Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

14.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51991

⸱

24 Eylül 2014

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Assumption College

Bu makalede

Özet

Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.

Özet

Nöronlar duyusunda, motor hareket, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır yönlü hücrelerdir. In vivo nöronlar okuyan nedeniyle karmaşıklığı, çeşitli ve dinamik ortamlarda ve teknik sınırlamalar zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, in vitro olarak nöronların okuyan nöronların karmaşık sırlarını çözmek için oldukça faydalı olabilir. Hücre kültürü modelleri arasında iyi tanımlanmış bir yapısı çevre koşulları ve değişkenler üzerinde detaylı bir kontrol sağlar. Burada, izole ayırmak ve civciv embriyolardan kültürü birincil nöronların nasıl açıklar. Bu teknik, hızlı, ucuz ve sağlam duyusal nöronlar büyüyen üretir. Prosedür, tutarlı bir şekilde yüksek nöronlar için zenginleştirilmiştir kültürleri üretmektedir ve çok az nöron olmayan hücreler (% 5'ten az) sahiptir. İlköğretim nöronların bu nedenle ayrıntılı prosedürler iki Distin oluşturmak için, işlenmemiş cam veya doku kültürü plastik iyi uymayanct, nöronal kaplama için iyi tanımlanmış laminin ihtiva katmanlarından açıklanmaktadır. Kültürlü nöronlar eş-immunoprecipitation, canlı hücre tahayyül, RNAİ'nin ve İmmünositokimya dahil olmak üzere birden hücresel ve moleküler teknikler, son derece elverişlidir. Bu kültürlü nöronlar çift İmmünositokimya için prosedürler optimize edilmiş ve burada tarif edilmiştir.

Giriş

Nöronlar hissi, görme, motor hareketinin, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır karmaşık hücrelerdir. Diğer hücre tiplerinden Benzersiz, nöronlar iletişim için gerekli nöral otoyolları oluşturmak için, kol-gibi süreçleri olarak adlandırılan aksonlar uzatmak. Büyüyen akson ucunda bulunan kalkınma uzmanlaşmış bölümlerinde sırasında, kendine uygun hedef akson yol dışı ipuçlarının bir konser gezinmek, büyüme konileri denir. Büyüme konisinin navigasyon altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Iyi bu mekanizmaları anlamak için, araştırmacılar tanımlanmış ve basitleştirilmiş vitro ortamda nöronların çalışma hücre kültürü modelleri kullandık. Nöronal farklılaşma 2, sitoskeletal dinamikleri, endositoz ve kaçakçılığı, dendrit: kültürü 1 okuyan nöronlar da dahil olmak üzere nöronal hücre biyolojisi anlayışımızda önemli ilerlemelere yol açmıştırdüzenleme 3,4, aksonal rejenerasyon 5, ve bu nöropatiler 6 gibi klinik durumlar. Buna ek olarak, kültürlü nöronlar İmmünositokimya, hücre yüzeyi ko-bağışıklık çökelti Western blot, transfeksiyon, RNAi, ve bu büyüme konisi motilite timelapse analizi de dahil olmak üzere canlı bir görüntüleme araştırma teknikleri geniş bir yüksek ölçüde uygundurlar. Bu nedenle, birincil kültür nöronları Nöronların hücre biyolojisi çok yönlerini açıklamak için güçlü bir yaklaşım.

Hücre kültürü modeli çevresel koşullar ve değişkenler üzerinde ayrıntılı kontrol ile araştırmacılar sağlar. Örneğin, kaplama nöronlar (ve buna uygun olarak büyür) edildiği katmanlarından kolayca manipüle edilebilir. Burada, iki farklı katmanlarından, düşük laminin-1 konsantrasyonu ile bir ve laminin-1 konsantrasyonları doyurarak ile diğer üretmek için ayrıntılı talimatlar sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, aynı molekülün farklı konsantrasyonlarda istenmeyen etkilere sahip olabilirİç nöronların durumu yanı sıra hücre yüzeyi bileşime. Örneğin, integrinler, cAMP ve yüzey düzeyleri hücre içi düzeyleri, bu iki substrat üzerine kaplanır 7,8 nöronlarında önemli ölçüde farklıdır. Daha başka çalışmalarda, fibronektin ve kondroitin sülfat proteoglikan, etki hücre yüzey moleküllerinin ifade edilmesi ve nöronal motilite 7-11 de dahil olmak üzere, bu diğer molekülleri göstermiştir. Buna ek olarak, aynı zamanda, hücre zarı bileşim ve nöronal motilite 12-16 darbe ve kolay ve hassas bir hücre kültürü modeli olarak manipüle olabilir nörotrofin ve neurotropins gibi çözünebilir moleküllerdir.

Burada, biz yöntemleri izole etmek ve kültür civciv embriyoları duyusal nöronlar ayrışmış açıklar. Bu prosedür, akson büyümesinin 5,7,8,10,11,16-21 içeren nörobiyolojisinde önemli gelişmelere yapmak için kullanılmıştır ve gangliyon hücreleri 22 izole etmek için tasarlandı bir prosedürden modifiye edilmiştir. VarBu yaklaşımın birçok avantajları. İlk olarak, civciv sırt kök ganglion (DRG) gelişimi birçok özellikleri iyi doğum, akson uzantısı için zaman çerçevesi de dahil olmak üzere karakterize edilir, ve protein ifadesi böylece in vitro deneylerde bilgilendirici inşa etmek için bir öğretici temel sağlayarak, 2,23-28 profiller. İkinci olarak, nöronal kültürler araştırıcı daha doğrudan ayrışan nöronlar ve nöronal olmayan hücreler her ikisini ihtiva eden (nöronlar ve nöronal-olmayan hücreleri içeren) Bozulmamış DRG eksplantları ve / veya karışık kültürlerinin kullanıldığı alternatif yaklaşımlara kıyasla nöronların çalışma sağlar ayrışmış. Üçüncü olarak, burada açıklanan prosedür, basit, ucuz ve lisans elverişlidir. Bu nedenle, bu teknik araştırma hem de eğitim amaçlı kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol küçük varyasyonlar DRG'ler dışındaki kaynaklardan nöronların hızlı, yüksek verim arınma izin vermelidir. Örneğin, bu prosedür, ENR nöronal olarak temin etmek üzere modifiye edilebilirembriyonik önbeyinde omurilik gibi diğer dokulardan iched kültürler.

İmmünositokimya, bu protokoller ayrışan nöronal kültürler için optimize edilmiştir ve burada ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Nöral hücre adhezyon molekülü (NCAM) ve β1 integrinler karşı iki İmmünositokimya için prosedür sağlanır. Bu imüno yöntemlerle üretilen veriler kültüre edilmiş nöronlarda 8,16 uzaysal ve model oluşturmanın çok molekül yoğunluğunu incelemek için kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Coverslip Hazırlanışı: Asit Yıkama ve pişirin

  1. En az 2 gün önce Diseksiyon (aşama 2) için, lamelleri hazırlamak için aşağıdaki adımları başlar. Yağlar ve tamamen temiz lamelleri kaldırmak için asit yıkama aşamasını gerçekleştirir.
  2. Dikey lamelleri pozisyonları ve birbirlerine dokunmadan onları engelleyen porselen tutucu Yük lamelleri. 2 M hidroklorik asit (HCI) ile dolu bir cam kap içine histoloji tutucu ve lamelleri batırılır. Porselen tutucu mevcut değilse, alternatif olarak, 100 mm cam Petri kabı alt kapağı ve 2 M HCl lamelleri daldırın 20 lamelleri yatay ~ yayıldı.
  3. Bir çeker ocak içinde külbütör tablasına (asit içinde daldırılmış lamelleri ile) cam kaba yerleştirin ve oda sıcaklığında en az 5 saat boyunca hafif sallanan sağlar. Alternatif olarak, asitle temizleme, gece boyunca aynı koşullar altında lamelleri.
  4. Porselen tutucu yüklenen aktarılarak damıtılmış H2O (DH 2 O) ile yıkayın lamelleridH 2 O ile dolu temiz bir cam histoloji kaba 2 M HCI gelen lamelleri ile Alternatif olarak, lamelleri ile cam petri 2 M HCI süzün ve dH 2 O ile doldurun
  5. Tekrar dH 2 O boşaltılarak ve taze dH 2 O ile cam kap dolum yıkayın 3 hızlı yıkar toplam tekrarlayın.
  6. Rocker üzerine (lamelleri ile ve dH 2 O) cam kap dönerek uzun yıkama rejimi başlayacaktı. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca hafifçe çalkalanarak izin verme. Sonra, dH 2 O süzün ve taze dH 2 O eklemek En az on yıkama toplam tekrarlayın. Alternatif olarak, bir gecede yıkamaya devam.
  7. 350 ° C'ye ısıtılmış fırın içine yıkanmıştır lamelleri. Porselen tutucu kullanıyorsanız, dH 2 O-dolu cam kabı tutucusunu çıkarın ve sonra doğrudan fırına lamelleri ile yerleştirmeyiniz. Bir cam Petri kullanıyorsanız, dH 2 O süzün ve sobala içine lamelleri ile cam tabak yerleştirinör.
  8. En az beş saat veya gece boyunca 350 ° C lamelleri pişirin.
  9. Pişirme işlemi tamamlandıktan sonra, ince forseps ile porselen tutucudan lamelleri çıkarın ve steril 100 mm ebadındaki bir cam Petri kabı içine yerleştirin. Başlangıçta cam Petri kabındaki porselen tutucuya yerleştirildi değil lamelleri bırakın.

2. Civciv Diseksiyon ve DRG'ler İzolasyonu

  1. Bereketli Kaldır (hafif hafif sallanarak 37-38,5 ° C'de tutulan) inkübatör Beyaz Livorno civciv yumurta düzenledi.
    NOT: Önceki çalışmalarda DRG'ler 2,8,11-13,16 izolasyonu için embriyonik gün 7-10 kullandık.
  2. Laminar akış içinde seçilen yumurta yerleştirin. Steril çözümleri ve araçları ile laminer akış kaputu aseptik koşullarda, aşağıda listelenen tüm işlemleri yürütmek. 37 ° C su banyosunda Pre-sıcak tüm çözümleri.
  3. Plastik 100 mm Petri kabı içine yumurta ve yer içeriğini çatlak. Başka bir 100 mm Petri kabı embriyo transferi için standart forseps kullanın.
  4. Pasteur pipet kullanarak, ıslak mendil tutmak için Petri 1x PBS ısındı ekleyin. Ince forseps ile boyun kısma embriyo başını kesmek. Başka bir temiz 100 mm petri vücudu aktarın.
  5. Sıcak F12HS10 ekleme (Ham'ın F12, 10 mM HEPES, 100 birim / ml penisilin / ml streptomisin,% 10 cenin sığır serumu, 0.1 mg) ıslak doku tutmak için Pasteur pipeti ile çanak. Sırt tarafında (Şekil 1A) üzerine embriyo konumlandırmak için forseps kullanabilir.
  6. Laminer akış kaputu bir binoküler stereovision mikroskop üzerine embriyonik doku içeren 100 mm plastik Petri kabı yerleştirin. Kalp, akciğer ve diğer organlara maruz gelişen dermis kısma boyun kuyruk dikey bir orta hat kesi yapmak için ince forseps kullanın. Alternatif olarak, iç organların maruz küçük gözyaşı bir dizi yapmak.
  7. Yavaşça steril ince forseps 2 set kullanın: a) boyun kavramak ve b) kuyruk doğru kalbe hemen üstün aortu veya diğer doku tutun ve çekin,hayvan iç çıkarma.
  8. Dokuya Pasteur pipeti ile sıcak F12HS10 uygulanır. Gelişmekte kaburga, omurga kolonu ve DRG'ler (Şekil 1B-1D) maruz kalan kardiyovasküler, solunum veya sindirim organları çıkarmak için forseps kullanın.
  9. Mikroskop altında, daha kaburga alt lomber vertebral kolon, her iki tarafın birlikte DRG'ler organları kaldırmak ve toplamak için ince forseps kullanabilir. Embriyodan sağlam DRG'ler yolma tarafından DRG'ler toplayın. Kıstırma ve omurilik doğru DRG ulaşmak ve çevre ya da tam tersi doğru DRG ulaşır gelişmekte olan sinir kavrayarak kökleri sahip olamazlar.
  10. Sıcak F12HS10 dolu bir 35 mm kültür çanak içine bozulmamış DRG'ler yerleştirin. Ince forseps ile sıkıştırarak 35 mm çanak sağlam DRG'ler gelen DRG'ler yapışmış olabilir dorsal veya ventral kökleri gibi, herhangi bir aşırı doku çıkarın.
  11. Lomber bölgeye üstün DRG'ler elde etmek için, torakal ve Cervi'de ventral yarısında kaldırmakcal omurga. Bu, üst boyun bölgesinde omurilik ekseni ile üst bel bölgesinde bir kesim dik gelişmekte belkemiğinin bir kesim yapılarak yapılır. Sonra, kesik sağ ve vertebral kolonun sol kenarlarında omurilik eksenine paralel hale. Açığa omurilik (Şekil 1E-1F) ortaya embriyo, gelen vertebral kolonun ventral yarısını kaldırın.
  12. DRG'ler kolay erişim sağlamak için, ince forseps ile omuriliği tutarak torakal ve servikal omurilik çıkarın. Vertebral kolonun üzerinden omurilik kaldırmak için forseps kullanabilir. Bir yaklaşım olarak, göğüs omurilik yivlerin seviyesinde ve servikal alan kaburga üstündür.
  13. Ince forseps ile sağlam göğüs ve servikal DRG'ler toplayın ve diğer DRG'ler sıcak F12HS10 koyun. DRG'ler yapışabilir aşırı doku çıkarın.
  14. Yardım etmek F12HS10 ile yeni bir cam Pasteur pipet içini durulayınPipet duvarlarına yapışmasını önlemek DRG'ler. Bir steril 15 ml konik tüp küçük bir petri tüm DRG'ler ve F12HS10 transferi ve hemen 3. adıma geçmek için durulanır pipet kullanın.
    NOT: Ek embriyolar DRG'lerin sayısını artırmak için disseke edilebilir. DRG'ler Aşama 3 için hazır olana kadar 37 ° C 'de F12HS10 tutulmalıdır.

3. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 1

  1. Sağlam DRG'ler santrifüj içine yavaşça yer ile konik tüp 2-3 dakika boyunca (200 xg) dönerler. DRG'ler tüpün dibine battı onaylayın. Aksi takdirde, tekrar dönerler.
  2. Bir pipet kullanarak, yavaşça rahatsız DRG pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. DRG'lerin pelet yerinden ayrılmasını, 1x kalsiyum ve magnezyum içermeyen (CMF) 2 ml PBS ilave edin. Tekrar Spin ve sağlam DRG pelet bırakarak CMF PBS kaldırmak. , Bir sonraki aşamada bir şekilde tripsin emdirme ile müdahale edecek F12HS10 fetal sığır serumu, çıkarmak için üç kez olmak üzere toplam bu yıkama işlemi tekrar edin.
  3. 2 mi PBS ve CMF DRG'ler içeren 15 ml'lik bir tüpe ısıtıldı tripsin 2 ml ilave edilir. 10-15 dakika ayrışmış hücrelere DRG'ler sindirmek için 37 ° C su banyosu içinde yer tüpü.
  4. İnkübasyon sırasında, F12H + ek ihtiva eden ortam yapmak (Ham'ın F12, 10 mM HEPES 100 birim / ml penisilin, 0,1 mg / ml streptomisin 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamin ve N2) ve sıcak 37 ° C su banyosu içinde. Tipik olarak, toplam 10 mL ortam içinde birincil duyu nöronlarının 4-5 olarak 35 mm'lik kaplara için yeterlidir. Ayrıca çözülme laminin-1 kaplama lamelleri (adım 4) için başlar.
  5. Görsel yavaşça çiğnemek P1000 pipet ile tripsin çözeltisi içinde DRG'ler ve sağlam DRG'ler yokluğu için inceleyin. DRG'ler sağlam artık gözü ile görülebilecek kadar öğütme devam edilmesi ve / veya bozulmamış DRG'ler ayrışmış kadar 37 ° C su banyosu içinde daha fazla tripsin inkübasyon için izin verir. , Hasar DRG nöronları korumak öğütüldükten sırasında hava kabarcıkları önlemek ve <30 dakika tripsin sindirimi sınırlamak için.
  6. Centrifugayrışmış DRG'ler içeren ve pelet oluşturmak için 3-5 dakika boyunca 200 xg'de tripsin e tüp. Pelet oluşana kadar gerekirse daha uzun Spin.
  7. Dikkatle pelet bozmadan tripsin aspire. Topak haline F12HS10 2 ml ilave edilir. Yavaşça P1000 pipet ile DRG'ler çiğnemek.
  8. 100 mm kültür çanak içine 15 ml konik tüp tüm içeriği aktarın. 10 ml'lik bir toplam için her seferinde, 2 ml 8 mi F12HS10 ile tüp durulayın ve kültür tabağına aktarın. Bu durulama aşaması, borunun duvarlarına yapışmış halde olabilir hücreleri toplamak yardımcı olur.
  9. 100 mm kültür tabağına yerleştirin (10 mi F12HS10 ve DRG hücreleri ayrışmış), 3 saat boyunca nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içine.
    NOT: HEPES CO2 yokluğunda ortam pH tamponları, çünkü CO2 inkübatör gerekli değildir. İnkübasyon sırasında, glial hücreler, glial gevşek yatağına yapışarak doku kültürü eğilimi plastik ve nöron yüzeyine bağlanır.

4. Kaplama Asit YıkanmışLaminin-1 ve Fırında Lameller

  1. Buz üzerinde donmuş laminin-1 steril hacimde çözülme.
  2. , Steril koşullar altında, laminin-1, 50 ul steril kana 1x PBS 1 ml.
  3. 280 nm'de, laminin-1 absorbans değerini elde etmek için bir spektrofotometre kullanılır. Laminin-1 konsantrasyonunu belirlemek için, aşağıdaki denklem kullanılarak, bu değeri kullanın.

ABS 280 (= konsantrasyonu mg / ml) * (protein yok olma katsayısı)
Laminin-1 için yok olma katsayısı 0.86 olduğunu.

  1. , Steril koşullar altında, 1 mg / ml ve 20 mg / ml konsantrasyonları elde etmek için 1X PBS ile laminin-1 seyreltin. Laminin-1 inkübasyondan sonra 7,8,10 lamel (30 ng / cm2 ve 300 ng / cm2) bağlı bir on kat bir fark elde etmek için, laminin-1 Bu iki tatbik konsantrasyonlarını kullanarak.
  2. Laminar akış, bir asitle yıkanmış ve pişmiş c yerleştirmek için ince forseps kullanımıBir 35 mm kültür çanak dibine overslip. Gerekli yemekleri sayısını elde etmek için gerektiği kadar tekrarlayın.
  3. Daha da sterilizasyon sağlamak üzere 20-30 dakika süre ile, UV ışığına maruz lamelleri. Bu aşama esnasında çanak kapağı kapalı tutunuz.
  4. Her cam lamel hazırlanan laminin-1 400 ul ekleyin. Lamel tam kapsama sağlamak için laminin-1 yaymak için pipet kullanın. Yüzey gerilimi, laminin-1 lamel kalır ve gerektiğinde, kültür kabı, bir alt üzerine yayılmaz sağlayacaktır.
  5. Tabağa kapağı yerleştirin ve laminin-1, oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle inkübe izin (3 saat uygunudur).
  6. Laminin-1 inkübasyondan sonra, laminar akış başlığı içinde steril PBS ile aseptik teknik kullanılarak lamelleri yıkayın. Lamel çözüm çıkarın ve PBS 400 ul ekleyin. 5-10 dakika bekleyin. 3 durulama toplam tekrarlayın.
  7. Son durulama sonra lamel PBS bırakın. Durulama sırasında yüzey gerilimini kırmak etmeyin ve lamelleri kurumasına izin vermeyin. Lehazır olana kadar üzerinde ave kapak coverlip üzerine nöronlar ayrışmış plakasına.

5. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 2

  1. İnkübasyondan sonra, yavaşça ayrışmış DRG hücreleri ihtiva eden 100 mm tabak için alt durulama için 10 ml'lik steril bir pipet kullanın. Sonra yavaşça yaklaşık 1/3 yemeğin üzerine 7 ml sınırdışı ~ pipet yardımı ile F12HS10 7 ml çekin, 45 ° açı ~ de çanak tutun. Yavaşça nöronlar yerinden oynatıp 5x tekrarlayın.
  2. Çanak döndürün ve yemeğin başka 1/3, başka bir altı durular için, prosedürü durulama tekrarlayın. Yemeğin 1/3 kalan tekrar işlemi tekrarlayın. Bu şekilde, yavaşça çıkarmak için nöronlar F12HS10 ile çanak tüm alt yıkayın.
  3. Aynı pipet kullanarak, 15 konik tüp 100 mm çanak F12HS10 içeren nöronlar aktarın. Hücrelerin topakçık 200 g'de 5-10 dakika boyunca santrifüj.
  4. Rahatsız pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. Isıtıldı F12H + takviyeleri 2 ml yeniden süspanse pelet.
  5. hücre yoğunluğu belirlemek için Hemasitometre kullanın.
  6. İstenen kaplama konsantrasyonu (20 ug / ml laminin-1 ile kaplanmış 8,16 lamelleri boyunca 1 ug / ml laminin-1 ve 40.000 hücre / ml 'si ile kaplanmış lamelleri için 120.000 hücre / ml) elde etmek üzere F12H + takviyeleri ile, gereken hücreleri seyreltin.
  7. Laminin kaplı lamelleri PBS çıkarın ve hemen lamelleri üzerine hücrelerinin 400 ul yerleştirin. Dikkatle nemlendirilmiş, 37 ° C hücre kültürü inkübatör çanak aktarın. Nöronlar, laminin-1 yapışmasının sağlanması için 3 saat için en az 1 saat süreyle ve en inkübe izin verin.
  8. , Steril koşullar altında, yavaşça F12H + takviyeleri 1.6 ml nöron içeren 35 mm'lik kaplara sel.
    NOT: Bu zamanda, bir örtücü kısım üzerine gerilim kırılabilir alanlar. Nöronlar yeterince lamel laminin-1 yapıştırılır var.
  9. Kuluçka ve gece inkübe hücreleri dönün. Ertesi gün immünsitokimya gibi deneyler yapın.

6. Benmmunocytochemistry

  1. İmmünositokimya önce, 37 ° C su banyosunda ılık bir sabitleyici çözeltisi (% 4 paraformaldehit,% 30 sukroz 2X PBS).
    NOT: hücreleri sabitleme önce, böyle netrin-1, Mn 2, sonik kirpi, semaforin ve efrin 16,29-31 gibi çeşitli reaktifler ile tedavi.
  2. Yavaş yavaş kültürü çanak F12H + takviyeleri 2 ml 1 ml'sini uzaklaştırın. Yavaşça ısıtılmış sabitleştirici çözeltisi 1 ml. 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe izin verin.
  3. Dikkatle sabitleştirici çözüm kaldırmak ve 2 ml PBS ekleyin. PBS uygulaması nedeniyle sabit hücrelerin olası yerinden oynatmamaya kaçınarak, yemeğin kenarına doğru çözümü uygulayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  4. 5 yıkama toplam PBS yıkama tekrarlayın. Hücreler immünositokimyada Herhangi bir adım sırasında kurumasına izin vermeyin.
  5. PBS çıkarın. Bloke etme çözeltisi, 1 ml halinde (% 0.1 Triton-X, 1X PBS,% 5 normal keçi serumu). Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Alternatif olarak, yüzey molekülleri leke, Çözüm 8 engelleme Triton-X kullanmayın.
  6. Üreticinin tavsiyesine göre çözümü engelleme içine primer antikorları sulandırmak. NCAM karşı antikorlar için 500 ve β1 integrinleri 16 aktif: 1 kullanın. , Bloke çözeltisini çıkarın primer antikor çözeltisi 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir.
  7. Primer antikor çözüm çıkarın ve 1X PBS 2 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin. 4 PBS yıkama toplam tekrarlayın. Gerekirse yıkar, uzatılabilir.
  8. İkincil antikor 1 sulandırmak: 1000 çözümü engelleme. , PBS çıkarın 1 mi ikincil antikor solüsyonu ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
    NOT: İkincil antikorlar ışığa duyarlı bulunmaktadır. Bu noktadan sonra mümkün olduğu kadar karanlıkta çözüm ve hücreleri tutun.
  9. Sekonder antikor çözüm çıkarın ve daha önce yapıldığı gibi, 1x PBS ile 5x durulayın.
  10. Fluoromount arasında ~ 60-80 ul uygulayınBir mikroskop lamı üzerine G. Ince forseps kullanarak, yavaşça mikroskop lamı üzerine Fluoromount G içine çanak ve alt lamel üzerinden lamel kaldırın. Hava kabarcıkları kaçının.
  11. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de yatay olarak kayar. 12-24 saat sonra, Fluormount G polimerize edecek ve kapak sıkıca mikroskop lamı eklenir. Bu polimerizasyon basamağından sonra hücreler Resim tamamlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol kültürü için çok az (örneğin, <5%) nöronal olmayan hücrelerin 7,8,10,16 ile ayrışan embriyonik duyu nöronlarının zenginleştirilmiş bir popülasyonu araştırmacılar sağlar. Sayısız DRG'ler lumbosakral, torakal ve servikal bölgelerde elde edilebilir. Araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak, bu farklı anatomik bölgelerden DRG'ler kolaylıkla izole edilebilir. Örneğin, Şekil 1 Şekil 1C ve 1D ve Şekiller 1E ve 1F

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada izole etmek için ayrıntılı protokoller sunmak ve kültür bir civciv embriyo duyusal nöronlar ayrışmış. Bu prosedür vitro 7,8,10,16 yılında güçlü büyüyen nöronların zenginleştirilmiş bir nüfusu oluşturur. Çok sayıda hücresel ve moleküler teknikler burada açıklanan İmmünositokimya, aşağıdakileri içeren, bu kültüre edilmiş nöronlarda, uygulanabilir. Bu protokol, yakın zamanda nicel olarak duyu büyüme konilerinin 8,16 olarak imüno-aktif integrinlerin yoğunluğunu değerlendirmek i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz bu kağıt üzerinde anlayışlı yorumlar için Alison Philbrook, Belinda Barbagallo ve Michael Francis teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma MLL layık bir R15 ALAN ödül 1R15NS070172-01A1 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Birincil Antikor Tablosu
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Steril küçük kültür kapları (35 mm)Corning430165
Steril büyük kültür kapları (100 mm)Falcon353003
Steril büyük Petri kapları (100 mm)VWR89000-302
Cam Petri kabı (100 mm)VWRD108962
İnce forsepsGüzel Bilim Araçları11251-10
Standart forsepsGüzel Bilim Araçları1100-12
Lameller (22 x 22 mm)Fisher12 518 105K0.13-0.17 mm kalınlık mikroskopi için idealdir
Porcelin lamel tutucuThomas scientific8542E40
Fetal Sığır serumuGibco17502-048500 ml Ham F12 ortamı başına 50 ml alikot kullanın
HClVWRVW3204-12 M'de kullanın, NaCl'yi atmadan önce iki kez kullanılabilir
SigmaS9888,laminin-1 stok çözeltisi için 5 M NaCl çözeltisi kullanın
Laminin-1Invitrogen23017-01572 ve mikro ekleyin; l steril 5 M NaCl ve 50 & mikro'ya alikot; l
15 ml Konik tüphücre tedavisi229411
PBS CMF 10xGibco142001x'te kullanılır, steril Millipore filtrelenmiş su ile seyreltin
PBS 10xGibco140801x'te kullanılır, steril Millipore filtrelenmiş su ile seyreltin
Jamb's F12Lonza12-615F
Fetal Sığır Serum Albümini (BSA)Gibco10438% 10'da F12HS20 olarak kullanın
HEPESSigmaH3375damıtılmış suda steril 1 M çözelti yapın, 10 mM Penisilin / streptomyosin nihai konsantrasyonunu elde etmek için F12 ortamında seyreltin
SigmaP0781500 ml F12 ortamında 5 ml kullanın
NT3Kırlangıç GF0311 ml steril Millipore su ekleyin, steril koşullar altında alikot, -20 ° C'de saklayın; C, F12H ortamında 10 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın, -20 ° C'de tutun; C buz çözmeyen dondurucu
NGFRnD sistemleri256-GF%0,1 BSA içeren 1 ml steril 1x PBS ekleyin, steril koşullar altında alikot, -20 ° C'de saklayın; C, steril koşullar altında F12H ortamı
L-GlutaminSigmaG7513, -20 ° C'de saklayın; C, steril koşullar altında F12H ortamında
TrypsinSigmaT4049, -20 ° C'de saklayın; C
Sığır Serumu Albümini (BSA)Gibco15260
Gerekli diğer öğeler: cam Pasteur pipetleri, verimli beyaz leghorn tavuk yumurtası, yumurta kuluçka makinesini kontrol edin (nemlendirilmiş, 37 &°; C), hücre inkübasyon odası (nemlendirilmiş, 37 &°C; C), laminer akış başlığı, binoküler stereovizyon diseksiyon kapsamı
İmmünositokimya Reaktifleri Tablosu
sükrozSigmaS9378(% 4 paraformaldehi,% 30 sükroz, 2x PBS) Fiksatif çözeltide kullanılan
Triton-X 100SigmaT-8787
ParaformaldehitSigmaP6148(% 4 paraformaldehit,% 30) sükroz, 2x PBS)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Normal keçi serumuYaşam teknolojileriPCN500
Mikroskop slaytlarıVWR16004-430<
NCAM'a karşı antikorMilliporeAB5032poliklonal
Antikoru etkinleştirilmiş ve beta; 1 ingegrinMilliporeMAB19294monoklonal
İkincil Antikor Tablosu
Goat anti-fare IgG Alexa 488Yaşam teknolojileriA11001
Keçi anti-tavşan IgG Alexa 548Yaşam teknolojileriA11036
, , alikotunda 10 ng / ml'lik son konsantrasyonda kullanılır alikotunda 200 mM nihai konsantrasyonda kullanınfiksatif çözeltide kullanılan td colspan="4">

Kaynaklar

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921(2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Dorsal K k GanglionlarH cre DisosyasyonuLaminin Substratlarmm nositokimyaH cre K lt rN ronal KaplamaTripsin SindirimiAk Sitometrisi
Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.