Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz. Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Bilimsel gelişmeler hızlanarak ile, yeni yöntemler hızlı ve kolay fare beyninin gen ifadesini işlemek için deneysel nörobilim için gereklidir. Burada ilk yenidoğan fare beyninin içine viral olarak kodlanmış Transgenlerin doğrudan intrakranial teslimat için Passini ve Wolfe tarafından tanıtılan bir tekniği açıklar. En temel formunda, prosedür sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga gerektirir. Bununla birlikte, aynı zamanda, iletişim kuralı tekniğe yeni araştırmacı tutarlılığını arttırmak için sterotaksik çerçeveler ile birlikte kullanılmak üzere adapte edilebilir. Bir yöntem olup, astarlama ependim hala doğumdan sonraki ilk 12-24 saat içinde ise olgunlaşmamış beyin parankimasma içine serebral ventriküller serbestçe hareket adeno-ilişkili virüs (AAV) de yeteneklerine bağlıdır. Beyin boyunca nöronların yaygın iletiminde bu yaş sonuçlara AAV'nin intraventriküler enjeksiyonu. İfade enjeksiyon gün içinde başlar ve lifetim için devamhayvan örn. Viral titresi floresan proteini ko-ekspresyonu kalıt aktarımlı hücrelerin önemli bir etiket sağlar iken, transduse nöronların yoğunluğunu kontrol etmek için ayarlanabilir. Hem off-the-raf, ambalajlı reaktifler ve özel viral hazırlanmasını sağlamak viral çekirdek tesislerin yükselen durumu ile, bu yaklaşım, hızlı, kolay ve çok daha az pahalı fare beyninin gen ifadesini değiştirmek için bir zamanında bir yöntem sunuyor Geleneksel germlıne mühendislik daha.
Giriş
Nöral gen ifadesini değiştirerek geleneksel yöntemler zaman alıcı ve pahalı germlıne manipülasyonlar gerektirir. De novo Alternatif hızlı sonuçlar ve daha az maliyetlidir fakat karmaşık cerrahi müdahale 1-3 gerektiren bir dezavantajına sahip utero elektroporasyon veya steryotaksik Lentiviral enjeksiyon gibi yaklaşımlar. Ayrıca, transgen ifade bu yöntemler ile sınırlı mekansal yelpazesine sahiptir. Burada, neonatal fare beyin adeno-ilişkili virüs (AAV) intraventriküler enjeksiyon ile yaygın nöronal manipülasyon için bir hızlı, kolay ve ekonomik bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem ilk olarak, AAV, bu olgunlaşmamış epe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürleri ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları Sağlık Rehberi National Institutes göre hayvanlarla ilgili protokolleri gerçekleştirin. Burada anlatılan prosedürleri gözden ve Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Baylor College tarafından kabul edildi.
Kemirgen beyin transgen için replikasyon-yetersiz adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri Biyo güvenlik seviyesi 1 kullanım için onaylanmıştır. Uygun koruma ve virüs kullanım prosedürleri ile ilgili özel gereksinimler detayları "Mikrobiyoloji ve Biyomedikal Laboratuvarları (BMBL) Biyogüvenlik" ABD Hükümeti yayın için CDC web sitesine bakın. Virüslerin kullanıldığı i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Başarılı ventrikül içi enjeksiyon, viral verimleri ve yaygın nöronal sağlam ifade. Burada YFP veya tavuk beta aktin promoteri (CBA promotör) kontrolü altında tdTomato floresan genler kullanılarak viral transdüksiyon değerlendirildi. Bu yapılar AAV8 içine paketlenmiş ve neonatal (P0) ICR fındık fareleri lateral ventriküllere enjekte edildi. Yüksek virüs titerleri (hemisfer başına 10 10 parçacıklar) (sol, Şekil 1A) yoğun bir koku ampul etiketleme, striatum, serebral korteks, hipokamp ve beyinci.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yenidoğan fare beyin yaygın dağıtımı için bir araç olarak kullanılarak AAV nöronal gen ekspresyonunu kontrol etmek için bir çok yönlü bir prosedür tarif edilmiştir. Böyle utero elektroporasyon 1 veya sterotaksik intrakranial enjeksiyon 2,3 olarak nöronal transgenesis diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, yenidoğan viral enjeksiyon nispeten kolay ve basittir. Temel prosedür, sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga ile birkaç dakika içinde yapılabilir. Optimal sağkalım ve transgen ifade bir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Bu araştırma, Robert A. ve Rene E. Belfer Aile Vakfı, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Vakfı Alzheimer Hastalığı araştırma hibesi A2010097 (JLJ) ve NIA Yaşlanma Biyolojisi Eğitimi hibesi T32 AG000183 (SDG desteği) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ICR soylu fareler | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | Bu suş aynı zamanda CD-1 |
| FVB olarak da bilinir Akraba | fareler Jackson Laboratuvarı | 1800 | 5-6 haftalık |
| Nestlets | Laboratuvar Kaynağı | NESTLETS | |
| Çoban kulübeleri | Laboratuvar Kaynağı | SS-fare | |
| Yüksek yağlı kemirgen yemeği | Purina Mills | PicoLab Fare diyeti 20, #5058 | Bu bizim standart damızlık yemimiz |
| Yüksek yağlı kemirgen yemi (alternatif) | Harlan Laboratories | Teklad Global %19 proteinli kemirgen diyeti #2019S | Fitoöstrojen düşükse otoklavlanabilir diyet gereklidir |
| Enjeksiyon şırıngası | Hamilton | 7653-01 | 10 ml şırınga |
| Enjeksiyon iğneleri | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375 " | 32 G, standart P0 enjeksiyonları için |
| Metal plaka kriyoanestezi | McMaster Carr | 8975K439 | Ham alüminyum levha, 6 "x 12", 0.25" kalınlığında, 3 eşit parçaya kesilmesi ve kenarların yerel makine atölyesi tarafından zımparalanması gerekecektir |
| Dijital okumalı küçük hayvan stereotaksik cihaz | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| İğne destek ayağı ile üniversal şırınga tutucu | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Yenidoğan çerçevesi | Stoelting | 51625 | Resmi olarak fare ve yenidoğan sıçan adaptörü olarak adlandırılır |
| Steril göstergeli biyolojik tehlike imha torbaları | VWR | 14220-030 | Önemli! – Enstitünüzü öğrenmek için yerel veterinerlik ve çevre güvenliği personeline danışın' Biyolojik Tehlikeli Atık Bertarafı için S Protokolü |
Kaynaklar
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of g....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
