Protein arginin metilasyonu, diğer bir deyişle, enzimler sınıfı tarafından katalizlenmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs), proteinler içindeki arginines metil grup (lar) ilave enzimatik işlemidir. In vitro deney, metilasyon, bilinen veya yeni PRMT substratların metilasyon durumunu değerlendirmek için en güvenilir bir araçtır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak
Bu makalede
Özet
Özet
Protein arginin metilasyon çekirdeğinde en bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Protein arginin metilasyon tespit ve / veya proteomik yaklaşımlar ile belirlenir, ve / ya da metil-arginin özel antikorlar ile immunoblotting edilebilir. Ancak, bu teknikler bazen yanıltıcı olabilir ve sık sık yanlış pozitif sonuçlar vermektedir. En önemlisi, bu teknikler, metilasyon deneyler, diğer yandan, hassas olan yararlı biyokimyasal deneyler, in vitro olarak. PRMT substrat spesifikliği desteklemek için doğrudan bir kanıt sağlayamaz ve tanımlanan proteinlerin gerçekte PRMT alt-tabakalar ise sürekli olarak ortaya koymaktadır. Tipik olarak in vitro deney, metilasyon, saflaştırılmış aktif PRMTs saflaştırılmış alt-tabaka ve bir radyo-izotop işaretli metil donörü (S-adenosil-L-[metil-3H] metionin) içerir. Burada katalitik olarak aktif PRMT1 bir yerde ifade PRMT aile üyesi izole edilmesi için bir adım adım protokol açıklar. BeniSaflaştırılmış PRMT1 arasında methyl transferaz aktiviteleri daha sonra S-adenosil-L-metil donörü [metil-3H] Metioninin varlığında, protein 1 (G3BP1) bağlayıcı bir Ras-GTPaz aktive edici protein, bilinen bir PRMT alt-tabaka test edilmiştir. Bu protokol, yeni fizyolojik PRMT1 substratların metilasyon durumunu oluşturulması için değil, aynı zamanda protein arginin metilasyon temel mekanizmasını anlamak için sadece kullanılabilecektir.
Giriş
Protein metilasyonu ilk kez 1968 1 yılında tanımlanmıştır. Araştırmacılar 2 Bu post-translasyonel modifikasyon önemini takdir başladı, 1996 yılında PRMT1 ilk klonlanması kadar değildi. İlginç bir şekilde, nükleer özler proteinlerinin arginin kalıntısının yaklaşık% 2, bu değişiklik gösteren bolluğu, 3, metile edilir. Arginin olabilir arginin yan zincirleri içinde bir bazik yan zincire ve nitrojen / s olan, pozitif yüklü bir amino asit olup, çeviri sonrası bir metil grubu, arginin metilasyon 4-6 olarak bilinen bir süreç eklenmesi ile değiştirilmiş. Arginin metilasyon enzim yani bir sınıf ile katalize edilmektedir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tanım yapılarından oluşan 1. Hazırlık
- Protokolü başlamadan önce, bir N-terminal epitop (Myc veya HA) ve bakteriyel bir hücreden yüksek düzeyde protein ekspresyonu ve saflaştırılması için alt-tabaka çerçeve-içi glutation-S-transferaz (GST) ile bir memeli ifade vektörlerine klonlanabilir PRMTs Standart moleküler biyolojik teknikler kullanılarak lizatlarının.
PRMTs 2. saflaştırılması
- İnsan bronş epitel hücrelerinin (Beas2B) sağlamak için, 100 mm kültür kaplarına kullanın. Passage hücreler her 3 gün ve onları izdiham büyümeye izin vermeyin.
- Transfeksiyondan bir önceki gün, 100 mm kültür çanağı içinde 10 m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
GST-G3BP1 metillenmesi HA PRMT1 ait özellikler, bir in vitro deneyi ile metilasyon belirlenmiştir. Beas2B hücre lizatlarından arıtıldı HA-etiketli PRMT1 GST-G3BP1 ihtiva eden bir metilasyon reaksiyonunda kullanılmıştır ve bir metil vericisi olarak S-adenosil-L-[metil-3H] metionin 1 uCi. PRMT1 etkili bir GST-G3BP1 (Şekil 1, üst panel) metilasyonunu katalize olabilir. Negatif kontrol (Şekil 1, üst panel, kuşak 1) olarak görev yapan, boş vektör transfekte Beas2B h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada tarif edilen protokol rutin olarak tespit PRMT substratların metilasyon durumunu belirlemek için kullanılır. Bu sağlam ve tutarlı bir tahlil de kendi alt tabakalar için PRMTs spesifıtesine kesin kanıt sağlayacaktır. Bu deneyde başarısı için anahtar bileşenleri şunlardır: Memeli hücrelerinde PRMTs 1. ekspresyonu arıtılmış PRMTs 2. Aktivite, 3. ekspresyonu ve alt-tabaka saflaştırılması ve nitroselüloz zara 4. Tam proteinlerin western transfer.
Rekombinant ifade PRMTs ve bakteriler safla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Gazi İşleri US Department Merit Ödülü tarafından desteklenen ve bir NIH RW için R01CA138528 hibe edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| S-adenosil-L- [metil-3< / sup>H] metiyonin | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | Ulusal Teşhis | LS-270 | |
| Şişe üstü dağıtıcı | Ulusal Teşhis | LS-900 | |
| AutoFluor | Ulusal Teşhis | LS-315 | |
| 6 ml Sintilasyon Şişeleri | Ulusal Teşhis | SKU: SVC-06 | |
| GST-sefaroz | GE Yaşam Bilimleri | ||
| L-Glutatyon Azaltılmış | Sigma | G4251 | |
| Lipofektamin | İnvitrojen | Transfeksiyon reaktifi | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodyum deoksikolat | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA afinite matrisi | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad jel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antikoru | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Kaynaklar
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TI....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
