In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fenotipinin yüksek verim Deneyi Salmonella enterica Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma
Bu makalede
Özet
Özet
Salmonella türleri zoonotik patojenler ve insanlarda ve hayvancılık 1 gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen nedenidir. Salmonella host etkileşimleri altında yatan mekanizmaların anlaşılması, Salmonella enfeksiyonunun moleküler patogenezi aydınlatmak için önemlidir. Gentamisin koruma deneyi yüksek verimli tarama RAW 264.7 kemirgen makrofajlar kullanılarak konak etkileşimleri Salmonella enterica serotip Typhimurium silinmesi mutantların rolleri tanımlamak için izin uyarlanan fagositik hücrelerde Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Bu protokol uyarınca, varyansı vahşi tip ve birden çok mutant suş hem aynı kültürü çanağı içinde ve aynı anda kontrol edilebilir, çünkü ölçümler önemli ölçüde, standart bir protokole göre azalır. Çok kanallı pipetler kullanılması verimi arttırır ve hassasiyet geliştirir. Ayrıca, endişeler daha az ho kullanılmasıyla ilgili96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına ST hücreleri, ele alınmıştır. Burada, fagositik hücreler kullanılarak in vitro olarak modifiye edilmiş Salmonella yayılması deneyinin protokol başarılı bir şekilde ilişkili, invazyon ve hücre içi çoğaltma için 38 birey, Salmonella silme mutantları fenotipik için kullanılmıştır. In vitro fenotipleri bazıları, daha sonra bir hayvan modelinde in vivo fenotiplerini sahip olduğu teyit edilmiştir sunulmuştur. Böylece, modifiye, standardize edilmiş test yüksek verimli kapasiteli bakteriyel-konak etkileşimleri çalışmak için daha geniş yararlanılabilir ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik.
Giriş
Tifoya yol açmayan Salmonella tüm omurgalıların enterik hastalıkların önemli nedenleri vardır. İnsanlarda Salmonella üst bakteriyel gıda kaynaklı hastalıklar 1 arasındadır. Onların hayvan ana Salmonella etkileşimleri destekleyen moleküler mekanizmaların Karakterizasyonu başta enfeksiyon, doku kültürü ve hayvan modellerinde Salmonella enterica serotip Typhimurium (STM) arasında çalışma ile elde edilir. STM-konak etkileşimleri anlayışlar kazanıyor bize Salmonella hayatta ve ev sahibi hücre içindeki büyümeye nasıl anlamanıza yardımcı olacaktır. Bu etkileşimlerin incelenmesinde ilk sorun host ve hem de patojen mümkün olduğunca çok sayıda katılımcı faktörleri belirlemek için, ama bu çabalar büyük ölçüde, aynı anda iki bağımsız karmaşık biyolojik sistemlerle, yani host ve Salmonella uğraşan önemli zorluklar tarafından engellenirse, fizyolojik koşullar altında. Buna ek olarak, büyük repertSalmonella oire ve potansiyel konak etkileşimleri rol faktörleri kodlayan genler konakçı bu meydan mücadele yüksek verim biyolojik platformu gerektirir.
Modifiye, standardize edilmiş test olasılıkla Salmonella -host etkileşimleri çekici genlerin büyük bir set incelemek için geliştirilmiştir yüksek verimlilik kapasitesi ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Gentamisin koruma deneyi 1973 2 yılında geliştirilen, ama önce iyice 1994 yılında 3,4 Elsinghorst tarafından tarif edilmiştir. Şimdi Salmonella 5,6 olmak üzere, ex vivo birçok hücre içi bakteriyel patojenler, eğitim için standart bir araç haline gelmiştir. Içselleştirilmiş bakteriler ökaryot hücrelerin 3 nüfuz edemez Gentamisın gibi bazı antibiyotikler, tarafından öldürülüyor kaçınırım. Bu fenomenin avantajlarından yararlanarak, Gentamisin koruma deneyi hücre içi ba hayatta kalma ve büyüme ölçercterial bir patojen görülmüyordu. Enfeksiyon sırasında üç olay, yani ökaryotik hücreler, invazyon ve çoğaltma ile işbirliği içinde, enfeksiyon, Gentamisin tedavisi ve tekrar enkübe edildikten (Şekil 1) arasındaki zaman aralığına bağlı olarak hücre içi bakteriyel patojenler için değerlendirilebilir. Ökaryotik hücre hatları konak-patojen etkileşimi çalışmaları için ilgili hayvan modellerinde daha az karmaşık bir fizyolojik ortam sağlar.
Gentamisin koruma deneyi STM konakçı etkileşimleri incelemek için uygun bir platform, ama 24-yuvalı kültür kaplarına bir şekilde standart analiz düşük verimlilik kapasitesine sahiptir. In vivo veri setleri Hesaplamalı analiz yaklaşık 300 konak gen ürünlerinin (yayınlanmamış veri) ile etkileşim tahmin edilmektedir 149 Salmonella gen ürünlerini belirledi. Standart Gentamisin koruma deneyi verimli mutantlar bu sayı fenotipik kapasiteye sahip değildir.
Additiyon, Gentamisin koruma deneyi teorik hatta tek bir bakterinin işgali algılayabilir. Farklı zamanlarda tekrar geldiğinde çünkü bu doğal duyarlılık için ham veriler, teknik varyansları duyarlıdırlar. Iç kontrol ve normalleştirme sonrası göreli veri sunumu sonuçlarının anlamlı yorumlanması için gereklidir. Bu hususlar dikkate alındığında, modifiye, standardize Gentamisin koruma deneyi test kapasitesini geliştirmek ve hassasiyetini artırmak için geliştirilmiştir.
Aşağıdaki protokol, detaylı ve 96 bölümlü kültür tabaklarına ve sıçangil makrofaj hücre çizgisi RAW264.7 kullanarak değiştirilmiş Gentamisin koruma deneyi gerçekleştirmek için resimli. 24-Kaynak kültür tabağı içindeki standart bir protokole göre, değiştirilmiş bir protokol, aşağıdaki avantajlara sahiptir: 1) 96-yuvalı kültür kaplarına kullanılması yeterli istatistiksel güç dahili pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere fenotiplenebilmektedir 10 farklı mutant suşları kadar izin verir;Mutant soylar olarak aynı kültür çanağı ve aynı zamanda test edilmiştir, çünkü 2) sonuç varyans önemli ölçüde azalır; Operatör yorgunluğunu azaltırken 3) çok kanallı pipetler kullanılması verimini arttırır. Son olarak, 24-çukurlu kültür tabaklarında karşılaştırarak, 96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına daha az konak hücre kabul protokol optimizasyonu ve standardizasyonu ile ele alınmıştır.
Özetle, fagositik hücrelerde in vitro fenotip Salmonella ve diğer bakteriyel dernek, işgali ve çoğaltma değiştirilmiş, standardize edilmiş test hassasiyeti artar ve operatörün yorgunluğunu azaltırken yüksek verim kapasitesine ulaşır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Sıçangil Makrofaj Hücre Kültür RAW264.7
- Düşük geçiş sayısı sıçangil makrofaj hücreleri büyütmek,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde, T-75 hücre kültür şişesi havalandırılmış kap içinde filtre RAW264.7 (ATCC ® sayısı TIB-71) (FBS) ,% 0.5 NaHCO3 ve% 1,% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 100 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),.
- Hücreler şişe içinde bir% 60-80 izdiham ulaştığınızda, hücreler hasat için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bir hemasitometrede hücrelerin sayısı ve hücre konsantrasyonunu hesaplamak.
- Hücrelerin tekrar taze DMEM hücre kültür ortamı içinde 2.5 x 10 5 ug / ml içine hücre seyreltilmesi. 96-iyi hücre kültür plakalarının her çukuruna 5 x 10 4 hücrelerini ihtiva eden DMEM hücre kültür aracı maddesi 200 ul plaka için çok kanallı pipet kullanın.
- Her bir Salmonella soyu dört kuyu Plate. Bir dizi için üç ayrı tabak kurmakfagositik hücreler işgali testinin, sırasıyla, "dernek", "istila" ve "çoğaltma" ile işaretleyin.
- Makrofaj hücreleri kuyu altına bağlamak için izin vermek için 37 ° C de% 5 CO2 inkübatöründe tabak yerleştirin.
Salmonella Yabani-tip ve Mutantlarının 2. Hazırlık
- RAW264.7 makrofaj hücrelerinin hazırlanması için aynı günde (vahşi tip tek koloniler (WT), Salmonella enterica serotip Typhimurium 14028s, Luria-Bertani içinde DinvA mutantı DphoP bir mutantı olduğu ve arzu edilen test mutant soyunun kültür bunları almak LB) et uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. 10 mutant suşlar (DinvA mutant ve DphoP mutant sırasıyla, işgali ve hücre içi çoğaltma kusurlu olan) kadar test etmek fagositik hücreler işgali tahlillerin her kümesi kullanın.
- S, 37 ° C'de 14 saat boyunca bakteri büyütünTabanı yuvarlak bir tüp içinde gevşek bir şekilde kapatılmış, 14 ml polipropilen, 5 ml LB sıvısı içinde her 220 rpm'de Haking. LB suyu bizim durumumuzda, mutant suş en Kanamisin dirençli olan uygun antibiyotikleri içeren, 50 ug / ml
- Ertesi gün, 220 rpm'de sallama ile ilave 4 saat boyunca 1:50 oranında LB sıvılarına düz 5 ml Salmonella türlerinin kültürleri üzerinde her bir alt-kültürü.
- Bir spektrofotometre ile OD her bakteri kültürü 600 değerlerini okuyun ve her okuma Salmonella patojenite ada-1 Tip III sekresyon sistemi işgali için (SPI-1 TTSS) gen ifadesini optimize 0,6-1,2 aralığında olmalıdır.
- 1 OD formülünü kullanarak 600 = 7.5 x 10 8 CFU sonra, bakteri konsantrasyonu tahmin eden taze DMEM hücre kültür aracı maddesi içinde 5 x 10 6 CFU / ml 'lik bir konsantrasyona seyreltilmesi bakteri / ml olmuştur.
96 oyuklu bir kültür plakasına 3. Yayılması Deneyi
- Üç 96-çukurlu cel kaldırL kültür CO2 inkübatör plaka ve her bir kuyu yıkama 1x PBS tamponu içinde 200 ul bir kez.
- PBS yıkama ve tamamen çıkarılmasından sonra her bir oyuğa 200 ul bakteri DMEM ortamında (yukarıya bakınız) ekleyin. Bu enfeksiyon çokluğu ve her bir oyuğa, 20 (MOI) olarak 1 x 10 6 Salmonella hucrelerinin ile sonuçlanır: 1 arasındadır.
- Daha sonra 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe plakaları (zaman sıfır) yerine, 10 dakika boyunca mühürlü bir taşıyıcı içinde 1000 x g'de santrifüjleyin plakaları. Her suşu için, en az dört çift kuyu kurmak.
- 30 dakika sonra inkübatörden plakaları kaldırmak ve ilişkilendirilmemiş bakterileri çıkartmak için 1x 200 ul PBS ile üç kez yıkanır.
- Yıkamadan sonra, ileri tedavi için "dernek" ile etiketlenmiş plakasını kaydedin. Sipariş t "işgal" ve "çoğaltma" işaretli plakalarının her bir oyuğuna 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM ortamı içinde 200 ulo. dışı Salmonella öldürmek ek bir saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka plakaları dönün.
- , Makrofaj hücre sayısını kaydetmek için, her enfekte türünden de sakla, 10 dakika boyunca% 1 Triton X-100 içeren PBS 1x 200 ul "ilişki" levha üzerindeki kuyu kalan tedavi. Triton çözüm makrofaj hücreleri lize ve ilişkili Salmonella yayınlayacak.
- Her bir çukurdaki Hasat Salmonella ve 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine yerleştirin. Her kuyudan hasat numuneler üzerinde 900μl PBS ile üç 1 x 10 kat seri seyreltmeleri yapın, girdap her seyreltme ile gerçekleştirilir.
- Ya LB (WT) ya da LB Kan (mutantlar) plakalar üzerinde üçüncü seyreltme, 10 -3, Plate. Uygun Salmonella cinsi adı, seyreltme numarası, zaman noktasında ve tarih ile plakaları etiketleyin.
- Üçüncü sulandırma tüp vorteks sonra, agar ve tekrar f yüzeyine 10 ul örnek dağıtım5 damla toplam için kez. Beş 10 ul Petri plakalar 7 üzerine eşit düşer alana emin olun.
- Damla sonra agar plakaları üzerinde emmek edecek ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübatör bir gece boyunca inkübe edilir.
- 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ihtiva eden 150 ul 1xPBS ile makrofaj sayımı için kayıtlı kuyu tedavi edin.
- Tripsinizasyondan sonra, 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine yer makrofajlar ve tripsin / EDTA çözeltisi nötralize etmek için FBS 50 ul ile tedavi% 0.4 tripan mavisi ile hücrelerin leke ve hemasitometre aracılığıyla puan.
- Bir saat inkübasyon geçtiğinde, CO 2 inkübatör "işgali" ve "çoğaltma" plakaları kaldırmak ve "Adım 3.4" de her yıkayın.
- "Adım 3,6-3,12" gibi başka tedavi için "işgal" plakasını kaydedin.
- 10 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM ortamı içinde 200 ul"çoğaltma" plaka ortamda dışı Salmonella boşluğu korumak için. Ilave 22.5 saat daha% 5 CO2 kuluçka 37 ° C, plaka dönün.
- Ertesi gün, 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör "çoğaltma" plaka kaldırmak ve her yıkama sıra "Adım 3.4" ve "Adım 3,6-3,12" olarak davranın.
- Son olarak, 37 ° C inkübatör içinde bir gece boyunca inkübasyondan sonra agar plakaları kaldırmak ve bakteri kolonilerinin sayısı tam.
- İyi bir koloni dağıtım koloniler, 10 ile 100, her spot yaklaşık 2 koloni 20, belli bir yerde fazla 20 koloni olsaydı skor zor olurdu içerir olmalıdır. Gerektiğinde sayısı çok düşük veya çok yüksek ise, ile örnek Replate yüksek veya daha düşük seyreltileri 10 kat.
4. Veri Analizi
- Kaplama dayalı her plakanın CFU (bir ml için koloni oluşturma birimleri) hesaplanırhacmi ve seyreltme faktörü.
- Her cinsten gelen kaydedilmiş makrofaj hücre sayımı yoluyla, her makrofaga Salmonella sayısını teyit edin.
- Sırasıyla hücre dernek, istila veya replikasyonu için, en az üç bağımsız deneyden makrofaj başına CFU, geometrik ortalamaları hesaplanır, ve göreli değer için WT daha normalleştirmek.
- WT her zorlanma karşılaştırarak, sırasıyla Student t-testi ile dernek, işgali ve çoğaltma için verileri analiz ve p-değeri ile istatistiksel anlamlılık belirler.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Veriler, değiştirilmiş fagositik hücre yayılması deneyinin göre çizilir sonra temsili sonuçlar (Şekil 2) bakınız. Veri çoğaltma 8 kusurlu olduğu bilinen beş farklı suşları, WT ΔinvA, ΔphoP mutant A ve yayılma açısından kusurlu olduğu bilinen mutant B Δ INVA, ve ΔphoP arasında, deney geçerliliğini değerlendirmek için pozitif kontrol olarak kullanılır . Gerçekten de, değiştirilmiş istila deneyinde, bir mutan ΔinvA RAW264.7 hücreleri tarafından içselleştirilir...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Gentamisin koruma deneyi yaygın konakçı hücre içinde hücre içi bakteriyel patojenler işgali ve çoğaltma incelemek için kullanılır ve özellikle kimin işgali enfeksiyonu 1 kurulması için önkoşul adımdır Salmonella gibi patojenlerin eğitim için önemli bir biyolojik aracıdır. Salmonella araştırma camiasında standart Gentamisin koruma deneyi 24-kuyu kültür çanak 5 uygulanmaktadır. 48 ya da 96 oyuklu plakaların kullanımı, yüksek verimlilik kapasitesi 9 daha önce tartışılmış o...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.
Teşekkürler
Bu proje (AJB ve LGA, R01 AI076246 için) Sağlık NIAID National Institutes için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir. Salmonella mutant koleksiyonu kısmen Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (MM için, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 ve R01 AI039557-11 AI075093-01) HKP, R21 kısmen Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, (tarafından desteklenen AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Biz kopya kaplama ve koleksiyonunda mutantlar teyit için Steffen Prowollik teşekkür ederim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) | Yaşam Teknolojileri | 11965 | |
| Fetal sığır serumu | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Hücre kültürü şişesi havalandırmalı filtre kapağı | Nest Biyoteknoloji | 708003 | |
| 100x Esansiyel Olmayan Amino Asitler | Yaşam Teknolojileri | 11140 | |
| 96 oyuklu Hücre kültürü plakası | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) et suyu | MP Biyomedikaller | 3002-075 | |
| 14 ml Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Boru | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Yaşam Teknolojileri | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamisin çözüm | Sigma | K0254 | |
| Gentamisin çözeltisi | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Yaşam Teknolojileri | 25200 | |
| Tripan mavisi | Sigma | T8154 |
Kaynaklar
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869(2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
