Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Özet

Burada, varsayılan hücre adezyon moleküllerinin içsel yapışkan özelliklerini karakterize etmek için basit, hızlı bir yöntem sunuyoruz. Bir hücre adezyon molekülünün salgılanan, epitop etiketli ektodomaini, kültür ortamından küçük, düzgün işlevselleştirilmiş boncuklar üzerinde yakalanır. Bu boncuklar daha sonra basit boncuk agregasyon testlerinde hemen kullanılabilir.

Özet

Hücre-hücre yapışması çok-hücreli yaşam için esas olduğunu ve hücre yüzeyi proteinlerinin çeşitli bir dizi aracılık eder. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu için yapışma etkileşimlerini tam olarak anlaşılamamıştır. Burada farazi homofilik hücre yapışma moleküllerinin yapışkanlık özelliklerini karakterize etmek için basit ve hızlı bir yöntem sunuyoruz. Kültürlenmiş HEK293 hücreleri DNA plazmid, bir hücre yüzeyi proteini, salgılanan, epitop takılı ekto sahası kodlayan yapılarla transfekte edilir. Epitop takısı için spesifik işlevselleştirilmiş boncuk kullanılarak, çözünür, salgılanan füzyon proteini kültür ortamından tespit edilir. Kaplı boncuklar, homofilik yapışma test etmek üzere deneyler sıralama boncuk agregasyonu deneylerinde ya da floresan boncuğu direkt olarak kullanılabilir. Eğer arzu edilirse, o zaman mutagenez yapışması için gerekli olan özel amino asitleri ya da etki aydınlatmak için kullanılabilir. Bu deney, stabil hücre hatlarının üretilmesini gerektirmez, ifade edilen proteinin sadece küçük miktarlarda gerektirir ve acco edilebilir4 gün içinde mplished.

Giriş

Hücre-hücre yapışma çok hücreli organizmaların gelişimi ve bütünlüğü için gerekli olan ve hücre yüzeyi zengin bir molekül dizisi aracılık eder. Birçok tespit edilmesi gerekmektedir, bu da yapışma moleküllerinin çoğu, tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. Çeşitli yöntemler, atomik kuvvet mikroskopisi ve yüzey kuvvet spektroskopisi ^9-12 gibi hücre sıralama deneyleri, hücre toplama deneyleri ^1-8 ve biyofiziksel yöntemler dahil olmak üzere, hücre yapışma moleküllerinin özellikleri (CAMlar) araştırmak için kullanılır.

Da hücre dizileri kullanılarak in vitro sistemlerde basitleştirilmiş karmaşıklığı zor bir varsa....

Protokol

1. Hücre Hazırlanması (Gün 0 -2)

1. Bölünmüş HEK293 hücreleri: 1 -% 80 konfluent (2-3 gün) ve% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak 5 60 kadar,% 5 _CO2 37 ° C'de büyüme ortamı içinde inkübe edilir. Her durum için, 2 x 100 mm'lik tabaklar içerisinde kültürü hücreleri.

2. Hücre transfeksiyonu (Gün 1)

1. Bu Lipofectamine gibi bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak plazmid kodlayan Fc füzyonu ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri. Benzer transfeksiyon verimliliği neden alternatif yöntemleri de kullanılabilir.
2. 24 saat boyunca kuluçka transfekte hücreleri dönün.

Sonuçlar

Bir örnek deney Fc (NcadEC-Fc) bağlı olarak N-kaderin-ekto-saha ile kalsiyuma bağlı boncuk toplanmasını gösterir, Şekil 2, sunulmuştur. Kalsiyum yokluğunda, taneler bir araya çok az veya hiç bir eğilim göstermedikleri ve zaman (Şekil 1A, C), olan, toplam ebadında bir artış vardır. Kalsiyum varlığında, tanecikler toplam miktarı zaman (Şekil 1B, C) ​​üzerinde giderek artan NcadEC-Fc göstermek sağlam birleştirilmesi ile kaplanmıştır. Bu deney, beş örtüşmeyen alanlardan gör.......

Tartışma

Hücre yapışması, çok hücreli yaşamının önemli bir özelliğidir ve hücre yüzey proteinleri, geniş bir dizi aracılık eder. Bunlardan, ayrıntılı, yapışkan özellikleri sadece nispeten küçük bir kısmı için anlaşılır. Burada, uygun bir epitop ucuna birleştirilen bir salgılanan ektoalanlarının homofilik yapışkanlı araştırmak için basit, hızlı bir protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, önemli avantajlara sahiptir. Amaçla yeterli miktarlarda protein, 100 mm'lik tabaklar geçici transfeksiyonu ile elde edilebilir Üretim, stabil .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
pFc-N1 plazmid	Addgene	To to submitted
HEK293 hücreleri	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10.000 U/ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-122
%0.05 Tripsin-EDTA	Yaşam Teknolojileri	25300054
Lipofectamine 2000	Yaşam Teknolojileri	11668030
Dynabeads – Protein G	Yaşam Teknolojileri	10003D
Sığır Serumu Albümin	Sigma	A3294
Depresyon slaytları	Elektron Mikroskobu Bilimleri	71878-06
Amicon Ultra-15 Ultracel-10 membranlı Santrifüj Filtre Ünitesi	Millipore	UFC901024
0.45 mm şırınga filtresi	Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Mıknatıs Yaşam	Teknolojileri	12321D
Fiji (ImageJ) Görüntü Analiz Yazılımı	http://fiji.sc/Fiji
Tamponlar/Çözeltiler
Tablosu Büyüme Ortamı	DMEM +% 10 FBS + Pen-Strep	Filtresi sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
Büyüme Medyası – FBS	DMEM + Pen-Strep	Filtresi sterilize edilir ve 4 ° C'de saklanır.
Bağlayıcı Tampon	50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, %0.2 BSA	Vorteks çözünene kadar buz üzerinde tutun.