numune mRNA'sı tedavi eklemek RT daha sonra 5 dakika karıştırma ile, 90 saniye boyunca 10,000 g'da santrifüj ve bir tüpe olarak solüsyon.
  2. Doğrulayın bir agaroz jeli üzerinde ürün mRNA'nın her numunenin 60-100 ng bölüm 4.6 de tarif edildiği gibi PCR yapılması, ve daha sonra çalıştırarak saflık. (Luc2 ile pMPRA1 kullanıyorsanız 0.25 kb) özel amplikonlar görünmüyorsa, sütun tedavi mRNA arındırmak ve ardından Dnaz tedaviyi tekrarlayın.
  3. , Etiket-Dizi sıralama kütüphaneleri oluşturmak cDNA'sına muhabiri mRNA dönüştürmek ve PCR ile dizileme bağdaştırıcısı eklemek.
  4. Tablo 3'te tarif edilen mRNA / RT primer karışımları ayarlayın. Sonra buz üzerine yerleştirin, 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edilir. Tablo 4'te tarif edildiği gibi paralel olarak, cDNA sentez reaksiyonları ayarlayın.
Reaktif 1x Hacmi (ul)
mRNA numunesi (400-700 ng toplam) 8
Oligo 0DT (50 uM) 1
dNTP (10 mM) 1
cDNA sentezi için ove_content "> Tablo 3. RNA / Ters transkripsiyon primer karışımını içerir.

Reaktif 1x Hacmi (ul)
10x SuperScriptTM III RT Tampon 2
MgCI2 (25mM) 4
DTT (0.1 M) 2
RNaseOut (40 U / ml) 1
Üst Simge III (200 U / ml) 1

Tablo 4. cDNA sentez reaksiyon karışımı.

  1. Yavaşça mRNA / RT primer cDNA sentezi karışımları ile karışır birleştirir. 50 dakika sonra, 5 dakika boyunca 85 ° C boyunca 50 ° C'de inkübe edilir ve daha sonra buz üzerine yerleştirin. Son olarak, 20 dakika boyunca, 37 ° C'de 2 U ribonükleaz H kuluçkalayın.
  2. 4-6 ul, Tablo 5'te tarif edildiği gibi PCR reaksiyonları ayarlamaReaksiyon karışımı, bir cDNA ya da şablon olarak 50 ng raportör plazmid. Daha sonra PCR amplifikasyonu (2 dakika boyunca 95 ° C, 26 x [30 saniye için 95 ° C, 30 sn için 30 saniye boyunca 55 ° C, 72 ° C], 3 dakika boyunca 72 ° C) gerçekleştirir.
Reaktif 1x Hacmi (ul)
2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix 25
Astar TagSeq_P1 (25 uM) 0.5
Astar TagSeq_P2 (25 uM) 0.5
Şablon (mRNA, cDNA ya da plazmid DNA karışımı) değişir
Nükleazlar içermeyen su 50

Tablo 5. Etiket-Dizi PCR reaksiyon karışımı.

  1. % 2 agaroz jeli içinden PCR ürünlerini çalıştırın Etiket-Seq kütüphane karşılık gelen amplikonun tüketim bantları (0.25 kb kullanılıyorsaluc2 ile pMPRA1) ve bu kullanılarak jel saflaştırma spin sütunları arındırmak.
  2. Yüzme havuzu, denatüre ve Illumina sıralama alet ile direkt olarak saflaştırılmış Etiket-Dizi amplikonları sırası.
  3. Filtre düşük kaliteli sıralı etiketi içinde daha az 30 puan veya b) tam bir dizayn etiketi eşleşmiyor bir Phred kalitesi ile bir veya daha fazla pozisyon içeren) tüm a kaldırarak okur. Kalan her etiketi, her kütüphanede görünür sayısını sayın. TPM (milyon başına dizilenmiştir etiketleri etiketler) etiket sayısını normalize ve dizileme kütüphanelerinin her çifti için plasmid türevli etiket sayısı fazla mRNA, türetilmiş etiket sayımı oranı hesaplanır. Birden fazla farklı etiketler, her sekans varyantının bağlantılı olsaydı, alt analizi için medyan oranlarını kullanın.

Sonuçlar

MPRA yüksek çözünürlüklü, transkripsiyonel düzenleyici elemanlarının dizi-etki ilişkileri kantitatif diseksiyon kolaylaştırır. Başarılı bir MPRA deney tipik olarak transfekte kitaplığı (Şekil 3A) dizilerin çoğunluğu için yüksek ölçüde tekrarlanabilir ölçümleri sağlayacaktır. Zayıf tekrarlanabilirlik (Şekil 3B) gözlenirse, bu durum, test dizileri arasında 1) düşük bir mutlak aktivitesi, ya da 2) düşük transfeksiyon verimi birine, geri kazanılan RNA örnekleri raportör mRNA, çok düşük bir konsantrasyonda bir göstergesidir.

Şekil 4, analiz etmek sureti ile üretilen bir temsili "bilgi izi" 1,2 gösterir ~ ya da Sendai virüsü maruz kalmadan HEK293 hücrelerinde insan IFNB geninin üst akışında bir 145 bp dizisinin rastgele 37000 varyantları. Promotör TATA-kutu ve bilinen yakın güçlendirici 10 açık bilgi açısından zengin Regi olarak tanımlanabilirbir virüs-bağlı bir şekilde ortaya koymuşlardır.

figure-results-1
Şekil 3. Etiket-Dizi tekrarlanabilirlik. Yüksek (A) ve düşük (B) tekrarlanabilirlik ile iki bağımsız çoğaltmak transfeksiyonlann Etiket-Sıra verilerden örnekler gösteren Dağılım araziler. İkincisi arsa iki çoğaltır sadece birinde yüksek mRNA sayıları ile birçok Aykırı etiketleri gösterir. Bu tür yapılar, tipik olarak, raportör mRNA'ların konsantrasyonu nedeniyle raportör yapılan arasında düşük mutlak aktiviteler, veya düşük transfeksiyon verimi için, ya da kantitatif PCR amplifikasyonu için çok düşük olduğunu göstermektedir.

figure-results-2
Insan IFNB transkripsiyon başlama alanı ile yakın arttırıcının Şekil 4. bilgi izi. yukan insan IFNB geninin bir 145 nükleotid (nt) bölgesi yaklaşık 37,000 rastgele varyantları, (A) ve Sendai virüsü (B) maruz kalmayan HEK293 hücrelerinde MPRA kullanılarak tahlil edilmiştir. Mavi çubuk her pozisyondaki raportör çıkışı ile nükleotid arasındaki karşılıklı bilgileri gösterir. Proksimal arttırıcı ve TATA kutusu viral enfeksiyon üzerinde yüksek bilgi içeriği bölgeleri olarak öne çıkıyor.

Tartışma

MPRA, gen düzenleyici elemanlardaki dizi-aktivite ilişkilerinin diseksiyonu için esnek ve güçlü bir araçtır. MPRA deneylerinin başarısı en az üç faktöre bağlıdır: 1) dizi kitaplığının dikkatli tasarımı, 2) amplifikasyon ve klonlama sırasında artefaktların en aza indirilmesi ve 3) yüksek transfeksiyon verimliliği.

Raportör yapılarındaki değişken bölgelerin olası uzunlukları, büyük ölçüde kullanılan sentez veya klonlama teknolojisi tarafından belirlenir. Standart OLS genellikle yaklaşık 200 nt ile sınırlıdır, ancak bu protokol en az 1.000 nt'ye kadar olan kesici uçlarla uyumludur. Yüksek oranda tekrarlayan veya güçlü ikincil yapılar içeren değişken bölgelerin, PCR ve klonlama önyargıları nedeniyle yeterince temsil edilebileceğini unutmayın. Değişken bölgelerin her birini tanımlayan etiketlerin uzunluğu 10-20 nt olmalı ve etiketlerin toplanması ideal olarak herhangi bir çift arasında en az iki nükleotid farkı olacak şekilde tasarlanmalıdır. Bilinen mikroRNA'nın tohum dizilerini veya mRNA stabilitesini etkileyebilecek diğer faktörleri içeren etiketlerden de mümkün olduğunca kaçınılmalıdır.

MPRA deneylerinin tasarımında önemli bir parametre, kitaplığa dahil edilecek farklı raportör yapılarının toplam sayısıdır (tasarım karmaşıklığı, CD ile gösterilir). Uygulamada, CD, transfekte edilebilen kültürlenmiş hücre sayısı ile sınırlıdır. Genel bir kural olarak, transfekte edilen hücrelerin toplam sayısı CD'den en az 50-100 kat daha fazla olmalıdır. Örneğin, 20 milyon hücre %50'lik bir transfeksiyon verimliliği ile transfekte edilebiliyorsa, CD ~200.000'den fazla olmamalıdır. CD'nin, farklı düzenleyici dizi varyantlarının sayısının, dizi başına farklı etiketlerin sayısıyla çarpımına eşit olduğuna dikkat edin. Her bir düzenleyici diziye ne kadar farklı etiketler bağlanırsa, o dizinin aktivitesinin tahmini o kadar doğru yapılabilir (çünkü farklı etiketlerden alınan ölçümlerin ortalaması alınabilir), ancak bir deneyde o kadar az farklı değişken test edilebilir. En uygun seçim deneysel tasarıma bağlıdır. Toplu ölçümlere matematiksel bir modelin yerleştirileceği basit bir "promotör darbesi" deneyinde, varyant başına tek bir etiket genellikle yeterlidir. Düzenleyici faaliyetlerde değişikliklere neden olan tek nükleotid polimorfizmleri için bir taramada, istatistiksel olarak sağlam sonuçlar elde etmek için alel başına 20 veya daha fazla etiket kullanmak gerekebilir, çünkü her bir alel çiftinin karşılaştırılması ayrı bir hipotez testi gerektirir.

Test edilecek dizilerin transkripsiyon başlangıç bölgeleri içermesi beklenmiyorsa, aynı fragmana sabit bir promotör de eklenebilir. Örneğin, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353), yukarı akış değişken bölgesinin önemli arttırıcı aktiviteye sahip olması beklendiğinde yararlı olan minimal bir TATA-box promotörü içerirken, pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354), değişken bölgenin susturucu aktivitesi veya diğer negatif düzenleyici elementler içermesi beklendiğinde yararlı olan modifiye edilmiş, güçlü bir SV40 viral promotörü içerir.

Ham OLS ürünleri genellikle kesilmiş oligonükleotitlerin önemli bir kısmını içerir. Bunlar, özellikle aralarında önemli bir homoloji olduğunda, tasarlanan dizilerin doğru PCR amplifikasyonuna müdahale edebilir. Kesilmiş sentez ürünlerini çıkarmak için PAGE saflaştırmasının ve amplifikasyon artefaktlarını en aza indirmek için emülsiyon PCR'nin kullanılması, yüksek kitaplık kalitesini sağlamak için etkili tekniklerdir. Her iki adım da pratik değilse, her amplifikasyon adımında kullanılan PCR döngülerinin sayısını en aza indirmek zorunludur. Sıvı kültürde klonlanmış kitaplığın seçimi ve genişletilmesi genellikle tasarım karmaşıklığını korumak için yeterlidir, ancak rekombinasyona eğilimli vektörler kullanılacaksa veya önemli temsil yanlılığı gözlenirse, geri kazanılan hücreler bunun yerine doğrudan büyük LB agar plakalarına kaplanabilir, tek tek koloniler olarak genişletilebilir ve daha sonra DNA izolasyonu için kazınabilir. OLS'de tipik olarak 1:100-500 oranında bulunan sentez hatalarının potansiyel etkisini dikkate almak da önemlidir. Bu tür hataları belirlemek ve düzeltmek için transfeksiyondan önce raportör yapılarının tam uzunlukta dizilenmesi önerilir.

Transfekte edilmiş kültürdeki her hücreye raportör yapılarının sokulması gerekli değildir, ancak ~%50'nin altındaki transfeksiyon verimlilikleri, zayıf sinyal-gürültü oranlarına yol açabilir. Yeni bir hücre tipinde MPRA deneyleri gerçekleştirmeden önce transfeksiyon koşullarının optimize edilmesi tavsiye edilir. Transfekte edilmesi zor hücre tipleriyle çalışırken, transfekte edilmiş hücrelerin önceden seçilmesiyle MPRA sinyalleri artırılabilir. pMPRA vektör serisi, RNA izolasyonundan önce transfekte edilmiş hücreler için fiziksel olarak zenginleştirmek için kullanılabilen kesik bir hücre yüzeyi işaretleyicisini yapısal olarak ifade eden varyantları içerir (örneğin, Addgene ID'leri 49350 ve 49351).

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma Ödülü Numarası R01HG006785 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Oligonükleotid kütüphanesi senteziAgilent, CustomArray veya diğer OLS satıcılarıözelOLS yapım yöntemi kullanılıyorsa
pMPRA1Addgene49349MPRA plazmit omurgası
pMPRAdonor1Addgene49352luc2 ORF donör plazmid
TE 0.1 Tampon (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)GenelyokOLS tamponu
Novex TBE-Üre Jelleri, %10YaşamTeknolojileri EC6875BOXSAYFA OLS ürünlerinin saflaştırılması
Novex TBA-Üre Numune TamponÖmrü TeknolojileriLC6876PAGE OLS ürünlerinin saflaştırılması
SYBR Altın Nükleik Asit Jel LekeÖmrü TeknolojileriS-11494SAYFA OLS ürünlerinin saflaştırılması
Miselül DNA Emülsiyonu & Saflaştırma KitiEURx/CHIMERx3600-01Emülsiyon PCR
Herkülaz II Füzyon DNA PolimerazAgilent600675Emülsiyon için polimeraz PCR
SfiINew England BiolabsR0123SpMPRA vektörleri ile kütüphane klonlama
KpnI-HFNew England BiolabsR3142SpMPRA vektörleri ile kütüphane klonlama
XbaIYeni İngiltere BiolabsR0145SpMPRA vektörleri ile kütüphane klonlama
T4 DNA Ligaz (2.000.000 birim/ml)New England BiolabsM0202TpMPRA vektörleri ile kütüphane klonlama
One Shot TOP10 Electrocomp E. coliLife TechnologiesC4040-50pMPRA vektörleri LB
agar ve karbenisilin içeren sıvı medyaJenerikn/aBüyüme ortamı klonlama
E-Gel EX Jeller 1%Life TechnologiesG4010-01Kütüphane doğrulama ve saflaştırma
E-Gel EX Jeller, %2LifeTechnologiesG4010-02Kütüphane doğrulama ve saflaştırma
MinElute Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28604Kütüphane ve omurga saflaştırma
EndoFree Plazmid Maxi KitiQiagen12362Kütüphane DNA izolasyonu
Hücre kültürü ortamın/an/aDeneye özgü
Transfeksiyon reaktiflerin/an/aDeneye özgü
MicroPoly(A)Purist KitLife TechnologiesAM1919mRNA izolasyonu
TURBO DNA içermeyen KitLife TechnologiesAM1907Plazmid DNA giderimi
SuperScript III Birinci İplikli Sentez Sistemi Ömrü Teknolojiler18080-051cDNA sentezi
PfuUltra II Hotstart PCR Master MixAgilent600850Tag-Seq PCR
Primerleri için Polimeraz (metne bakın)IDTözelSAYFASI Tag-Seq primerlerini saflaştırır
ile kütüphane klonlaması

Kaynaklar

  1. Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).
  2. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).
  3. Patwardhan, R. P., Lee, C., Litvin, O., Young, D. L., Pe’er, D., Shendure, J. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  4. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).
  5. Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Boryń, ŁM., Rath, M., Stark, A. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science (New York, N. Y.). 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  6. Kheradpour, P., et al. Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay. Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).
  7. White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).
  8. Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants. Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).
  9. Schütze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).
  10. Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. An atomic model of the interferon-beta enhanceosome. Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells
Posted by JoVE Editors on 3/01/2015. Citeable Link.

null

Daha fazla makale keşfet

Kitlesel Paralel Raporlayıcı AnaliziRaporlayıcı Kütüphanesi OluşturmaDNA Dizilim AnaliziGen Düzenleyici AktivitesiMemeli Hücrelerin TransfeksiyonuDerin Dizileme AnaliziEmülsiyon PCR ProtokolüPlazmit Kütüphanesi HazırlamaDizileme Etiketi SayımıHesaplamalı Analiz
Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.