Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Özet

Ca ^{2 +} sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda ²⁺ sinyaller.

Özet

Gelişimsel ve çevresel ipuçları ca bitki hücrelerinde ²⁺ dalgalanmaları. Stimulus özgü mekânsal-zamansal Ca ^{2 +} desenler ^Ca +2 sinyal kaskadlarını başlatmak hücresel ^Ca +2 bağlayıcı proteinler tarafından algılanır. Ancak, biz yine de belirli Ca ^{2 +} sinyalleri üretilir uyaran nasıl hakkında biraz biliyorum. Ca ^{2 +} sinyalinin özgünlüğü belirli bir uyarana cevap Ca ^{2 +} kanalları ve / veya taşıyıcıların faaliyetlerinin sofistike regülasyonuna bağlı olabilir. Bu hücresel bileşenlerini belirlemek ve onların işlevlerini anlamak için, doku ve hücresel düzeydeki Ca ^{2 +} sinyalleri hassas ve sağlam kayıt izin sistemleri kullanmak çok önemlidir. Farklı hücre bölmeleri hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri hücresel Ca ^{2 +} sinyalleri canlı hücre konfokal görüntüleme için bir platform sağladı. Burada talimat tarifİki Ca ^{2 +} algılama sistemlerinin kullanımı için s: FAS (film yapıştırıcı fidanları) ışıldama Ca ^{2 +} görüntüleme ve case12 tabanlı canlı hücre konfokal floresan Ca ^{2 +} görüntüleme bazlı Aequorin. Case12 kullanarak canlı hücre konfokal görüntüleme yüksek çözünürlükte sitozolik ve nükleer Ca ^{2 +} sinyalleri aynı anda taranmasını sağlayan ise FAS sistemini kullanarak Lüminesans görüntüleme, doku seviyesinde mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} sinyalleri basit, sağlam ve duyarlı bir algılama sağlar.

Giriş

Bitki hücresi, hücre hareketlerini koordine sinyalizasyonu ile çevreye göre. Çevresel uyarılara tepki olarak sinyal olayını erken hücre, bir geçici Ca ^{2 +} artıştır. Serbest Ca2 ⁺ konsantrasyonu içindeki desen ya da geçici bir artış imzası, genliği, sıklığı ve süresi ile karakterize edilir. Farklı uzay-zamansal Ca ^{2 +} imzalar farklı hücresel aktiviteler ¹ düzenler. Sıcak, soğuk, tuz, kuraklık, ışık, veya bitki hormonları gibi belirli uyaranlara, ince ayar olabilir membran lokalize Ca ^{2 +} kanalları ve / veya taşıyıcıların uzay-zamansal etkinliği, belirli Ca ^{2 +} imzalar sonuçlanır. Ca ^{2 +} taşıyıcıları, iyi karakterize edilmiş olmasına rağmen, küçük bitkilerde ¹ Ca ^{2 +} kanalları moleküler kimlikleri ve işlevleri hakkında bilinmektedir. Uyaranlara stres değiştirilmiş Ca ^{2 +} tepki ile mutantlar için genetik ekranlar etkili olabilir yaklCa ^{2 +} imzaları oluşturan bileşenleri belirlemek için oach. Son zamanlarda birçok Aequorin göre ^Ca +2 algılama sistemleri patojen saldırısı ve abiyotik stres ^2-4 yanıt bileşenleri sinyalizasyon ^{2 +} Ca genetik ekranlar kolaylaştırmak geliştirilmiştir.

Aequorin ilk 1990'ların başında ⁵ CA bitkilerde ²⁺ sinyalleri algılamak için kullanıldı. O zamandan beri, Aequorin ^Ca-2 belirli bir hücre izlemek için kök ⁸ tonoplast sitoplazma ^{5, 6} çekirdeği, kloroplastlar ^{7, 9} mitokondri ve stroma ^10, yanı sıra farklı hücre tipleri gibi farklı hücresel bölümlerin, hedeflendi ⁺ sinyalleri ^11. Aequorin tabanlı Ca ^{2 +} ölçümleri uyaranlara stres hücrelerin bir nüfusun mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} tepkilerini ortaya çıkarmak. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek hücreler Ca ^{2 +} tepkileri vardır unsynchroniyanıt doku ⁴ zed. Bu nedenle, Aequorin Ca ^{2 +} kayıt mutlaka bireysel hücrelerin Ca ^{2 +} sinyalini bildirmiyor. Son yıllarda, genetik olarak kodlanmış floresan proteini (FP), yüksek çözünürlüğe sahip hücre içi ^{Ca2 +} sinyali incelemek için kullanılmıştır, CA böyle sarı cameleon (YÇS) ¹² ve ¹³ olarak CASEs12 ^{2 +} göstergelerini tabanlı. YÇS flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) CFP ihtiva eden Ca2 ⁺ göstergeleri tabanlı ve YFP proteini kalmodulin ve kalmodulin-bağlanma peptidi M13 etmeye dayanır ^{2 +} Ca ile bağlantılı varyantları bulunmaktadır. ^Ca2 bağlanan kalmodülin olarak bu şekilde daha yüksek enerji transferi (FRET geliştirilmiş) ile sonuçlanan, birbirine CFP ve YFP getiren, yapısal bir değişiklik olur. CFP sinyal yoğunluklarının için YFP oranı olarak yaklaşık olarak hesaplanan zaman, FRET düzeyi, hücre içi Ca2 ⁺ dinamiklerini göstermektedir. Çeşitli SK versiyonları tesislerinde kullanılmaktadır. YC3.6 t oldusitozolde ^14,15, çekirdeğin ^16, mitokondri ¹⁷ ve plazma zarı ¹⁸ ve YC4.6 ve D4ER için argeted ER ^15,19 hedefleyen edildi ve D3cpv proksisomlara ²⁰ hedeflenmiştir. YÇS sentezleyen transgenik bitkiler, farklı hücre tiplerinin farklı hücresel bölmeleri içinde Ca ^{2 +} dinamiklerinin canlı hücre görüntüleme sağlar. DAVALAR (muhtemelen Ca lcium se Nsor) bir kalmodulin ve kalmoduline bağlayıcı peptid M13 barındıran tek dairesel sırası büyük floresan proteinleri (cpFPs) vardır. Ca ^{2 +} bağlanma üzerine, olgu floresan yoğunluğundaki bir artışa yol açan, konformasyonel değişiklikler yapılabilir. Kasanın floresan tepkisi ve ^Ca +2 konsantrasyonu arasında korelasyon hücre içi Ca ^{+ 2} dinamikleri kantitatif olarak ölçüldü sağlar. Case12 varyant 12 kat Ca ^{2 +} -saturated formları floresan artmıştır. N benthiminana bitkilerin geçici olarak İfadeessing Case12 veya stabil bir şekilde eksprese eden Örneği 12 Arabidopsis bitkileri koruma ve abiyotik stres ^4,21 Ca ² sinyalini incelemek için kullanılmıştır. , Veya dehidrasyon strese patojen saldırısına yanıt hücrelerinde asenkron mekansal ve zamansal Ca ^{2 +} salınımlar Case12 göre Ca ^{2 +} görüntüleme ile ortaya konmuştur.

Burada, Arabidopsis fide ²⁺ dinamikleri Ca özel ve sitozolik konfokal görüntüleme ve nükleer Ca mendil ve uyaranlara Aequorin göre lüminesans görüntülemesi için ayrıntılı talimatlar sunmak FAS Vaka 12. Lüminesans görüntüleme ifade Arabidopsis kök hücrelerinde ²⁺ dinamikleri bozulmamış bitki ya da burada açıklanmayan dokularda stres ile indüklenen Ca2 ⁺ dinamiklerini analiz etmek için ya da ^{2 +} sinyaller Ca etkisiyle değişmiş stres mutantlar için mutajenize bitki popülasyonlarını Arabidopsis taranması için adapte edilebilir. Canlı hücre Ca ^{2 +} görüntüleme kurulum Ca analiz adapte olabilirCa ^{2 +} Diğer göstergeler kullanılarak farklı bölmeler içinde subcelluar veya farklı hücre tiplerinde 2 + dinamiği.

Protokol

FAS Sistemini Kullanma 1. Aequorin Tabanlı Ca ² Görüntüleme

1. Lüminesans görüntüleme için fide hazırlayın. % 0.01 Triton-100 içeren% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile Aequorini Arabidopsis bitkileri tohumları sterilize edin. Tam kuvvet MS (Murashige ve Skoog temel tuz karışımı),% 1 sükroz ve% 1.2 agar içeren bir kare plaka (ızgara ile 10 x 10 cm kare Petri kabı,) hakkında steril tohum ekmek. Dikey olarak 2 gün boyunca 4 ° C'de (Şekil 1A) tabakalaşma sonra bir büyütme odası içinde yer plakalar.
2. Bir film üzerine fidan aktarın. Plaka üzerinde büyüyen 7-10 günlük fidelerin üzerine bir yapışkan film (Şekil 1B) yerleştirin. Yavaşça fidan filmin (Şekil 1C) uygun olmasını sağlamak için elle filmi itin. Fideler filme bağlanmış kalacak, böylece yavaşça filmin sıyrılması (Şekil 1D ve 1E)
3. Cofactor, fide inkübe edin. A yerleştiriniçeren kare plaka (10 x 10 cm) üzerine dhered fide 2 ug, 15 ml / ml sa-CTZ su (coelenterazine). Gece boyunca (Şekil 1F), 4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe fide.
4. Lüminesans görüntüleme için hazırlayın. Iki parça oluşturan, h-CTZ çözeltiden filmi çıkarın ve orta aşağı kesti. Fideler iki farklı plakalarda yüz ile filmin her parça yerleştirin. 5 dakika boyunca karanlıkta plakaları bırakın.
5. Lüminesans görüntü kazanır. Karanlıkta, aşağıdaki lüminesans görüntüleme sistemi (Şekil 1G) evresine üzerinde birbirine iki tabak yerleştirin. Hemen eş zamanlı olarak plakalara uyaranlara çözeltisi 20 ml ilave edilmesiyle görüntüler elde.
6. Lüminesans görüntüleri analiz. Tüm ışıldama görüntüler için aynı görüntü aralığını seçin. Faiz (ROI) bölgesini kırpın ve JPEG dosyaları (Şekil 2A) olarak görüntüler oluşturmak. Alternatif olarak, SPE olarak formatındaki dosyalar görüntüleri dışa ve içe aktardıktanİmageJ görüntü analizi yazılımı. ROI ortalama gri değerinin hesaplanmasında ayarlama ölçümleri. ROI alanının aynı boyutunu seçin ve çubuk grafikler (Şekil 2B) olarak ortalama gri ve mevcut verileri ölçmek.

2. Canlı Hücre Eşodaklı Ca ² Görüntüleme

1. Konfokal görüntüleme için fide hazırlayın. % 0.01 Triton ihtiva eden% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile case12 Arabidopsis bitkileri tohumları sterilize edin. Tam kuvvet MS tuzları,% 1 sükroz ve% 1.2 agar ihtiva eden bir plaka üzerinde steril tohum ekmek. 2 gün boyunca 4 ° C'de tabakalaşma sonra bir büyütme odası içinde dikey olarak yer plakalar.
2. Kurulum Görüntüleme Chambers
   1. Bir slayt ve lamel (Chamber A) kullanarak bir görüntüleme odasının birleştirin. Slayt ortasında üzerine su batırılmış pamuk parçası yerleştirin. Daha sonra su ile ıslatılmış pamuk üst plaka üzerine bir ya da iki 5 günlük fidan aktarın. Bir lamel, An her köşesine kil küçük parçalar sopalamel ve slayt arasındaki boşluğu (hazne) (Şekil 3A, sol panel) oluşturmak için fidan üstüne d yer lamel. Bir tane 1 ml'lik şırınga polietilen tüp (0.58 mm çapında) bir ucunu ve bölmenin hemen bitişik borunun diğer ucuna yerleştirin. Bant (Şekil 3A, sağ panel) ile yerine boru tutun.
   2. Pleksiglas odasını (Karain B) kullanılarak bir görüntüleme odasının birleştirin.
      1. Pleksiglas odasının her tarafında kanallar içine kaplanmış tüpler iki polietilen borular (0.58 mm çap) etrafında silikon gres ince bir tabaka yayıldı ve basın (Şekil 3B paneli bıraktı). Tüp oluklar içeren haznenin yüzeyi üzerine silikon ince bir yağ tabakası yayıldı ve hazne ağzı (kesilmiş) bir tarafını kapatmak için yağ içine bir lamel basın.
      2. Odasına plakasından beş günlük fidelerden aktarın ve üst o su ile ıslatılmış pamuk parçası yerleştirinfide f. Odanın diğer yüzeyine silikon gres yayıldı ve mühür üstünde başka bir lamel basın. Bir tane 1 ml'lik şırınga tüplerin biri ucunu. Başka boru açık (Şekil 3B sağ panel) ucunu bırakın.
   3. Bir odacıklı cam kapak (Chamber C) kullanarak bir görüntüleme odası hazırlayın. % 70 etanol ile odacıklı cam kapak Sterilize ve kuru kadar kaput üzerinde bırakın. 0.6 ml veya, sırasıyla, bir 2-çukurlu odanın havuzlarında veya bir 8-çukurlu odasına (Şekil 3C sağ panel),% 1 sükroz ve% 0.5 Phytagel içeren tam kuvvet MS ortamı, 0.2 ml ekleyin. Sterilize tohumlar ve berrak bir jel ince bir tabakasını ihtiva eden bölmeli bir kapak camı doğrudan tohum ekmek ve bunları 5 gün boyunca (Şekil 3C) için dikey olarak büyümesine izin.
3. Konfokal mikroskop kullanılarak görüntü kazanır. , Buz col yavaş yavaş 150 mM NaCl yaklaşık 200 ul enjekte, tuz, soğuk ya da peroksit gibi stres uyaranları, uygulamak içinhemen önce sırasıyla görüntü almak ya da hafifçe 2 veya 8-çukurlu bölmenin oyuğuna uyarıcı çözeltisi 500 ul veya 100 ul için bölme (Oda A veya B) içine akar, su ya da 1mM _{H2O 2} çözeltisi . Yakalama görüntüleri hemen 20X su daldırma lens (Sayısal açıklık 0.75) ile ters Nikon A1R odaklı lazer tarama mikroskobu kullanarak uyaran çözümü uyguladıktan sonra. Sırasıyla 550 nm, ve 512 x 512 piksel çözünürlükte - 488 nm ve 500 uyarma ve emisyon dalga boyları ile 4 sn aralıklarla görüntüleri bir zaman serisi toplayın.
4. Görüntü Analizi
   Nikon Elements kullanarak, ROI'ler ilgi her hücrenin (veya alan) etrafında çizildi. Her ROI içerisindeki toplam yoğunluğu Zaman Ölçümü iletişim kutusunu (İmageJ yerine kullanılabilir) kullanılarak zamanla ölçüldü. Toplam yoğunluğu ölçümleri ihraç ve DataGraph işlenmiştir. Ca ^{2 +} başak genlik inci gibi piklerinde eksi istirahat şiddeti, süresi olarak tanımlandıİki sivri bitişik başak zirveleri arasındaki zaman aralığı olarak başlatılması ve bir başak tamamlanması ve dönem arasında e saati. -test aracı karşılaştırmak için kullanıldı; t.

Sonuçlar

Mannitol, NaCI ve _{H2O 2,} sırasıyla, kurutma, tuz ve oksidatif stres uyarıcılar temsil etmek üzere kullanılmıştır. Ağır metal iyonu Cu2 ^+, bu üç stres uyaranları herhangi biri ile sinerji içinde kontrol etmek için, Cu2 ⁺ varlığında ya da yokluğunda her bir uyarana Ca ^{2 +} tepkiyi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, FASB lüminesans görüntüleme Arabidopsis fide dehidrasyon, tuz ve oksidatif stres farklı tepki ortaya koymuştur. 1 mM _{H2O 2} indüklerken, bu çalı...

Tartışma

Biz Arabidopsis fidelerinin mekânsal-zamansal Ca ^{2 +} yanıt kayıt için FAS sistemi göstermiştir. Bu FAS Ca ^{2 +} kayıt sistemi, CA burada sunulmuştur abiyotik stres uyarılara ek olarak çeşitli uyaranlar tarafından tetiklenen ^{2 +} dinamiğini ölçmek için adapte edilebilir bir basit, hassas ve güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu sistemi kullanarak, kolayca bütün bitki düzeyinde doku ya da uyaranlara özgü mekânsal-zamansal Ca ^{2 +} dinamiklerini karşılaştırabilirsiniz. FAS yüksek hassa...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 cm x 10 cm kare Petri kabı	VWR	60872-310
Yapışkan film	VWR	60941-062
Polietilen boru	PerkinElmer	9908265
1 ml şırınga	VWR	53548-000
Silikon gres	Beckman	335148
2 kuyulu odacıklı kapak camı	Nalge Nunc international	155379
8 kuyulu odacıklı kapak camı	Nalge Nunc international	155409
Lüminesans görüntüleme sistemi	Princeton Instruments	N/A
Ters konfokal lazer tarama mikroskobu	Nikon Instruments Inc.	Yok	Nikon A1R
Görüntüleme yazılımı	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 en yeni sürümüdür
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
Çok amaçlı çamaşır suyu	Herhangi bir yerel mağaza	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS tuzu	Fitoteknoloji Laboratuvarları	M524-50L
Sükroz	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG