Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Summary

Burada, varsayılan hücre adezyon moleküllerinin içsel yapışkan özelliklerini karakterize etmek için basit, hızlı bir yöntem sunuyoruz. Bir hücre adezyon molekülünün salgılanan, epitop etiketli ektodomaini, kültür ortamından küçük, düzgün işlevselleştirilmiş boncuklar üzerinde yakalanır. Bu boncuklar daha sonra basit boncuk agregasyon testlerinde hemen kullanılabilir.

Abstract

Hücre-hücre yapışması çok-hücreli yaşam için esas olduğunu ve hücre yüzeyi proteinlerinin çeşitli bir dizi aracılık eder. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu için yapışma etkileşimlerini tam olarak anlaşılamamıştır. Burada farazi homofilik hücre yapışma moleküllerinin yapışkanlık özelliklerini karakterize etmek için basit ve hızlı bir yöntem sunuyoruz. Kültürlenmiş HEK293 hücreleri DNA plazmid, bir hücre yüzeyi proteini, salgılanan, epitop takılı ekto sahası kodlayan yapılarla transfekte edilir. Epitop takısı için spesifik işlevselleştirilmiş boncuk kullanılarak, çözünür, salgılanan füzyon proteini kültür ortamından tespit edilir. Kaplı boncuklar, homofilik yapışma test etmek üzere deneyler sıralama boncuk agregasyonu deneylerinde ya da floresan boncuğu direkt olarak kullanılabilir. Eğer arzu edilirse, o zaman mutagenez yapışması için gerekli olan özel amino asitleri ya da etki aydınlatmak için kullanılabilir. Bu deney, stabil hücre hatlarının üretilmesini gerektirmez, ifade edilen proteinin sadece küçük miktarlarda gerektirir ve acco edilebilir4 gün içinde mplished.

Introduction

Hücre-hücre yapışma çok hücreli organizmaların gelişimi ve bütünlüğü için gerekli olan ve hücre yüzeyi zengin bir molekül dizisi aracılık eder. Birçok tespit edilmesi gerekmektedir, bu da yapışma moleküllerinin çoğu, tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. Çeşitli yöntemler, atomik kuvvet mikroskopisi ve yüzey kuvvet spektroskopisi ^9-12 gibi hücre sıralama deneyleri, hücre toplama deneyleri ^1-8 ve biyofiziksel yöntemler dahil olmak üzere, hücre yapışma moleküllerinin özellikleri (CAMlar) araştırmak için kullanılır.

Da hücre dizileri kullanılarak in vitro sistemlerde basitleştirilmiş karmaşıklığı zor bir varsayımsal CAM yapışkanlık özelliklerini belirlemek için yapar. Tipik olarak, bir molekül, bir yapışkan olmayan hücre hattı içine geçirildiğinde, hücre birikmesinin sebep olursa CAM olarak kabul edilir. Ancak, bu yapışkan etkinliğinin doğrudan bir kanıt olmadığı açıktır. Örneğin, bir hücre yüzeyi dengesini ve çıkışını kolaylaştırmakTAT aynı zamanda, artmış hücre toplanmasının ^1,13 ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, gerçek bir TAT hücre çizgisi, hücre yüzeyi gönderilmesi veya stabilizasyonu için gerekli diğer ko-faktörlerini sahip olmayan hücre toplanmasını aracılık başarısız olabilir.

Bu komplike faktörleri önlemek için, fikrine dayanır daha doğrudan tahlilleri kullanılabilecektir yapışma etkileşimlerini hücre dışı bir alanındaki bir içsel özelliği biyokimyasal olmalıdır. Boncuklar, Ng-CAM, başlangıçta ² karakterize etmek için kullanıldı ise de, bu deneyler, kaderin-aracılı adhezyon ^12,14,15 araştırmak amacıyla genişletilmiştir. C-kaderin ekto-Fc füzyon füzyonlarının kullanarak, çok sayıda laboratuar Gumbiner kadherin tekrarlar etkileşimleri ¹⁴ homofilik katkıda bulunduğunu göstermiştir. Drosophila 'dan gelen protocadherins ^1,15-18 ve Dscam izoformlarının bir dizi gibi benzer topuk kısmı agregasyon analizleri, E-kadherin ve N-kadherin yapışma kullanılması da, ^12,15 karakterize edilmiştir ^19. Burada farazi homofilik kamları (Şekil 1), salgılanan, epitop ektoalanlarının yapışma aktivitesini karakterize etmek için nispeten basit ve hızlı bir deneyi tarif eder. Biz öncelikle kaderin süperailesinin üyelerini karakterize bu tahlili kullandık.

Protocol

1. Hücre Hazırlanması (Gün 0 -2)

1. Bölünmüş HEK293 hücreleri: 1 -% 80 konfluent (2-3 gün) ve% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak 5 60 kadar,% 5 _CO2 37 ° C'de büyüme ortamı içinde inkübe edilir. Her durum için, 2 x 100 mm'lik tabaklar içerisinde kültürü hücreleri.

2. Hücre transfeksiyonu (Gün 1)

1. Bu Lipofectamine gibi bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak plazmid kodlayan Fc füzyonu ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri. Benzer transfeksiyon verimliliği neden alternatif yöntemleri de kullanılabilir.
2. 24 saat boyunca kuluçka transfekte hücreleri dönün.

3. Hücre Yayılma (Gün 2)

1. 37 ° C'ye kadar Cenin Sığır Serumu (-FBS olmadan) ön ısıtma Büyüme Ortamı.
2. Tabaklar 10 mi Büyüme Ortamı -FBS ile 2x durulayın ve 1 saat boyunca 37 ° C inkübatör bulaşıkları döner.
3. 3 yıkamadan toplam, 10 mL büyüme ortamında -FBS ile kültürler yemekler bir kez daha çalkalayın.
4. Incuasitleme ortam toplama önce FBS'siz diğer bir 48 saat boyunca 37 ° C 'de transfekte edilmiş HEK293 hücreleri.

4. Boncuk Toplama (Gün 4)

1. Kültür kaplarından ortamı toplamak için, hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 5 dakika boyunca 500 x g'de 50 ml konik tüp ve hızlı yemekler her biri bir medya transferi.
2. 30 ml şırınga ve 0.45 mikron şırınga filtre kullanarak bir santrifüj filtre içine 50 ml konik tüp filtre medya.
3. Konsantre kültür ortamı hacmi yaklaşık 500 ul (yaklaşık 15 dakika) kadar 4000 x g ve 4 ° C'de santrifüj filtresi Spin. Tüm kültür ortamı ilave edildi ve konsantre edildi edilene kadar yineleyin.
4. Bir mıknatıs üzerinde buz her bir numune için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü Bağlama Tamponu soğuk, yer 1 ml Protein G, manyetik boncuk 1.5 ul tampon ve çıkartın. Hemen Protein G, manyetik boncuklar, konsantre kültür ortamı eklenir.
5. 2 saat boyunca 4 ° C'de tüpler döndürün.
6. Plbir mıknatıs üzerinde ace tüpleri ve ortamı çıkarın. Çabuk buz ile iki kez Bağlama Buffer 1 ml boncuk yıkayın ve sonra Bağlama Tamponu 300 ul boncuklar tekrar süspansiyon.
7. Bölünmüş 2 boru, her bir tüpe 150 ul boncuk halinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve daha sonra sırasıyla, "kalsiyum" ve "Kalsiyum" koşulları için 200 mM _CaCl2 ya da 200 mM EDTA, 1.5 ul ekleyin.
8. Bir depresyon Transfer her durumda 100 ul iyi kaydırın ve iletilen ışık mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak mikrograflannı toplamak. İstenen her bir zaman noktasında her bir deney için 5 bakış alanları görüntü toplayın.

5. Veri Analizi

1. ImageJ veya karşılaştırılabilir görüntü analiz yazılımı, Dosya açılan menüden İthalat / Görüntü Sırasını ... kullanarak beş görüntü veri setleri açık birini kullanma. Bu bir görüntü yığını olarak açılacaktır.
2. Görüntü / Özellikler ... iletişim kutusunda, i değiştirmek1.0 piksel ve set Piksel Genişlik ve Piksel Yükseklik büyücü birimleri.
3. Görüntü açılan menüde ayarlayın / Eşiği ... komutunu kullanarak ikili görüntüleri dönüştürmek. Boncuk veya boncuk agrega katkıda pikselleri dahil etmek eşiğini ayarlamak, ama o arka plan ve küçük parçacıkları hariç. Yığınının tüm resimlere uygulayın.
4. Set Ölçümler iletişim kutusunda, Alan ve Stack Pozisyon onay kutularını.
5. Açılan menüyü analiz içinde ... Parçacıklar analiz çalıştırın. Bu onların büyüklüğü (alanı) ve bunların tespit edildiği görüntü dahil tespit parçacıkların bir listesini oluşturacaktır.
6. Deney ve deneysel koşul için bu işlemi tekrarlayın.

Results

Bir örnek deney Fc (NcadEC-Fc) bağlı olarak N-kaderin-ekto-saha ile kalsiyuma bağlı boncuk toplanmasını gösterir, Şekil 2, sunulmuştur. Kalsiyum yokluğunda, taneler bir araya çok az veya hiç bir eğilim göstermedikleri ve zaman (Şekil 1A, C), olan, toplam ebadında bir artış vardır. Kalsiyum varlığında, tanecikler toplam miktarı zaman (Şekil 1B, C) ​​üzerinde giderek artan NcadEC-Fc göstermek sağlam birleştirilmesi ile kaplanmıştır. Bu deney, beş örtüşmeyen alanlardan gör...

Discussion

Hücre yapışması, çok hücreli yaşamının önemli bir özelliğidir ve hücre yüzey proteinleri, geniş bir dizi aracılık eder. Bunlardan, ayrıntılı, yapışkan özellikleri sadece nispeten küçük bir kısmı için anlaşılır. Burada, uygun bir epitop ucuna birleştirilen bir salgılanan ektoalanlarının homofilik yapışkanlı araştırmak için basit, hızlı bir protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, önemli avantajlara sahiptir. Amaçla yeterli miktarlarda protein, 100 mm'lik tabaklar geçici transfeksiyonu ile elde edilebilir Üretim, stabil ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFc-N1 plazmid	Addgene	To to submitted
HEK293 hücreleri	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10.000 U/ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-122
%0.05 Tripsin-EDTA	Yaşam Teknolojileri	25300054
Lipofectamine 2000	Yaşam Teknolojileri	11668030
Dynabeads – Protein G	Yaşam Teknolojileri	10003D
Sığır Serumu Albümin	Sigma	A3294
Depresyon slaytları	Elektron Mikroskobu Bilimleri	71878-06
Amicon Ultra-15 Ultracel-10 membranlı Santrifüj Filtre Ünitesi	Millipore	UFC901024
0.45 mm şırınga filtresi	Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Mıknatıs Yaşam	Teknolojileri	12321D
Fiji (ImageJ) Görüntü Analiz Yazılımı	http://fiji.sc/Fiji
Tamponlar/Çözeltiler
Tablosu Büyüme Ortamı	DMEM +% 10 FBS + Pen-Strep	Filtresi sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
Büyüme Medyası – FBS	DMEM + Pen-Strep	Filtresi sterilize edilir ve 4 ° C'de saklanır.
Bağlayıcı Tampon	50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, %0.2 BSA	Vorteks çözünene kadar buz üzerinde tutun.