Bir İn Vitro Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

Summary

Globoid hücreler, şu anda etkili bir uzun süreli tedavisi olmayan bir lökodistrofi olan Krabbe hastalığının tanımlayıcı bir patolojik özelliğidir. Aktive edilmiş mikrogliaların doğuştan gelen biyolojisini ve patojenik potansiyelini ve bunların globoid hücrelere dönüşümünü incelemek için bir hücre kültürü modeli geliştirdik.

Abstract

Globoid hücre lökodistrofi (GLD) merkezi sinir sisteminde benzersiz bol miktarda globoid hücreler olarak adlandırılan, çok-çekirdekli mikroglia işlevi tam, açık değildir. Bilginin bu boşluk çalışma için bir in vitro model uygun olmaması ile engellenmiştir. Bu yazıda, bir ilköğretim kemirgen glial kültür sistemi açıklanmaktadır GLD bulunan karakteristik globoid hücrelerini andıran mikroglianın multinükleasyon içinde psychosine sonuçları ile hangi tedavi olarak. Bu roman sistemi kullanarak, biz globoid hücrelerin çalışması için koşulları ve analiz modları tanımlanır. Bu model sisteminin potansiyel kullanım matriks metalloproteinaz (MMP) için potansiyel bir rol tespit önceki çalışmamızda, geçerliliği -3 GLD içinde. Vitro sistemde bu yeni bu eşsiz hücrelerin oluşumu ve işlevi, hem de potansiyel tedavi edici işleme, çalışılacak yararlı bir model olabilir.

Introduction

Ayrıca, Krabbe hastalığı olarak da bilinir globoid hücre lökodistrofi (MP), galatocerebrosidase (galc) geni ¹ mutasyonlar işlev kaybı olmasından kaynaklanan öldürücü bir demiyeline eden bir hastalıktır. GLD en yaygın şekli, erken çocukluk döneminde başlayan verebiliriz ve genellikle yaş ^2,3 beş yaşından önce motor ve erken ölüme yol açan bilişsel gerileme agresif bir klinik seyri ile karakterizedir infantil çeşididir. Genetik test GLD ⁴ tanısını doğrulamak için kullanılır. GLD Nöropatoloji globoid hücreler ^5-7 adlandırılan yaygın demiyelinasyon, nöronal atrofi, ve astrogliyozun tıkanmış çok çekirdekli mikroglia varlığını ortaya koymaktadır. Bu göze çarpan hücrelerinin spesifik işlevi belirsiz kalmıştır rağmen bunların sitoplazmalarında tubulous inklüzyonları içeren globoid hücrelerin tanımlanması, son 97 yıldır GLD belirleyici bir özelliğidir.

Olmayan MYEL katılımlarıGLD patogenezinde bertaraf eder glial (mikroglia ve astrositler) bu kadar uzun süre hastalık ⁸ derin demiyelinasyon ikincil yanıt olarak kabul edilmiştir. İlginçtir, 1916 ⁵ Knud Krabbe tarafından yapılan bu hastalığın ilk açıklama, adını almış lipit enkaz içeren çok çekirdekli fagositlerin bildirdi oluşumu 'hücreleri GLOBOID' ve bu hastalığın belirleyici bir özelliği vardır.

GLD rollerini uzun ihmal edilmiş olsa Globoid hücreleri, GLD patoloji damgasını özelliğidir. İlginç bir şekilde, bu hücreler GLD CNS dokusunun bir erken karakteristik değişikliklere arasındadır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle çok çekirdekli fagositler, diğer hastalıklar olarak adlandırılan dev hücrelerin oluşumu, tipik olarak, bir ilk patojenik itici gücü ⁹ daha patoloji sonucu olarak kabul edilir olduğu varsayımına olabilir. Bu nedenle, WHI tarafından mekanizmasını araştıran az sayıda çalışma vardırkanal globoid hücreleri özellikle GLD CNS'de, fagositoz oluşturulur. Bu raporda açıklanan prosedür CNS'de globoid hücre formasyonunun önemi ve fagositik aktivite daha yüksek seviyede sergilediği in vitro mikroglia ve bu hücrelerin bu psychosine kaynaklı multinükleasyon önceki gösteri odaklanmaktadır. Bu gözlemlerle tutarlı olarak, titrek beyinlerinde globoid fagositik hücreleri sıklıkla yüksek düzeyde aktivite gösteren, PAS pozitif kalıntı içermektedir. Globoid hücreler de ferritin için immünopozitif bulunmuştur (Mikroglia işaretleyici) ^10, KP-1 / CD68 (bir monosit işaretleyici), ve biraz da vimentin için pozitif (bir ara filament proteini ve astrositlerde işaretleyici ve aktif mikroglia) ^11, HLA DRA (MHC II bir yüzey reseptörü) ve TNF-α ⁷ ve IBA-1 ¹² (mikroglia tanımlamak için kullanılan bir kalsiyum bağlayıcı protein). Belirteçlerin bu koleksiyon dayanarak, globoid hücreleri geliştirmek mikrogliada kaynaklananeşsiz bir fenotip.

Onların teklik rağmen, belirli bir işlevi ve GLD patogeneze GClerin katkısı büyük ölçüde gözardı edilmiştir. Globoid hücreleri kronik bir demyelinizasyon ikincil sonucu olarak düşünülmektedir. Ancak, GLD beyaz cevher patoloji globoid hücrelerin zamansal ilişkiyi ele geçmiş çalışmaların erken doğum sonrası dönemlere geç embriyonik içinde globoid hücrelerin varlığını tespit ettik; olgodendrosit apoptoz ve aleni demiyelinizasyonu ¹³ önceki kez. Böylece gld içinde nöropatolojinin gelişme zamansal dizisi globoid hücreleri bu hastalığın ¹⁴ demyelinasyon önceden oluşturulmuş olduğunu göstermektedir. Bu GLD içinde globoid hücrelerin erken oluşumu olgodendrosit hasar ¹⁵ ikincil reaktif tepki yerine tanımlayan bir patojenik olayı temsil edebilir bizim hipoteze. Ayrıca, GLD mikrogliyal aktivite düzensizliği facto bir kabul edilmiştirR, bu hastalığın tedavi edilmesi için ¹⁶ hematopeotic kök hücre tedavilerinin uzun vadeli etkisini azaltır. Böylece, psychosine yanıt hücresel fonksiyonları ve mikroglianın düzenleme ve globoid hücreleri, soruşturma GLD patogenezinde yeni anlayışlar sağlaması bekleniyor.

Yakın zamana kadar, globoid hücre oluşumunu incelemek için uygun bir modelin eksikliği kesin fonksiyonu ve GLD patolojiye bu hücrelerin katkı anlayış olamadı. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, bu globoid benzeri hücreler gld biriken patojenik toksin lipit psychosine doğrudan tepki olarak oluşturulabilir olduğu belirlenmiştir. O mikroglia değil, ancak makrofajlar, aktive edilmiş ve ¹⁵ psychosine karşılık olarak birincil kültürde globoid glial hücrelere transforme edilir. Globoid hücrelere Bu dönüşüm, hücre dışı proteaz, matris metaloproteinaz (MMP) -3 ¹⁵ aracılık ettiği bulunmuştur. Daha yakın zamanlarda,Bu in vitro model sisteminde geliştirilen psychosine-aktif mikroglia ve globoid hücreler genişletilmiş ve bu bulguları belirledikten oligodendrosit ve oligodendrosit projenitör hücreler için potansiyel olarak toksik değildir. Bu nedenle, GLD, psychosine ve bu hastalıkta mikroglia için, ortaya çıkan ilk ve muhtemelen patojenik bir rol destekleyecektir demiyelinasyon önce globoid hücrelerinin oluşumunun erken birikimi bağlamında dikkati çekmektedir.

Biz bu hastalığın anlaşılmasına katkıda bulunacaktır GLD patogenezi hakkında yeni bilgiler ortaya çıkacaktır globoid hücresi oluşumu bu çalışmayı öneriyorum. Dahası, GLD bu yeni hücresel modelin yeni tedavi yaklaşımları, bu hastalığın patolojik değişiklikler test edilebilir hitap hangi yeni bir biçimi sağlayabilir. Bu nedenle, bu raporda non-myelinating glia primer kültürlerinde psychosine kaynaklı globoid hücrelerinin in vitro olarak geliştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Protocol

Hayvanları ile ilgili tüm prosedürler Insancıl Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin Politikasına uygun olarak yapıldı Laboratuvarı Hayvan Refahı Dairesi (NIH) tarafından ve yalnızca Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı ile belirlenen Connecticut Sağlık Merkezi.

Karışık Glial Kültürler 1. Hazırlık

1. Kullanmadan önce tüm aletleri sterilize edin. Soğuk muhafaza etmek için buz üzerinde muhafaza üç steril, 60 mm Petri tabaklarına (Mg ^{2 +} ya da ^Ca +2) herhangi bir katyonları içeren buz soğukluğunda steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 3 ml ilave edilir.
2. Daha önce ^17,18 açıklandığı gibi, doğum sonrası P0-P2 fare yavrularından korteks izole eder.
   NOT: Hipokampuslardan gibi subkortikal yapıları, bu kültürlerde dahil değildir.
3. Bir pı kullanarak, dikkatlice meninksler kaldırmak ve daha sonra taze HBSS'nin için izole korteks aktarmak ve enzimatik dokuları ayırmaküreticinin protokolüne uygun olarak ural doku diseksiyon kiti.
4. Plaka steril, T-175 şişeleri içine hücre ve ortam içinde bir gece boyunca inkübe [Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı 1 x penisilin / streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu ile (FCS) (FBS)].
5. Taze medya ile ertesi gün tüm medyayı değiştirin. Yaklaşık 3 hafta süreyle veya bir hücresel mono-katman kurulana kadar, normal ortam değişiklikleri ile kültürleri inkübe devam edin.
   Not: 1 oranında ^19: Bu tek-katmanın, yaklaşık 10, astrositler ve mikroglia oluşacaktır.

Karışık Glial Kültürlerde 2. Globoid Hücre İndüksiyon

1. ECM-kaplı lamelleri hazırlayın.
   1. 30 dakika boyunca Steril bir Petri tabağında steril 1 N hidroklorik asit (HCI) olan dairesel lamelleri ıslatın. Steril su 3x lamelleri yıkayın ve sonra en az 20 dakika boyunca% 95 EtOH içinde bekletin. ve sonra hava kurumaya bırakın.
   2. Sulandırılmış dışı MATR Yeri damlacıklarıParafilm bir levha üzerine ix (ECM), protein bir kaplama maddesi (ml steril fosfat tampon çözeltisi içinde çözüldü, laminin 10 ug / örneğin, 150-250 ul / damlacık [PBS]). Bu damlacıklar üzerine yerleştirildiğinde lamelleri dokunmaz böylece damlacıkların dağıtın. Yavaşça forseps kullanarak bir damlacık üzerine her kurutulur lamel yerleştirin.
   3. Yaklaşık damlacıklarının lamelleri bırakın. Kanat ile kültürü kaputu içinde 4-6 saat kapalı.
   4. 24 oyuklu plakanın oyuklarından her ECM içine kaplı lamelleri (ECM ile kaplanmış tarafı) yerleştirin. Steril PBS içinde 3 kat ile de her bir yıkama, ve gerekli olana kadar, 4 ° C'de tutun.
2. Lameller üzerine Kaplama için Glial hücreler hazırlanıyor.
   1. Glial kültürlerden ortamı aspire ve yavaşça steril, 10 ml PBS ile glial tek tabaka 3 kez yıkayın. Ardından, T-175 8-10 ml tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle inkübe edin.
   2. Tek tabaka en ayrıldıktan sonra, tam bir ortamda 20 ml ekleyinşişeye tripsinizasyon durdurun. 50 ml'lik konik bir tüp içine müstakil hücreleri ihtiva eden ortam toplayın ve oda sıcaklığında 300 x g'de 10 dakika boyunca dönerler.
   3. Yavaşça P1000 pipeti kullanılarak çözeltisinin pipetlenmesiyle taze tam ortam, 2 ml hücrelerin yeniden askıya daha sonra pelet bozmadan süpernatanı havalandırın, ve.
   4. Istenen yoğunluğa (ör: 10 ⁵ hücre / ml) tam ortam içinde hücrelerin askıya ve sonra tekrar bir hemositometre kullanılarak hücre sayısını belirlemek. ECM ile kaplanmış lamelleri (24 oyuklu plakanın her oyuğuna örneğin 500 ul) üzerine hücreleri Plate. 37 ° C'de inkübasyon her bir göze, 3-5 gün boyunca ek taze tamamlanmış ortam ekleyin, ya da hücrelerin istenilen görsel ortak akışa kadar büyümeye kadar.
3. Psychosine ile tedavi.
   1. Bir stok konsantrasyonu dimetil sülfoksit (108,3 mM) içerir (DMSO) psychosine sulandırın. Bir çalışma stoğu elde etmek üzere% 100 EtOH içinde bu stokunu çıkarabilenn, 10 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ilave edilebilir.
   2. Psychosine eklenmesi zamanda, kültür ortamı içine yavaşça psychosine karıştırmak için kültür plakası girdap. Bir hafta boyunca 10 uM her gün eşdeğer ekleyerek psychosine Ek.
4. Psychosine tedaviden 7 gün sonra, ortam ve her kuyuya, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA) pipetle 500 ul toplamak. 20 dakika sonra, hücrelerin tespit edilmeleri için oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha sonra, her bir göze, PBS ile yıkayın ve 3x (aşağıya bakınız) İmmünositokimya için işlenene kadar 4 ° C'de plakalar tutun.
   Not: istenirse hücre kültür ortamı, bu noktada enzimatik ya da ELISA tahlili için toplanabilir.

3. İmmünositokimya (ICC) Globoid Hücreleri Visualize'a

1. Buffer [PBS +% 0.3 Tween-20 +% 5 normal keçi serumu (NGS)] bloke PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat için kuluçkalayın.
2. InIBA-1 karşı yapılan ilk antisera olarak sabit hücreler cubate [(1: 1000) PBS içinde seyreltilmiş + 0.3 +% 2 NGS% Tween-20], oda sıcaklığında en az 1 saat, daha sonra, PBS ile 5 dakika 3x, her oyuğa yıkama / yıkayın.
3. Çekirdekleri tespit etmek: 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI 1000, 1) sahip antikor etiketleme ve karşı leke birincil tanımlamak için uygun bir ikincil floresan-konjuge antikor ekleyin. Oda sıcaklığında 1 st için bir ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe ve PBS ile 5 dakika 3x ile yıkayın.
4. Bir montaj orta kullanarak slaytlar mikroskop her coverglass monte edin. Görsel ve kantitatif analizler için bir floresan mikroskop gör slaytlar.

4. Analiz ve İlköğretim Kültür Globoid Hücrelerinin Karakterizasyonu

1. Kültüründe globoid hücreyi tanımlamak için aşağıdaki üç morfolojik kriterleri kullanın:
   1. , Mikrogliyal işaretleyici için immünopozitif etiketleme tarafından İba-1 + floresan mikroskobu kullanarak globoid hücreleri tanımlayın.
   2. Belirlemek-çekirdekli (örneğin iki ya da daha DAPI pozitif çekirdeklerin) halinde globoid hücreleri.
   3. Mikroglial hücrelerinde dinlenme yüksek ölçüde dallanmış görünümünü farklı yuvarlak bir morfolojisi ile globoid hücrelerin belirlenmesi.
      Not: Hücreler, aynı zamanda bu kültürlerden akış sitometrisi ile hücre yüzey markör analizi ve miktar tayini için toplanabilir.
2. Mikroglia ve globoid hücrelerinin fagositik aktivasyonunu ölçülmesi
   1. Psychosine ile muamele mikroglia fagositik aktivitesini değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak kuyu FITC ile işaretlenmiş lateks boncuk ekleyin. Önceden PFA ile tespit için flüoresan konjuge edilmiş lateks boncukları 48 saat ekleyin. (3. bölümde açıklandığı gibi) immünsitokimya (2.4 bölümde belirtildiği gibi) boncuklarla işlenmiş hücreleri, ve süreç Fix.
   2. Bunlar fluorofor etiketli boncukların floresan emisyon spektrumlarına örtüşmeyen böylece fluorofor-konjuge sekonder antikor seçin.
   3. AnalyzE Bu hücrelerin belirlenmesi ile IBA-1 + mikroglia phagocytotic profilleri floresan etiketli boncuklar ile birlikte lokalize.
      NOT: Psychosine mikroglianın aktive edecektir. Fagosite boncuk bu kültür ortamında mononükleer ve çok çekirdekli İba-1 + hücreleri içinde tespit edilecektir.

Saf Mikroglial KÜLTÜRLERİNDEN Globoid Hücreleri 5. İndüksiyon

Not: astrosit ve mikroglia arasında hücreler arası sinyal deşifre alternatif bir yolu, in vitro globoid hücre modelinin bir diğer avantajdır. Aşağıdaki adımlardan (Bölüm 5.2) de tarif edildiği gibi ya da ko-şarjı kültür için ana mikroglial hücrelerinin saflaştırılması, kültür içerisinde daha düşük bir yapışma özelliği elde edilebilir.

1. 50 mL konik tüp içine birleşik karışık kültürlerden glial ortamı toplayın ve inkübatör içinde 37 ° C'de korumak.
2. İlköğretim Karışık Glial KÜLTÜRLERİNDEN Mikroglial İzolasyon.
   1. Konfluent karışık kültür glial T175 şişesi ortamı çıkarılmasından sonra, [+ 25 mM 4-(2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 25 mM + sodyum bikarbonat (Sigma) ile tam bir ortam maddelerini kapsayan] sıcak çalkalama ortamı eklenir. 100 rpm'de (37 ° C) bir yörüngesel karıştırıcıda 3-4 saat boyunca çalkalama. 50 ml konik tüpler içine bu sarsıldı matara medyayı toplayın.
      NOT: Bu ortam şişelerden daha az yapışık mikroglianın içerecektir.
   2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de ortamı Spin. Astrosit-işlemi görmüş ortam 2 ml hücrelerin yeniden askıya sonra süpernatan aspire ve (adım 5.1 toplanmıştır).
   3. Bir hemasitometre kullanarak ve daha sonra alt-tabaka ile kaplanmış kapak slipleri üzerine mikroglial hücreleri plaka elde edilen hücre sayısını belirlemek için imünosito kimyasal olarak (bakınız bölüm 2.1), ya da diğer hücre tipleri ile ko-kültür için globoid hücre gelecek toplanması için, ultra yapışma gözlü levhalar üzerine plaka, Böyle oligodendrositlerin gibi (azalan olarak) Aşağıdaki bölümde ribed.
      NOT: Bir kez mikroglia (2.3 bölümü) yukarıda tarif edildiği gibi psychosine (10 uM) ile muamele edilebilir kaplama.
3. Sitotoksisite Analizi için birincil oligodendrositler ile aynı kültür.
   Not: Primer oligodendrosit kültürleri, veya oligodendrosit progenitör hücreler üzerine takip eden ko-kültür için düşük yapışkan plakalardan psychosine ile muamele edilmiş mikroglia toplanması, bu in vitro globoid benzeri hücrelerin sitotoksik potansiyel işlevini incelemek için kullanılabilir.
   1. Kurulmuş yöntemleri ^18,20 kullanılarak primer oligodendrositlerin kültürlerini geliştirme. Psychosine ile muamele mikroglia toplamak için, hafifçe kuyu altından gevşek bir biçimde bulunan hücreler ayırmak için pipetleyin. 10 dakika boyunca 300 x g'de, santrifüj hücreleri toplamak, ve daha sonra dikkatli bir şekilde, Neuro temelli ortam oluşan oligodendrosit farklılaşma medya [tekrar süspansiyon, L-glutamin (1x), B-27 ek (1x) ve triiyodotironin (T 3, 10 ng / ml )].
   2. Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını ve daha sonra yaklaşık 1 ile sonuçlanır, 1 x 10 ⁵ hücre / ml oligodendrosit bir kültüre mikroglia tohum: 2 mikroglia / oligodendrosit oranı. En fazla 3 gün boyunca ko-kültür olarak inkübe edin.
   3. Immünsitokimya hücreleri saptamak (bölüm 2.4). ELISA için hücre kültürü ortamı toplayın ya da gerektiği gibi kimyasal analizler.

Results

Bu protokol, yazılı olarak, bitirmek (: Deneysel Akışı Şeması Bkz: Şekil 1) baştan tamamlamak için yaklaşık 36 gün sürmesi bekleniyor. Bu, birincil kültür sisteminde 'globoid benzeri' hücrelerin gelişimi, güvenilir ve tekrarlanabilir bir nitelikte olduğu deneyim olmuştur: psychosine yanıt olarak çok çekirdekli hücrelerinin oluşumu sürekli tedaviden 7 gün ile görülmektedir.

Büyük bir tespit edilmesine olanak verecektir nükleer karşı-boya ile bağlantılı olarak IBA-1 kullanılar...

Discussion

Burada tarif edilen protokol geliştirilmesi ve aktif mikroglia ve globoid hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu incelemek için olan yeni bir model sistemi sağlar. Im ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir HEK293 hücre hattı kullanılarak globoid hücre oluşumu ²¹ çalışma için mevcut protokol geliştirilmesi için bir şablon sağladı. Bu modelde elde edilen hücreler globoid GLD tanımlanabilir doğal globoid hücrelerden farklı olduğuna işaret etmek de önemlidir. GLD yılında globoid hücreler sıklıkla 10 ç...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank' katyon içermeyen dengeli tuz çözeltisi (HBSS) (Mg2+ ve Ca2+).	Yaşam teknolojileri	14175-095
Nöral Doku Ayrışma Kiti	Miltenyi	130-092-628
40 & # 956; m hücre süzgeci	Fisherbrand	22363547
Hank' katyonlar (Mg2+ ve Ca2+) içeren dengeli tuz çözeltisi (HBSS).	Gibco	14025-092
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)	Gibco	11995-065
fetal sığır serumu (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penisilin/Streptomisin	Yaşam teknolojileri	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Tripsin-EDTA çözeltisi	Yaşam teknolojileri	25299-056
Psikosin	Sigma	P9256
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehit (PFA)	Elektron Mikroskobu Bilimi	19208
Normal Keçi Serumu (NGS)	İnvitrojen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor konjuge antisera	Yaşam Teknolojileri	Çeşitli
Montaj Ortamları	Southern Biotech	OB100-01
Fagositik Test Kiti	Cayman Kimyasalları	500290
HEPES	Sigma	BP310-500