Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat

13.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51789

⸱

7 Ağustos 2014

 ,  ,  ,  , 
1Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, George Mason University, 2Ceres Nanosciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bazı patolojik biyobelirteçler, biyolojik sıvılardaki düşük konsantrasyonları, parçalayıcı enzimlerin varlığı ve büyük miktarlarda yüksek moleküler ağırlıklı proteinler nedeniyle mevcut tekniklerle kolayca tespit edilememektedir. Kimyasal olarak işlevselleştirilmiş hidrojel nanopartiküller, daha önce tespit edilemeyen biyobelirteçlerin tespit edilmesini sağlayan düşük bolluktaki proteinleri toplayabilir, koruyabilir ve konsantre edebilir.

Özet

Roman biyomarkör keşif daha duyarlı ve özgül hastalık tespiti sağlayan çok önemli bir rol oynar. Biyolojik sıvılarda mevcut Ne yazık ki çok düşük miktardaki biyolojik göstergeler kolayca kütle spektrometrisi ya da çok düşük bir konsantrasyonda mevcut olan değişken ve çoğu zaman, albümin veya immünoglobülin gibi proteinler, yüksek miktardaki maskelendiğinden, çünkü bağışıklık ile tespit edilemez. Bait içeren poli (N-izopropil akrilamid) (Nipam) göre nanopartiküller bu fizyolojik engelleri aşmak mümkün. Bir adım olarak onlar yakalama konsantre ve vücut sıvılarından biyomarkerları korumak mümkündür. Düşük molekül ağırlıklı analitler nanopartikül çekirdeğini girip daha yüksek bir afiniteye proteini yemler etki gösteren farklı organik kimyasal boyalar tarafından yakalanır. Nanopartiküller büyüklükte birkaç emir tarafından ilgi proteinlerin konsantre edebiliyoruz. Bu konsantrasyon faktörü proteinleri içindedir böylece protein seviyesini yükseltmek için yeterlidirGeçerli Massenspektrometer, batı lekeleme ve immunoassay'lerin saptama sınırı. Nanopartiküller biyolojik sıvıların bir bolluk ile inkübe edilebilir ve albümin ve diğer yüksek molekül ağırlıklı proteinler hariç ederken, büyük ölçüde düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptidlerin konsantrasyonu arttırmakta edebiliyoruz. Bizim veriler, belirli bir analit konsantrasyonunun 10,000 kez amplifikasyon önceden belirlenemeyen biyolojik işaretleri tespit etmek için kütle spektrometrisi ve immün sağlayarak elde edilebileceğini göstermektedir.

Giriş

Insan genomu dizileme tamamlanmasına rağmen, önemli ilerlemeler erken evre hastalığın öngörü belirlenmesi biyomarkerlerindeki yapılmamıştır, ya da tedavi sonucu veya prognoz 1 ile ilişkilidir. Bu ilerleme olmaması için bir nedeni olarak birçok potansiyel önemli belirteçler konvansiyonel kütle spektrometresi ve diğer biyobelirteç keşif platformlarda saptama sınırının altında bir konsantrasyonda mevcut olduğunu. Kütle spektrometrisi (MS) ve çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM), tipik olarak, bir algılama hassasiyeti daha büyük olan 50 ng / ml olarak ise 50 pg / ml ve 10 ng / ml arasında değişen bir klinik laboratuar düşme ile ölçülen bağışıklık analitlerin çoğunluğu . Bu, özellikle bir hastalığın erken evrede pek biyomarkırlar, geleneksel MS ve MRM 2 ile tespit edilemez anlamına gelir. Ayrıca bu gibi kompleks biyolojik sıvılarda albümin ve immunoglobülin gibi yüksek bolluk proteinlerin varlığı genellikle milyar kat exc ile maskeesini düşük miktardaki, düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler 3, 4. bu nedenle birçok örnek hazırlık adımları kütle spektrometrisi sekanslama ve kimlik önce gerekmektedir. Bu gibi bir hazırlık aşaması ticari olarak temin edilebilen tükenme sütunlar 5-8, yüksek miktardaki proteinlerin tükenmesi kullanmaktadır. Genellikle kovalent olmayan bir şekilde kaldırılmakta olan taşıyıcı proteinler ile ilişkili olduğundan, ne yazık ki, bu adım aday biyobelirteç verim azalmaya yol açar. Örnekler toplandığı bir zamanlar başka bir meydan aday biyomarkerların ex-vivo stabilitesi ile temsil edilmektedir. Proteinler, endojen veya eksojen proteazlar 9 ile degradasyona tabi tutulur. Bozulması 10-13 protein korurken hidrojel nanopartiküller, tahlilin aralığı içinde bir düzeye farazi biyolojik işaretleyici konsantrasyonunu yükselterek bu kritik zorlukları aşmak olabilir.

Bu th dikkat etmek önemlidirLMW, kanda proteinlerin küçük sağlam proteinler ile birlikte, bu büyük proteinlerin parçalarının bir karışımı bulunmaktadır. 60 kDa'dan daha büyük bir Doku türevli proteinler pasif vasküler bazal zar boyunca kan akışına girmesine kadar büyük, ancak peptidler veya protein parçacıkları 14 kanın temsil edilebilir. Amacımız Hastalığın erken teşhisi, tedavisi için hasta tabakalaşma ve tedaviye yanıtın izlenmesinde için aday olabilir roman dolaşan biyomarkerları ölçmektir. Bizim nanopartiküller anda küçük proteinler ve peptidler yakalama ve başlangıç ​​hacmine göre 100 kat kadar onları konsantre olurken seçici, yüksek bolluk immünoglobinlerin ve albumin dışlamak için oluşturulur.

Bizim grup başarıyla proteinler ve peptidler için yüksek afinite moleküler yemler hareket edebilen küçük organik boyaların bir dizi tanımlanır. Protein boya bağlama bağlı olarak, hidrofobik ve elektrostatik etkileşimin bir kombinasyonu olduğu düşünülmektedirs. Boya üzerindeki aromatik halkalar protein yüzey 11 ile hidrofobik cepleri proteinleri ile dönüşümlü olarak çalışır.

Yemler, kimyalarına bağlı olarak seçilmiş analitlerin sınıfları için özel bir çekim gücü gösterirler. Yemler proteinler veya peptidlere, örneğin albumin gibi, taşıyıcı proteinler ile rekabet eder. Düşük molekül ağırlıklı proteinler / peptidler parçacık içinde sıkışır. , Albümin ve immunoglobülin gibi yüksek molekül ağırlıklı proteinler nedeniyle hidrojel 11 (Şekil 1) yer alan sınırlayıcı gözenek çünkü eleme yeteneğinin parçacık girmesini engellenir.

Hidrojel nanopartiküller amonyum persülfat 11 tarafından başlatılan çöktürme polimerizasyonu ile sentezlenir. N-izopropil (Nipam), akrilik asit (AAC) ve alilamin (AA) ve çapraz bağlayıcı, N, N'-metilenbisakrilamid (BIS) eş-monomerler arasında 1 seyreltik koşullar içinde, 6 saat boyunca 70 ° C'de reaksiyona girmesine imkan verilir1, 13. Poli yüksek protein bağlanma afinitesi (N-izopropil akrilamid-ko-akrilik asit) kovalent (amino içeren boya maddelerinin katılmasıyla, yani., Sulfonatedanthraquinonetriazine boyalar) nanopartiküllerin içine yoluyla elde (poli (Nipam-ko-AAC) nanoparticlesis Boyaların hidrofobik / hidrofilik özelliklere bağlı olarak, sulu ya da organik çözücü maddelerin içinde, bir amidasyon reaksiyonu 11, bir anthraquinonetriazine boyanın klorür atomu ile nanopartikül amin grubuna ait 13. nükleofilik ikamesi, boya ihtiva eden poli (Nipam oluşturmak için kullanılmaktadır CO-allilamin) (AA) 11 12 nanoparçacıklar. iki aşamalı polimerizasyon işlemi vinilsülfonik asit (VSA), 11, 13, bir dış kabuk içeren hidrojel nano-tanecikleri oluşturmak için kullanılır.

Hidrojel nanopartiküller, tam kan, plazma, serum, serebrospinal sıvı, ter ve idrar dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sıvılar, uygulanabilir. Bir adım olarak, çözelti içinde, nanoparticles (birkaç dakika içinde) hızlı bir haciz ve düşük moleküler ağırlığa sahip konsantrasyonu, 10, 11, 13, 15-18 analitlerini gerçekleştirin. Proteinler daha sonra kullanılarak nanopartiküller yıkanır ve tespit edilir batı spektrometrisi 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 kütle, 19-21 lekeleme, 23, bağışıklık / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​ya da ters faz, protein mikro-dizi 16 24 deneyleri. Nanopartiküller, kimyasal yem ile fonksiyonalize ve bir çekirdek ya da çekirdek-kabuk mimari, yakalama sunulması ve yem / kabuk fizikokimyasal özelliklerine göre proteinlerin konsantrasyonu. Nanopartiküller dahil farklı boyaların bu nedenle boya afinitesi göre verimlilik, çözeltinin pH değeri ve yüksek miktardaki proteinlerin 13 rakip varlığını / yokluğunu değişen proteinlerin, farklı alt çekecektir. Bundan başka, çözeltinin hacmi ile ilgili olarak nanopartiküllerin miktarı nanopartiküller gelen protein verimi etkileyecektir. Bu yönleriHidrojel nanoparçacık hasat Yüksek miktarda protein içeren plazma numuneleri hasat proteinleri için üç farklı nanopartikül yemler kullanılarak gösterilebilir, ve tipik olarak yüksek miktarda protein içermeyen idrar örnekleri vardır. Bu protokolde, hasat ve poli (Nipam-ko-AAC), Poli (Nipam / boya) ve çekirdek-kabuk nano-tanecikleri kullanılarak plazma numuneleri, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa) konsantre göstermektedir (Poli (Nipam-ko-VSA)) . Poli (Nipam / boya) nanopartiküller Mycobacterium tuberculosis ile enfekte bireyler taklit insan idrar örneklerinde eklendi Mycobacterium türleri antijeni, konsantre gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan plazma ve idrar George Mason Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylanan protokollerde aşağıdaki, bilgilendirilmiş yazılı onayı ile, sağlıklı gönüllü vericilerden toplanmıştır. Bağışçılar eşit ayrı ayrı analiz edildi 25 ve 42. Numune yaş arası Kafkas kadınlar ve erkekler arasında dağıtılmış ve havuza değil.

Serum veya Plazma Örneklerinin 1. Nanoparçacık İşleme

Plazma potansiyel biyo-düşük miktarda hidrojel nanopartiküller ile, çözelti içinde yakalanır. Tanecikleri, yıkandı, santrifüj ile ayrılmış plazma kuluçkaya yatırılır, ilave edilir ve çekilen proteinleri elüte edilir. Elüsyona tâbi tutulmuş proteinler alt-kütle spektrometrisi sekanslama ve tanımlanması için azot akışı altında kurutulur.

  1. Mikrosantrifüj tüp içinde 50 mM TrisHCI pH 7 (500 ul serum + 500 ul TrisHCI) 2: serumun 1 500 ul sulandırmak.
  2. 500 mcL poli (Nipam / AAc) çekirdek nanop Eklemakaleler. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Sabit açılı rotor ile donatılmış bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın.
  4. Topağa 500 ul sodyum tiyosiyanat (25 mM) eklenir. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse.
  5. Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın.
  6. Nanopartikül pelet MiliQ suyu içinde 500 ul ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse.
  7. Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın.
  8. Taze elüsyon tamponu hazırlayın: temiz bir tüp içinde 300 ul amonyum hidroksite ul asetonitril 700 ekleyin. Dikkat: Amonyum hidroksit aşındırıcı olduğunu. Uygun havalandırma ile kullanın. Not: Yıkama tamponu, preparatif olmalıdırared kullanımdan hemen önce. Elüsyon tamponu tutmayın.
  9. Nanopartikül pelet elüsyon tamponunun 300 ul ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  10. Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve temiz, etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpü içinde eluatın kaydedin.
  11. 1.10 - Tekrar 1.9 adımları. Bir mikrosantrifüj tüpe iki elüsyonların birleştirin.
  12. 8 (Şekil 2F) ayarlanmış hava akışı ile, 42.1 ° C 'de bir azot evaporatör manifoldunun, azot akışı altında sıvı kısımlar kurutun.
  13. O / N depolama için oda sıcaklığında kurutuldu eluatın saklayın, ya da uzun süreli depolama için -20 ° C, kütle spektrometresi, Western blotting, ELISA tahlilleri ya da (isteğe bağlı) öncesinde.

İdrar Örneklerinin 2. Nanoparçacık İşleme

Normal idrar az 30 mg / dl protein içerir ve1+ kandan daha az. Ancak, birçok hastalık / durumlar idrar protein ve normal kan seviyelerini değiştirebilir. Idrar örneği eklemek için nanopartiküllerin uygun hacminin belirlenmesinde yardımcı olmak için, bir idrar toplama nanopartikül önce gerçekleştirilir. İdrar biyolojik göstergeler idrar hacmi nanopartiküllerin oranını optimize gerektirebilir son derece düşük konsantrasyonlarda mevcut olabilir. Bu işlem alt Western blot analizi için idrar örnekleri nanopartikül hasat tarif etmektedir.

  1. Temiz, kuru bir plastik kap içinde idrar örnekleri toplamak. Bir 22 ml minimum hacim gereklidir. Analiz için hazır olana kadar mağazası idrar -80 ° C'de numune.
  2. Oda sıcaklığında ya da 4 ° de CO / N, dondurulmuş idrar çözülme. , Bir girdaplı karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırılır. 50 ml'lik konik tabanlı polipropilen tüp içine idrar en az 22 ml dökün.
  3. 15 dakika boyunca 3700 x g'de dışarı salınan bir rotora sahip bir santrifüj içinde idrar dönerler. Temiz bir 50 ml'lik konik tabanlı polypr içine pelet bozmadan, idrar süzünopylene tüpü. Pelet atın.
  4. Bir multi-analit "idrar testi" reaktif şerit kullanarak idrar tahlili gerçekleştirin. Not: Doğrudan güneş ışığı ve nem 17, 18 uzak bir sıkıca kapalı bir kapta reaktif şeritler saklayın.
    1. Temiz, kuru bir kağıt havlu üzerine reaktif şerit, yüz-up, yatıyordu.
    2. Adım 2.3 hazırlanan idrar 1 ml aspire bir pipet kullanın.
    3. 2 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ama başlamayın. Reaktif şerit her test pad üzerinde idrar 2 damla - Çabuk 1 dağıtın. Hemen sayacını başlatmak. Not: idrar konteyner doğrudan reaktif şerit batırmayın. Ayıraç şerit boya / kimyasal göstergeler potansiyel idrar kabına ayıraç şeridinin dışına yapışabilen.
    4. Reaktif şerit konteyner üzerindeki zamanda, karşılık gelen renk kodlu indica tek tek reaktif şeritlerin renk karşılaştırılarak bir ayıraç çubuğu üzerindeki çeşitli analitler için niteliksel neticelerin kayıtReaktif kabın üzerine monte edin. Tipik normal idrar Sonuçlar şu şekildedir: (normal veya negatif), kan, protein, lökosit, nitrit, glukoz, keton, bilirubin ve Ürobilinojen tayini için; İdrar pH (5,5-7,0); özgül ağırlığı (1,001-1,020). Not: Bir idrar örneğinde yüksek protein seviyelerinin nanopartiküller bağlanma alanlarında ilgilenilen protein ile rekabet edebilir. Nanopartiküller protein hasat üst düzeye çıkarmak için, nanopartikül hacim / hacim oranında idrar yüksek bolluk proteinlerinden ya da sınır rekabete ayarlanabilir ya da çok düşük konsantrasyonlarda mevcut proteinlerin toplanması için optimize edilebilir. Idrar protein değeri 1+ veya daha fazla ise, aşağıdaki adımda 2,5 nanopartiküllerinin 2x hacimlerini ekleyin. Ilgilenilen analit çok düşük bir miktarda bir protein ise, 2 ml (Şekil 3) 'e kadar nanopartiküllerin hacmini artırmak için gerekli olabilir.
  5. Aktarım, temiz 50 ml'lik konik tabanlı polipropilen tüp içine adım 2.3 açıklık idrar 20 mi. Yapamazidrar tüpün alt olabilecek herhangi bir artık / pelet rahatsız. 20 ml idrar numunesi ile nanopartiküller 200 ul ilave edin. , Bir girdaplı karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırılır. Idrar protein değeri 1+ veya daha fazla ise, 20 mi idrara nanopartiküllerinin 400 ul ekleyin: edin.
  6. Sallanan / karıştırma olmadan, oda sıcaklığında 30 dakika için idrar / nanopartikül karışımı inkübe edin.
  7. 10 dakika boyunca 3700 x g'de dışarı salınan bir rotor ile donatılmış bir santrifüjde idrar / nanoparçacık süspansiyon dönerler. Not: pelet görünür ardından santrifüj değilse, ek bir 2 için örnekler dönmeye -, 7 dakika.
  8. Çıkarın ve süpernatant atın. Nanopartikül pelet 500 ul, MilliQ su ekleyin.
  9. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne nanopartikül çözeltisini.
  10. 10 dakika boyunca 16.100 x g'de sabit açılı rotor ile donatılmış bir santrifüj içinde nano-tanecikleri dönerler. Not: pelet görünür vr değilse7 dakika - santrifüj iyice silinir, ek bir 2 için örnekler döndürün.
  11. Çıkarın ve süpernatant atın.
  12. Tekrar nanopartiküller yıkamak için 200 ul 18 MilliQ su ile (iki kez) 2.8 ve 2.11 adımları.
  13. Taze elüsyon tamponu hazırlayın: temiz bir tüp içinde 30 ul amonyum hidroksite ul asetonitril 970 ekleyin. Dikkat: Amonyum hidroksit aşındırıcı olduğunu. Uygun havalandırma ile kullanın. Not: Yıkama tamponu, kullanılmadan hemen önce hazırlanmış olmalıdır. Elüsyon tamponu tutmayın.
  14. Nanopartikül pelet 20 ul yıkama tamponu ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  15. 10 dakika boyunca 16.100 x g'de nanopartikül örnekleri dönerler. Çıkarın ve temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü süpernatant kaydedin. Nanoparçacık pelet bozmayan. Biohazard çöpe pelet atın.
  16. Bir kimyasal davlumbaz rafa örnekleri yerleştirin. Kapaklar açın ve inc30 dakika boyunca oda sıcaklığında Ubate. (- 1, 2 saat) Alternatif olarak, kuru hale gelinceye kadar 40 ° C'de azot akışı altında örnekleri yer.
  17. Örnekler 15 ul Tris-glisin SDS numune tamponu (2x) ekleyin. Isı 100 ° C'de Açık veya boru içinde kalan hacme kadar kapakları 5 dakika boyunca kuru ısı bloğu, ° C olarak en fazla 20 ul'dir. Not: Bir kaynar su banyosu kullanmayın. Su banyosu nem tampon buharlaşmasını engeller.
  18. Borular üzerinde kapağını yerleştirin. Isı bloğu tüpleri çıkarın. Numune -80 ° C'de saklandı veya alt Western blot analizi için hemen kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hidrojel Nanoparçacık Boyutu ve tekdüzeliği

Poli (Nipam-AAC) partikülleri ile kümeler içinde son derece yüksek verim ve üretkenlik ile üretilmiştir. Parçacıklar yakalama, depolama ve proteinlerin elüsyonu (en az 48 saat) için gerekli olan süre boyunca, oda sıcaklığında çok iyi bir stabiliteye sahip kolloidal ve nano partiküler çökeltme (Şekil 1) 11 gözlenmemiştir. Koloidal stabilite nanopartiküller ile hızlı bir şekilde, protein / peptid alımı içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Klinik Uygunluk

Bir serum ya da plazma numunesi, bir bütün olarak organizmanın durumu ile ilgili bilgiler için zengin bir kaynak temin edebilmektedir proteinler ve peptidler, dolaşımdaki düşük bol miktarda içerir düşünülmektedir. Serum proteomik söze rağmen, klinik yarar 10, 11, 16, 25 biyomarkır keşif ve çeviri thwarting üç temel ve ciddi fizyolojik engeller vardır.

1. Önemli teşhis biyomarkerler kanda çok düşük bulunan (konsantrasyon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Benjamin Espina, bu Makalede kullanılan reaktifleri üreten Ceres Nanosciences, Inc.'in bir çalışanıdır. Lance Liotta, Alessandra Luchini ve Virginia Espina, bu Makalede kullanılan nanopartikül teknolojisine ilişkin patentlere (ABD patenti 7,935,518 ve/veya 8,497,137) sahiptir. Üniversite çalışanları olarak, üniversite politikası uyarınca bu patentlerden telif hakkı alma hakkına sahiptirler. Lance Liotta ve Alessandra Luchini, Ceres Nanosciences'ın hissedarlarıdır ve Bilimsel Danışma Kurulu'nda görev yapmaktadır.

Teşekkürler

Nazik Şekil 5'te gösterilen veri toplama ve analizi ile destekli Michael Henry, Dublin City University,. Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) George Mason Üniversitesi, (2) İtalya / ABD çerçevesinde İtalyan IstitutoSuperiore di Sanita ' ABD Sağlık Bakanlığı ve İnsan Hizmetleri, George Mason Üniversitesi ve Halk Sağlığı İtalyan Bakanlığı, (3) NIH, IMAT programı hibe 1R21CA137706-01 ve LAL için 1R33CA173359-01, ve (4) Ceres Nanobilimler, Inc arasında işbirliği anlaşması .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

4
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hidrojel nanopartiküllerCeres NanoscienceCS003NanoTrap ESP parçacıkları
18 MΩ-cm suTip 1 reaktif sınıfı su
Tris HCl, 50 mM pH 7.0VWRIC81611650 mM, pH 7
AsetonitrilBDHBDH1103-4LPBDH'den temin edilebilir
BDH3014VWR'den temin edilebilir, %28-30 NH < sub>3< / sub>
Sodyum tiyosiyanat 25 mMAcros Organics419675000Serum / plazma örnekleri için
Çoklu analit İdrar Reaktif ŞeritleriSiemens2161İdrar örnekleri için
Tris-Glisin SDS Numune Tamponu (2X)Life TechnologiesLC2676SDS'nin çökelmesini
önlemek için RT'de kullanınKuru banyo inkübatörü (100 oC) ısıtma blokluBarnstead11-715-125DQKaynar su banyosu yerine kullanmayın
Azot evaporatör manifolduOrganomasyon OrtaklarıMicrovap118Serum/plazma örnekleri için
Santrifüj, açılır rotorSorvallLegend serisi50 ml tüp kapasitesi, rcf 3.700 x g
Santrifüj, sabit açılı rotorEppendorf54241.7 ml mikrosantrifüj kapasitesi, RCF 16.000 x g
50 ml konik santrifüj ve nbsp; tüplerFisher Scientific14-432-22İdrar örnekleri için vidalı kapaklı
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleriEppendorf22363204
Vorteks karıştırıcıFisher Scientific50-949-755
ZamanlayıcıFisher ScientificS04782Saniye/dakika
VWR Amonyum Hidroksit NHOH

Kaynaklar

  1. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  2. Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
  3. Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
  4. Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
  5. Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
  6. Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
  7. Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
  8. Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
  9. Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
  10. Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
  11. Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
  12. Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
  13. Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
  14. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  15. Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
  16. Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763(2009).
  17. Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
  18. Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
  19. Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  20. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264(2007).
  22. Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
  23. Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
  24. Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
  25. Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
  26. Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
  27. Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
  28. Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
  29. Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
  30. Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
  31. Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
  32. Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
  33. Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
  34. Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
  35. Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hidrojel Nanopartik llerBiyobelirte TespitiProtein KonsantrasyonuSantrif jle Ay rmaWestern BlottingK tle SpektrometrisiEl syon TamponuNanopartik l Y kama
Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.