Yöntem makalesi

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

DOI:

10.3791/51742

⸱

31 Aralık 2014

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odak Oluşumu Testi aday onkogen dönüşürken potansiyelini değerlendirmek için basit bir yöntem sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin kötü huylu transformasyonu tipik olarak artmış proliferasyon, temas inhibisyonu kaybı, ankrajdan bağımsız büyüme potansiyelinin kazanılması ve deney hayvanlarında tümör oluşturma yeteneği ile ilişkilidir1. NIH 3T3 hücrelerinde, Ras sinyal iletim yolunun, Ras dönüşümü olarak bilinen bu olayların çoğunu tetiklediği bilinmektedir. NIH 3T3 hücrelerinde aşırı eksprese edilen bir genin eklenmesi, morfolojik dönüşümü ve temas inhibisyonu kaybını teşvik edebilir, bu da ilgilenilen genin onkojenik potansiyelini belirlemeye yardımcı olabilir. Bir onkogenin transformasyon potansiyelinin bir yönünü değerlendirmek için basit bir yöntem sağlayan bir test, Odak Oluşum Testidir (FFA)2. NIH 3T3 hücreleri kültürde normal olarak bölündüğünde, bunu birleşik bir tek tabakaya ulaşana kadar yaparlar. Bununla birlikte, aşırı eksprese edilmiş bir onkogen varlığında, bu hücreler, kristal viyole veya Hema 3 boyama ile görselleştirilebilen ve ölçülebilen yoğun, çok katmanlı odaklar1'de büyümeye başlayabilir. Bu makalede, ilgilenilen genin NIH 3T3 hücrelerine retroviral transdüksiyonu ile FFA protokolünü ve boyama yoluyla odak sayısının nasıl ölçüleceğini açıklıyoruz. Retroviral transdüksiyon, transfeksiyondan daha verimli bir gen iletimi yöntemi sunar ve ekotropik bir murin retrovirüsünün kullanılması, potansiyel insan onkogenleri ile çalışırken bir biyogüvenlik kontrolü sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör hücrelerinin gen ifadesi örnekleri morfolojik ve proliferatif değişikliklere epigenomics için, değişiklik geniş bir yelpazesi ile, bunların normal emsallerine ayırt edilebilir. Sonuncular içinde, sonuç olarak, hayvanlara enjekte edildiğinde tümör oluşturma yeteneği habis dönüşüm 3 yararlı ölçülebilir göstergeleri, serum bağımlılığı, kontak (yoğunluğu) inhibisyonu kaybı, ankoraj-bağımsız çoğalma satın azalır ve. In vitro ve in vivo tahliller çeşitli hücresel transformasyon için geliştirilmiştir. In vitro deneyler, amaç (düşük serumda büyümesi) belirlenmesi ve kültür morfolojisi (odak oluşumu testi), kültür dinamiği (büyüme oranı, doygunluk yoğunluk) ve büyüme faktörü değişiklikleri ölçülmesi veya gereksinimleri ankraj (yumuşak agar büyüme). Bir hücre tipi malign tabiatını tespit etmek için altın standart deney hayvanlarında tümör formasyonu (ksenogrefleri) kalır. Bununla birlikte, TO mal ve in vivo çalışmalar uzunluğu her zaman aday onkojenlerin ilk doğrulama adımı veya tarama gibi onları haklı yapmazlar. Hiçbir in vitro deney, bir genin onkojenik potansiyeli kesin bir değerlendirmesini sağlar rağmen, onlar in vivo çalışmalar geleceği daraltmak olabilir onkojenik potansiyeli içgörü sağlarlar. In vitro onkojenik potansiyeli değerlendirmek için en yaygın kullanılan sistemlerden biri Odak Oluşumu Testi 2. Bu yaklaşım, NIH 3T3 fare fibroblast, mutlaka temas inhibisyonu gösteren bir dönüştürülmemiş hücre çizgisinin kullanımına dayanır. Yoğunluk bağımlı büyüme kaybına bir onkogen sonuçların aşırı ekspresyonu; Dönüştürülen hücreler daha sonra kolayca dönüştürülmemiş hücrelerin arka plan tek tabaka ile görselleştirildi "odak" oluşturan, çok sayıda tabaka halinde büyüyebilir. İletişim inhib kaybı ile kanıtlandığı gibi odak oluşumu Deneyi, daha sonra, habis dönüşümünün uyarılması için aday onkogen kabiliyetini ölçmektedirölçülebilir fenotip olarak yerleştirme. FFA (örneğin, Src 4 BRAF 5), protein kinazların aşırı ekspresyonu, transkripsiyon faktörleri (örneğin, N-myc 6) (örneğin, P2RY8 7), G-protein bağlı reseptörler ve GTPazlar (örneğin, dönüşümün değerlendirmek için kullanılmıştır Ras 1), ve diğerleri. Bu deneyde göreli kolaylığı genin ekspresyonu in vitro NIH 3T3 fare fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olup olmadığı hızlı ve görsel net bir cevap verecek iyi bir seçim yapar.

Bu protokol açıklanan FFA viral ambalaj proteinleri sağlar Plat-E ambalaj hücre hattı 8, kullanır ve retroviral vektörü pBABEpuro 9 (Addgene plazmid 1764) retrovirüs üretmek. İlgi konusu geni içeren pBABEpuro yapısı ile transfeksiyondan sonra Plat-D hücre çizgisi NIH 3T3 hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir ekotropik retrovirüs üretecektir. TGen teslim onun viral yöntem, geleneksel kimyasal transfeksiyon yöntemlere göre daha etkili olduğunu ve sürdürülebilir geni 10 ifade etmek için bir yol sunar. Bir kez NIH 3T3 hücrelerinin genomu içine dahil edilmiş, ilgi konusu genin aşın virüs uzun terminal tekrarları (LTR) promoteri 11 tarafından tahrik edilir. Bu sabit ifade eden NIH 3T3 hücreleri üzerinde odaklarının oluşumu ile ölçüldüğü haliyle ilgi konusu genin onkojenik etkinliğe sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Viral vektörlerin yapımına

İlgi konusu genin, hem de pozitif ve negatif kontroller için kodlama dizileri, geleneksel klonlama (PCR amplifikasyonu, sınırlama sindirimi ve ligasyon) ile pBABEpuro sokulur. BamHI, SnaBI, EcoRI ve SalI: DNA ilave edilebilir vektör üzerindeki dört kısıtlama bölgeleri vardır.

  1. QIAGEN plazmit Midi Kit kullanılarak yetkili hücrelerin transfeksiyonu dereceli plazma DNA hazırlanır.
  2. Bir NanoDrop2000 spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçümü.

2. Retrovirus Üretimi

Plat-E, paketleme hücre soyu NIH 3T3 hücreleri ilgilendiren cDNA teslim edecek ekotropik retrovirüs üretmek için kullanılır.

  1. Dondurulmuş Hücreleri Plat-e Kültürler kurulması
    1. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde Plat-E hücreler eritin ve 15 ml konik tüp aktarın. Yavaş yavaş (Du Plat-E orta 9 ml ekleyinlbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) + penisilin ve streptomisin).
    2. 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır.
    3. 10 cm kültür çanak Plat-E orta ve transfer 10 ml hücreleri yeniden askıya.
    4. Bunlar% 80-90 ortak akışlı (yaklaşık 2 gün) kadar 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe hücreleri.
  2. Hücre Bölme
    1. Orta aspire ve bir kez PBS ile yıkayın hücreleri.
    2. % 0.05 tripsin-EDTA 2 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin.
    3. , Dokunarak parmak hücreleri ayırmak Plat-E orta 10 ml ekleyin ve 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın.
    4. 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır.
    5. Plat-D ortamı 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 yeni yemekler bunları tohum: 4-1: 6 dilüsyonları.
  3. Plat-E Tohumlama ve Transfeksiyon
    1. Tohum, 2 x 10 6Herhangi bir antibiyotik olmadan Plat-E ortamı kullanılarak 10 cm kültür çanak başına hücreleri.
    2. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe hücreleri O / N inkübe edin.
    3. Ertesi gün, her 1.5 ml mikrofüj tüpüne Opti-MEM içinde 300 ul aktarın.
    4. Opti-MEM ile hazırlanan bir tüpe, polietilenimin 27 ul (PEI), düşük maliyetli bir transfeksiyon ayıracı 12 ekleyin. Dokunarak parmakla hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
    5. Opti-MEM / PEI tüp içine transfeksiyon dereceli plazmid DNA 9 ug ekle vorteks ile yavaşça karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. Ekle DNA / PEI Plat-E kabına ve 37 ° C'de O / N inkübe karmaşık bilge damla,% 5 CO 2.
    7. Bir sonraki gün, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir ortam aspire ve (antibiyotikler olmadan) taze Plat-D ortamı 10 ml ekleyin.
    8. Inkübatör hücreleri dönün.

3. NIH 3T3 hücreleri ve Enfeksiyon

  1. NIH kurulması3T3 Kültürleri ve Tohumculuk
    1. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde, NIH 3T3 hücrelerini eritin ve 15 ml'lik bir tüpe transfer. Yavaş yavaş NIH 3T3 ortamında (DMEM +% 10 FBS) 9 ml ekleyin.
    2. 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır.
    3. 10 cm'lik bir kültür tabağına, NIH 3T3, orta ve devir, 10 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri.
    4. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe hücreleri. Bu kendiliğinden dönüşüm (ve odak oluşumu bu nedenle, bazal seviye) sıklığı gibi bir kültür konfluent ulaştıktan sonra artar, NIH 3T3 hücreleri, her zaman underconfluent (% 50-60) tutulması çok önemlidir.
    5. 10 cm çanak başına tohum 3 x 10 5 hücreleri ve ertesi gün enfeksiyonu için O / N kuluçkaya yatmaktadır.
  2. Enfeksiyon
    1. 0.45 um gözenek boyutlu naylon zar filtre boyunca, 10 ml'lik atılabilir bir şırınga kullanılarak, ve 15 ml aktararak Plat-E, çanak retroviral süpernatan hasattüp.
    2. (Antibiyotikler olmadan) hücrelere taze Plat-E orta 10 ml ekleyin ve inkübatör onları geri.
    3. Enfekte NIH 3T3 hücre çanak orta aspire ve virüs ihtiva eden, süzüldü süpernatanın 5 normal NIH 3T3 ortamının ml ve 5 mi ekleyin.
    4. 6 ug / ml'lik bir konsantrasyonda çanak polybrene ekleyin.
    5. 37 ° C'de,% 5 CO2 hücreleri O / N inkübe edin.
    6. Enfeksiyon ikinci tur için 3.2.5 - Ertesi gün, tekrar 3.2.1 adımları.
    7. Normal NIH 3T3 ortamı ile virüs içeren ortam değiştirin.
    8. Gerektiğinde ortamının değiştirilmesiyle, NIH 3T3 hücreleri, 2-3 hafta boyunca büyümeye izin verin. Çoğaltma plakalarından bütün hücre lizatları üzerindeki geleneksel protein elektroforezi ve immüno-lekeleme ile, ilgilenilen proteinin ekspresyonunu kontrol edin.

4. Boyama ve miktarının belirlenmesi

  1. Kristal Violet Boyama
    1. NIH 3T3 orta aspire ve yemekler yerBuz üzerinde.
    2. Buz soğukluğunda PBS ile iki kez yemekler yıkayın.
    3. 10 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol ile hücreleri saptamak.
    4. Buz yemekler çıkarın metanol havalandırın, ve 25% metanol (RT) 'de yapılan% 0.5 kristal mor çözelti 3 ml ekleyin.
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yemekler inkübe edin.
    6. Kristal viyole çözüm aspire ve hiçbir renk durulama kapalı gelene kadar dikkatli Milli-Q H 2 O ile çanak durulayın.
    7. Yemekleri masa üstü Ç / N kurumasını bekleyin (ortaya).
  2. Foci Kantifikasyon
    1. Yemekler, kuru, plaka üzerinde hücrelerin koyu renkli koleksiyonlarını ölçmek için bir cetvel kullanın. Sadece olarak çapı 5 mm'nin olanlar saymak "odaklar." Odaklarının sayısını kaydedin ve ortalamalar ve kontrollere göre önemini hesaplamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MXD3 MYC / MAX / MAD ağının bir üyesi olan temel bir sarmal döngü-heliks lösin fermuar (bHLHZ) transkripsiyon faktörüdür. Bu MAD ailesinin 13-15 bir atipik üyesi olduğunu ve karsinogenezinde 16,17 rol bildirilmiştir. PBABEpuro (negatif kontrol) ve myc (pozitif kontrol) ile karşılaştırıldığında, MXD3 aşın NIH 3T3 yemekler önemli ölçüde daha az odakları (Şekil 1A) vardı. Şekil 1 B 'de veri önemini belirlemek için birden çok deneyden elde edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FFA in vitro malign transformasyon değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yöntem sağlar. Aday genler nispeten büyük sayıda taranması için uygundur ve mütevazı teknik gereksinimler, maliyet açısından tercih. Bundan başka, iki ya da daha çok gen birlikte eksprese edilebilir kombinasyonunun tümörijenik potansiyelini değerlendirmek için (bazen "işbirliği" deneyi olarak da adlandırılır). Bu testin avantajları basit tekniği, miktar kolaylığı ve nispeten kısa dönüş etrafında zaman güveniyor. O, tüm in vi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH Yönetmenin Yeni Yenilikçi Ödülü Programı (ED) bir hibe ile desteklenmiştir. AA Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı lisans ödülleri kısmen desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pBABE-puro vektörAddgenePlasmid 1764klonlama vektörü
Platinum-E Retroviral Paketleme Hücre Hattı, EcotropicCell Biolabs, Inc.Viral üretim içinRV-101
NIH 3T3 Hücre Hattı murinSigma-Aldrichodakoluşum deneyi için 93061524 hücre hattı
10 ml BD Luer-Lok uçlu şırıngaBD Biosciences309604viral üretim reaktifi
0.45 &; m Puradisc Şırınga FiltresiWhatman6750-2504viral üretim reaktifi
Polietilenimin (PEI)Polysciences, Inc.23966-2hücre transfeksiyon reaktifi Polybrene
Enfeksiyonu / Transfeksiyon ReaktifiEMD MilliporeTR-1003-Ghücre transfeksiyon reaktifi
Crystal VioletFisher ScientificC581-25hücre lekesi reaktifi
Plasmid Plus Midi KitiQIAGEN12945plazmit saflaştırma
BD Falcon Doku Kültürü YemekleriBD Biosciences353003Hücre Kültürü Malzemeleri
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco11995-065hücre kültürü ortamı
%0,05 Tripsin-EDTAGibco25300-054hücre kültürü malzemeleri
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıGibco31985-062hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco16000-044hücre kültürü ortamı
hücre hattı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
  2. Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
  3. Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
  4. Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
  5. Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
  7. Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
  8. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
  9. Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  11. Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
  12. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
  13. Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
  14. Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
  15. Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
  16. Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
  17. Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508(2012).
  18. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Odak Olu um AnaliziRetroviral Transd ksiyonNIH 3T3 H creleriKristal Viyole BoyamaPla E Paketleme H creleriGen A r EkspresyonuKontak nhibisyon KaybOdaklar n NicelendirilmesiH cre Transformasyonu

İlgili makaleler