Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

39.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51751

⸱

8 Eylül 2014

 ,  , 
1CNRS, UMR-5203, Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, 2Inserm, U661, Montpellier, 3Universités de Montpellier

Bu makalede

Özet

Dopaminerjik nöronlar beyinde hayati bir düzenleyici rol oynar. Kayıpları Parkinson hastalığı ile ilişkilidir. Bu videoda, embriyonik fare mezensefalondan merkezi dopaminerjik nöronların birincil kültürlerinin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz. Bu tür kültürler, bu nöronların çeşitli streslere karşı aşırı savunmasızlığını incelemek için yararlıdır.

Özet

Dopaminerjik nöronlar, beyindeki sinir hücrelerinin toplam sayısının en az% 1 temsil etmektedir. Nöronların Bu düşük miktarı, motor kontrolü, motivasyon ve çalışma belleği gibi önemli beyin fonksiyonlarını düzenler. Nigrostriatal dopaminerjik nöronlar selektif Parkinson hastalığı (PH) dejenere. Bu ilerleyici nöron kaybı tümden patolojinin motorlar semptomları (bradikinezi, dinlenme tremor ve kas sertliği) ile ilişkili. Dopaminerjik nöron dejenerasyonu sorumlu ana ajan hala bilinmemektedir. Bununla birlikte, bu nöronlar çeşitli koşullarda çok hassas olduğu görülmektedir. Primer kültürler özellikleri ve dopaminerjik nöronların özelliklerini araştırmak için en uygun modellerden birini oluşturmaktadır. Bu kültürler durdurmak ya nöronal dejenerasyonu yavaşlatmak amacıyla PD patolojiyi taklit çeşitli stres ajanları ve nöroprotektif bileşiklere sunulabilir. Jeneratör olmuştur PH çok sayıda transgenik fare modellerison on yılda ated başka dopaminerjik nöron kültürler için araştırmacıların ilgisini artırmıştır. Burada, video protokol embriyonik fare beyinleri hassas diseksiyon üzerinde duruluyor. Ventral mezensefalon hassas eksizyonu Daha sonraki çalışmalar, izin vermek için yeteri kadar dopaminerjik hücrelerin nöronal zengin kültürler elde etmek için önemlidir. Bu protokol, embriyonik transgenik fareler ile gerçekleştirilir ve immünofloresan boyama, nicel PCR, ikinci haberci miktarının ya da nöronal ölüm / hayatta kalma değerlendirme için uygundur edilebilir.

Giriş

Dopamin, temel beyin nörotransmitter 1,2 biri, esas olarak orta beyin dopaminerjik (DA) nöronlar tarafından serbest bırakılır. DA nöronlarının çoğunluğu mezensefalon 2-6 ventral kısmında bulunur. Mesostriatal, mezolimbik ve mezokortikal yollar 2,5 şematik olarak, orta beyin DA nöronlar anatomik ve fonksiyonel üç ayrı projeksiyon sistemleri ayrılabilir. Prefrontal korteks projelendirme dopaminerjik yollar biliş 2 karıştığı oysa nigrostriyatal yolu, mezolimbik yollar takviyesi, motivasyon ve öğrenme önemli bir rol oynar, motor davranışları yer almaktadır.

DA nöronlar örneğin, şizofreni, dikkat eksikliği, hiper aktivite bozukluğu, ve Parkinson hastalığı (PD) 2,4 gibi bazı insan nörolojik hastalıklarda rol oynamaktadır. PD substantia nigra bağlantı DA nöronlarının bir ilerici ve seçici dejenerasyonu ile karakterizedirstriatum pars compacta (SNc). PD motor semptomların sorumlu striatum şiddetli dopamin tükenmesine nigro-striatal DA nöronlar sonuçlarının kaybı (bradikinezi, dinlenme tremor ve rijidite) 7. Idiyopatik PH başlangıç ​​nedeni kanıtlanmamıştır ve güncel tedaviler striatum dopamin seviyesini yeniden amaçlayan, sadece semptomatik vardır. En reçete ilaç, L-dopa (levodopa), dopamin doğal öncüsüdür. Levodopa yönetimi belirli bir süre için dopamin kaybı telafi rağmen, motor komplikasyonlar sonra (üzerine diskinezi ve / kapalı devletler) uzun süreli tedaviler 8,9 oluşur.

Dopaminerjik nöronlar ve PH ilgili araştırma sürekli ilerlemesi ve yoğun çabalar hücre nakli, gen tedavisi veya nöroprotektif ajanların 10,11 dayalı tedaviler geliştirmek için yapılıyor. Ancak, büyük bir sorun olmayan aydınlatılamamıştır kalır: aşırı vulnerab nedeni nedirDA nöronların lü k? Cevap kısmı DA nöron aktivitesi bulunabilir. Elektriksel aktivitesinde ve DA, nöronların uyarılabilirliğinin bir azalma 12 dejenere için eğilimlerini artırmak gibi görünüyor. Bununla birlikte, PD patojenezin karmaşıklığı DA katılan mekanizmaları nöronlar 13-15 dejenerasyonu tespit için ileri çalışmalara gerek.

Primer kültürler DA nöron özelliklerini 16-19 incelemek ve nöroprotektif ajanların 20-24 değerlendirilmesi için çeşitli streslere bu nöronların meydan özellikle alakalı. Sıçan kültürü modeli, genellikle fare embriyo mezensefalon ayrılmasının daha kolay olduğu için, fare ile karşılaştırıldığında, nöronların ve daha yüksek miktarlar da Fare içinde elde edilebilir kullanılır. Ancak, hastalığın 25 transgenik fare modelleri nesil fare 26-29 primer kültürler için nörolog toplumun ilgi artmıştır ölçüde etti. Pr kültürlerin rağmenyeni doğmuş hayvanların epared bu nöronların ayırt etme kapasitelerini muhafaza zaman, mitotik sonrası aşaması (mezensefalon nöronlar için E 13.5) embriyo bunları hazırlamak için daha da kullanılabilir. Aşağıdaki protokol hazırlamak için en zor olan fare embriyoları (E 13.5), birincil kültürde izole mezensefalon nöronlar sunar. Özellikle, daha iyi bir yeniden üretilebilirlik için, serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak bir protokol sağlar. Kültür hazırlama (diseksiyon ve mekanik ayrışma) olarak iki en kritik adımlar dikkatle ilişkili videoda detaylı olarak açıklanacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan farenin bakım ve Avrupa Birliği Konseyi kurallarına laboratuvar hayvanlarının kullanımı için (86/609 / AB) uyarınca ele alınmıştır.

Gerekli Çözümleri 1. Hazırlık

  1. Hazır Çözümler
    1. 10x Poli-L-Ornitin (PLO) Çözüm: PLO hidrobromid 10 mg tartılır (molekül ağırlığı = 30,000-70,000) doldurulmuş ve steril, 70 ml su içinde çözülür. -20 ° C de 0.2 um şırınga filtresi, kısım kullanılarak çözeltisi ve mağaza Filtre.
    2. % 30 glükoz solüsyonu: 30 D (+) g tartın - Glukoz ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    3. 5x Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / Nutrient Mixture Ham F-12: DMEM / Ham F-12, 6 g toz tartılarak 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    4. % 7.5 Sodyum Bikarbonat (NaHCO3) Solutiile: NaHCO 3, 7.5 g tartılır ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    5. 1 M HEPES Çözüm: HEPES 23.8 g tartılır ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    6. % 70 (h / h) etanol: steril su, 30 ml mutlak etanol içinde 70 ml seyreltin.
  2. Glikoz ve Antibiotics (PBS-GAB) Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi: 10% 30 glükoz solüsyonu ve Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin, 500 ml penisilin-streptomisin çözeltisi 5 ml ilave ediniz. 4 ° C'de saklayın.
  3. Pasif hale getirilmiş fetal sığır serumu (iFBS) gece boyunca 4 ° C'de bovin serum çözülme ve 30 dakika boyunca 56 ° C'de etkisiz hale getirirler. -20 ° C'de 50 ml kısım ve mağaza.
  4. Kültür vasatı: steril suda, 5x DMEM / Ham F12-ardışık olarak 40 mi, 1 M HEPES 1 mi, 2 mi 200 mM L-glutamin, Penisilin-Streptomisin, 2 mi, 4 ml% 30 glikoz, bir karıştırınnd 180 ml'lik bir nihai hacme kadar% 7.5 NaHCO3 3 mi. Filtre ve aynı gün kullanın.
  5. Hormon Mix
    1. Kültür ortamının 180 ml hazırlayın. Bu ortamda apo-transferin 200 mg çözülür.
    2. Insülin 50 mg tartılır ve 0.1 M HCI, 2 ml içinde çözülür. Yavaşça, karıştırma sırasında steril su içinde yavaş yavaş 8 ml ilave edilir. Kültür ortamında bu çözüm ile seyreltilir.
    3. Putresin dihidroklorür 19,3 mg tartılır ve steril 10 ml su içinde çözülür. Hormon karışımı 10 ml'lik bir solüsyon ilave edin.
    4. , Steril su içinde bir 3 mM sodyum selenit çözeltisi ve mutlak etanol içinde bir 2 mM progesteron çözelti hazırlayın. Hormon karışımı her çözeltiden 20 ul ekle.
    5. -20 ° C'de hormon karışımı, bir kısım halinde, 10 ml ve mağaza Filtre.

Kültür Plakalar ve Araçların 2. Hazırlık

  1. Kültür levhalarını FBS Kaplama: diseksiyon önceki gün, kültür ortamının 180 ml hazırlar. 10 ml eklemekültür ortamı 90 ml iFBS. Ekle 300 ul / oyuk kültür ortamı / poli-D-lizin önceden kaplanmış 24 oyuklu plakalar içinde% 10 iFBS. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. 4 ° C 'de (ve iFBS olmadan) kalan ortamı saklayın.
  2. Aletleri ve Pasteur pipetler sterilize edin. Sınıf II laminar akış ve CO 2 inkübatör yanı sıra malzemeler tabloda listelenen ekipmanı toplayın.

Fare mezensefalonun 3. Diseksiyon

  1. (Kurumsal kurallarına göre) E13.5 hamile fare Kurban. % 70 etanol ile fare karın temizleyin ve karın duvarı açın. , Narin makas kullanarak bunları açmak, rahim boynuzları toplayın rahim boynuzları her embriyo incelemek ve amniyotik membranlar kaldırmak. Steril PBS-GAB içeren bir 100 mm Petri kabındaki embriyolar yerleştirin ve forseps kullanarak 3 ardışık aynı hamam transferi ile yıkayın. Diseksiyon için, 60 mm steril Petri kabı içinde 3 embriyolar yerleştirin.
  2. Movstereomicroscope altında son Petri e. Embriyoların kafasını etmeyin. Vannas makas kullanma, beyinleri kesip.
    1. Dikkatlice çıkarın ve ön ve arka beyin bölgeleri atın. Rostral tarafına, berzah bölgede kaudal yan kesim için, talamik bölgeye yakın kesim üstün kollikulusu çıkarın.
    2. Ön orta beyin izole edildikten sonra, dikkatli bir şekilde ultra ince forseps kullanılarak meninks çıkarın. PBS-GAB ile dolu bir steril 13 ml tüp içinde, meninkslerde olmadan kesilmiş parçalarını toplamak.
  3. % 70 etanol ile iyice mesencephala içeren tüp temizleyin ve kaputun altında getirmek.

4. Hücre Ayrılma

  1. Yıkama steril PBS ile 3 kez GAB mesencephala. Beyin fragmanları Her yıkama arasında yerleşmek ve doku bozmamak için izin ver. Son yıkamadan sonra, 37 ° C'de 15 dakika boyunca tripsin / EDTA, 3 ml beyin bölümleri mümkün olduğu kadar çok dikkatli bir şekilde çözeltinin ayrılması ve inkübe2 inkübatör CO.
  2. Yangın-lehçe Pastör pipetleri olmayan bir parlatılmış cam pipet sonu olarak nöronların canlılığını maksimize keskin ve ayrışma adımları sırasında hücrelere zarar verebilir. Bunu yangın parlatma esnasında hafifçe ekstremite çapını Pasteur pipet (0,5 mm) azaltır.
  3. Dikkatle mümkün olduğu kadar tripsin / EDTA çözeltisi çıkarın ve kültür ortamı 10 ml /% 10 iFBS ekleyin. Yıkama beyin bölümleri kültür ortamı /% 10 iFBS ile 3 kez.
  4. Yangın cilalanmış Pasteur pipeti kullanarak, kültür ortamı /% 10 iFBS 6 ml mesencephala ayrılmasını başlar. Öğütün 10x daha sonra yeni bir steril 13 ml tüp içinde orta toplamak parçalar oturmasına izin verin, (hava kabarcıklarını önlemek).
  5. , Kültür ortamı, 6 ml ilave kez önceki adımı tekrar ve aynı 13 ml'lik bir tüp içinde çözülmüş hücreleri içeren ortamın toplanması.
  6. 5 dakika boyunca 160 g'de santrifüje hücreleri. Süpernatant atılır ile takviyeli kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri10% hormon karışımı.

5. Hücre Kaplama

  1. Bir Malassez hücre içinde süspansiyon halinde hücrelerin sayısı ve 600,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon ortamın seviyesini ayarlar. Çevresi 1,700,000 hücreleri bir fare mesensefalonundan elde edilebilir.
  2. 24-delikli plakadan boyama maddesini FBS içeren çıkarın ve her bir kuyu hücre süspansiyonu 1 ml eklemek (600,000 hücre / göz, TH + hücrelerinin% 2-4).
  3. 37 ° C'de inkübe edin ve% 5 CO 2/95% hava. Hiçbir orta değişim gereklidir. Dopaminerjik nöronlar in vitro yaklaşık 5-7 gün (dopamin taşıyıcı tutarlı ifadesi) sonra olgun. Orta değiştirmeden 15 gün kültür up hücreleri tutun.

6. İmmünofloresan Protokol

  1. Lameller Temizleme
    1. Diseksiyon bir gün önce, bir Petri kutusu içine 1 M HCI 10 ml ekleyin. Sıvı 12-15 cam kapak yüzeyinde yerleştirin ve 15 dakika bekleyin.
    2. Kapağın Evyesıvı girebilir ve 15 dakika boyunca bekleyin.
    3. , HCI yi uzaklaştırmak ve su ile 3 kez yıkanır.
    4. Bir kez saf etanol ile hızlı bir şekilde lamelleri yıkayın, sonra tabak saf etanol ilave edin ve 30 dakika boyunca bekleyin.
    5. Kapağın altında, etanolden temizlenmiş lamelleri çıkarın ve steril pensler kullanılarak bir 12-yuvalı hücre kültürü plakasının oyuk başına 1 lamel ekleyin.
    6. Yıkama steril su (1 ml / oyuk) ile iki kere lamelleri. Daha sonra, steril bir kez PBS ile yıkayın.
  2. Lameller Kaplama
    1. PBS çıkarın ve 500 ul / 2x FKÖ'nün (PBS içinde seyreltilmiş) ilave edin. CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 4 saat süreyle inkübe edilir.
    2. FKÖ çözüm çıkarın ve steril PBS ile 3x yıkayın.
    3. PBS çıkarın ve 500 ul / gözenek% 20 iFBS / 1 ug / ml laminin ekleyin. CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
  3. İmmünofloresan için Hücreleri Kaplama
    1. 12-delikli plakadan kaplama orta çıkarın.
    2. 900,0 ekleme00 hücre / göz 2 ml hacim içinde ve inkübatör içinde 37 ° C'de hücreler büyür. Hücreler ortam değiştirme olmadan 15 gün kültür kadar tutulabilir.
  4. İmmünoboyama
    1. 12-delikli plakadan Ortamı çıkarın ve DMEM, 37 ° C'de önceden ısıtılmış / 500 ul ile yıkayın.
    2. / Oyuk DMEM 500 ul, 37 ° C'de önceden ısıtılmış eklenmekte, daha sonra yavaşça 160 | il / göz, 8% paraformaldehid (PFA,% 2 nihai konsantrasyon) ilave ediniz ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
    3. PFA çıkarın ve PBS ile 3x yıkama / 0.1 M glisin, 10 dakika boyunca.
    4. , PBS çıkarın 300 ul / göz PBS /% 0.05 Triton X-100/20% Keçi serumu ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
    5. , Orta çıkarın 300 ul / göz PBS içinde seyreltilmiş birincil antikor /% 0.05 Triton X-100/1% Keçi serumu ilave edilir ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. Dopaminerjik nöron ve kültürün karakterizasyonu tespiti için kullanılabilecek primer antikorlar Malzeme tabloda belirtilmiştir. Keep1 kuyusu primer antikor olmadan farklı ikincil antikorların arka değerlendirmek için.
    6. Ortamı çıkarın ve PBS ile 3x yıkama /% 0.2 jelatin 10 dakika karıştırıldı.
    7. , Orta çıkarın 300 ul / göz PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor /% 0.05 Triton X-100/1% Keçi serumu ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Kullanılan ikincil antikorlar malzemeleri tabloda belirtilmiştir.
    8. Ortamı çıkarın ve PBS ile 3x yıkama /% 0.2 jelatin 10 dakika karıştırıldı.
    9. Orta çıkarın ve PBS ile 3x yıkayın.
    10. Aşağı Vectashield bir damla cam slaytlar hücre tarafında lamelleri monte edin. Daha sonra 4 ° C'de saklayın, montaj orta kuruması için oda sıcaklığında bir gece slaytlar tutun.
    11. Konfokal mikroskop ya epifluoresan için donatılmış bir faz-kontrast mikroskobu kullanılarak görüntü kazanır. Temsilcisi görüntüleri Leica SP2 UV odaklı mikroskop ile elde edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mezensefalon kültür adımların bir akış şeması gösterilmektedir, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kısaca, bir gebe fare E 13.5 İsviçre embriyolar alındıktan sonra, ventral mezensefalon tüm embriyo parçalanmıştır. Izole beyin parçaları arka arkaya enzimatik sindirim ve mekanik ayrılma sunulur. Ayrılan hücreler, önceden kaplanmış 12 ya da 24 oyuklu plakalar üzerinde kültür ortamı içinde yeniden süspansiyona alınmış ve kaplama, santrifüj ile pelet haline getirildi. Hücreler orta değiştirmeden 15 gün kadar mu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, embriyonik fare ve dopaminerjik nöronlar tespit etmek için immünofloresan prosedürden mezensefalik nöronlar primer kültürü hazırlamak için gerekli prosedürler ve reaktif maddeler sunmaktadır. Prosedürün kritik aşamaları embriyoların diseksiyon ve toplanan beyin parçalarının mekanik ayrışma bulunmaktadır. Yüksek kaliteli diseksiyon aletleri diseksiyon tekniği master yardımcı olur. DA nöronlar mezensefalonun küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu duruma göre, ventral mezensefalon sağ tarafına toplama DA nöronl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

CNRS ve INSERM'den alınan hibelerle desteklenmektedir. Başbakan, Fondation pour la Recherche Médicale en France'dan (Equipe FRM 2009) destek aldığını kabul etti. SC, Fondation de France'ın desteğini kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fetal SığırSerumu Lonza14-801F
DMEM 4.5 g/L L-glutamin içeren glukozLonzaBE12-604F
%0.05 Tripsin-EDTA (1x), fenol kırmızısıYaşam Teknolojileri25300-054
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)Yaşam Teknolojileri15140122
L-Glutamin, 200 mM çözeltiYaşam Teknolojileri
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu SalaminSigma-Aldrich D8537
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Besin Karışımı F-12 JambonSigma-Aldrich D0547Toz
Laminin - Tris tamponlu NaClSigma-Aldrich içinde 1 mg / ml L2020
Poli-L-Ornitin hidrobromürSigma-Aldrich P3655
Domuz pankreasından insülinSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrin insanSigma-Aldrich T1147
Putresin dihidroklorürSigma-Aldrich P5780
ProgesteronSigma-Aldrich P8783
Sodyum selenitSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlisinSigma-Aldrich G7126Stok çözeltisi 1 M su
JelatinSigma-Aldrich G9391Stok çözeltisi suda %2 (a/h)
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehit suda %16Elektron Mikroskobu BilimleriRT 15710-S
Sodyum bikarbonat (NaHCO3)Merck Millipore 106329
D (+) - Glikoz, MonohidratMerck Millipore4074-2
Hidroklorik asit - c (HCl) = 1 mol / L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Steril su - Aqua B. BraunBraun
Etanol mutlak NORMAPUR analitik reaktifVWR20821.321
Steril Petri kaplarıVWR82050-566
Pasteur pipetleri düz cam - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Sayma odası MalassezVWR631-0975
Supor Membranlı Serum Akrodisk Şırınga Filtresi, Steril, GF / 0.2 ve mikro; m, 37 mmPALL Yaşam Bilimleri4525
Cerrahi Makas - Düz, keskin-keskin, 14,5 cm uzunluğundaİnce Bilim Aletleri14002-14Karın duvarını açmak için
Makas - Düz, sivri, narin, 10 cm uzunluğundaMORIA4877ARahim duvarını açmak için
Forseps - Kavisli, olağan, tırtıklı çeneler 1 mmMORIA2183Embriyoları
manipüle etmek içinVannas Makas - Kavisli, sivri uçlu, 7 mm bıçaklarMORIAMC50Mezensefalonu çıkarmak için
Ultra İnce Forseps - Kavisli, narin, 13 cm uzunluğundaMORIA9987Meninksleri çıkarmak için
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24 kuyulu Multiwell PlakalarBD Bioscience356414
BD Falcon 12 kuyulu Hücre Kültürü Plakası, kapaklı düz tabanlıBD Bioscience353043
SuperFrost Mikroskop Slaytları, Zemin kenarları 90ºMENZEL-GL & AUML; SERAG00008032E
Hassas kapak camları kalınlığı No. 1.5H dairesel 18 mm & Oslash;MARIENFELD117580
Poliklonal Tavşan Anti-Mikrotübül İlişkili Protein 2 (MAP2) AntikoruChemicon MilliporeAB56221/200
Monoklonal Fare Anti-Glutamat Dekarboksilaz (GAD67) Antikoru, klon 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Monoklonal Sıçan Anti-Dopamin Taşıyıcı (DAT) Antikoru, klon DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Monoklonal Fare Anti-5-HT Antikoru1/8,000 - Yves Charnay'den cömert hediye (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Keçi Serumu, Yeni Zelanda OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) AntikorYaşam TeknolojileriA-315561/200
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare IgG (H+L) AntikorYaşam TeknolojileriA-110011/1.000
Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Sıçan IgG (H+L) AntikorYaşam TeknolojileriA-110071/1.000
VECTASHIELD HardSet Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıH-1400
StereomikroskopCarl Zeiss mikroskobuStemi-2000C
Bunsen Brülör FIREBOYVWR451-0136
25030123 Serisi

Kaynaklar

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Embriyonik Fare BeyniMezensefalon DiseksiyonuEnzimatik DisosyasyonMekanik Disosyasyonİmmünofloresan BoyamaTirozin HidroksilazHücre EkimlemeKültür Besiyeri
Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.