Yumuşak agar koloni oluşum testi, in vitro hücresel ankrajdan bağımsız büyümeyi doğrulamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, transforme olmuş hücrelerin tümörjenik potansiyelinin ve proteinlerin transforme olmuş hücreler üzerindeki tümör baskılayıcı etkilerinin tespiti için sıkı bir yöntem göstermektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi
Bu makalede
Özet
Özet
Ankrajdan bağımsız büyüme, dönüştürülmüş hücrelerin katı bir yüzeyden bağımsız olarak büyüme yeteneğidir ve karsinogenezin ayırt edici özelliğidir. Yumuşak agar koloni oluşumu testi, bu yeteneği in vitro olarak karakterize etmek için iyi bilinen bir yöntemdir ve hücrelerde malign transformasyon için en katı testlerden biri olarak kabul edilir. Bu test aynı zamanda çeşitli tedavi koşullarına yanıt olarak bu yeteneğin yarı kantitatif değerlendirmesine de izin verir. Burada, Wnt sinyal yolunun iki üyesi olan Wnt7A ve Frizzled-9'un (Fzd-9) tümör baskılayıcı etkilerini göstermek için bir murin akciğer karsinomu hücre hattı olan CMT167 kullanarak yumuşak agar kolonisi oluşum testini göstereceğiz. Wnt7a ve Fzd-9'un eşzamanlı aşırı ekspresyonu, CMT167 hücrelerinde koloni oluşumunun inhibisyonuna neden oldu. Bu, Wnt7a ligandının ve Frizzled-9 reseptörünün ekspresyonunun, bir murin akciğer karsinomu modelinde tümör büyümesini baskılamak için yeterli olduğunu göstermektedir.
Giriş
Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi yaygın in vitro hücresel dönüşümü değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Tarihsel olarak, Puck ve diğ., 1956 yılında bir deney, klonojenik analiz, koloniler 1 oluşturmak için hücre yeteneğini değerlendirmek için kullanıldı. Bu teknikte, hücreler, kültür plakası üzerine dağıtılmıştır ve gerektiğinde büyüme faktörleri temin etmek üzere "besleyici" hücreler ya da şartlandırılmış ortam varlığında yetiştirilir. Bu tekniğin sınırlama sadece koloni oluşumu ile ilgili bilgi verdi oldu. Normal hücreler nedeniyle anoikis 2 olarak apoptotik ölümden belirli bir tür için, ankrajdan bağımsız büyüme....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Materyaller ve Reaktifler 1. hazırlanması
- Etiket, bir doku kültürü içinde her bir oyuğa her bir hücre hattı veya bir durum için uygun bir 6-yuvalı plaka tedavi araştırılmaktadır.
- Toz ortamın 1 g ve 50 ml lik bir son hacme kadar deiyonize su içinde bir sodyum bikarbonat, 0.2 g çözülmesiyle 2x hücre kültürü ortamı hazırlayın.
- Sterilize etmek için bir 0.2 mikron filtre içinden bu orta geçirin.
- Ilgi konusu hücre çizgisinin normal kültür için gerekli ek bileşenler ekleyin. Örneğin,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin solüsyonu ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde CMT 167 hücre çizgisi büyür. Kullanmak için sıcak su banyos....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bizim yumuşak agar koloni formasyon deneyi ile gösterildiği gibi CMT167 hücrelerinde Wnt7A ve Fzd9 ekspresyonu tümör bastırılmasında etkindir. Başlangıçta, biz Wnt7A ve Fzd9 mRNA CMT167 hücrelerinde düşük seviyelerde eksprese olduğunu göstermek üzere, Q-PCR kullanılmıştır. MLE-12 hücreleri, bir SV40 ile dönüştürülmüş faregiller akciğer epitelyal hücre hattı (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında CMT167 hücreleri, endojen Wnt7A ve Fzd9 düşük seviyeleri göstermişlerdir. Daha sonra, iki retrovirütik aşın vektö.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sinyal gönderme proteinleri, tümör baskılayıcı fonksiyonu in vitro teyit de zordur. Bu özelliği araştırmak için mevcut en sıkı deneylerden biri yumuşak agar koloni formasyonu testtir. Burada, stabil bir şekilde, parental CMT167 hücre hattına göre Wnt7a ve Fzd9 aşırı ifade eden bir murin akciğer karsinoma hücre soyu kullanılarak, yumuşak agar koloni formasyon deneyi gösterdik.
Yumuşak agar tahlil ilgili dikkate alınması gereken birkaç önemli nokta vardır. Bu tahlilde en önem.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı'ndan bir Başarı Ödülü ve RW'ye R01CA1385282522717 bir NIH hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kanser Hücresi İlgi Alanı | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Hücreleri |
| Toz RPMI 1640 Orta | Gibco | 31800-089 | 2x hücre kültürü ortamı hazırlamak için kullanılır. |
| Sıvı RPMI 1650 Orta | Cellgro | 10-040-CV | 1x hücre kültürü ortamı olarak adlandırılır. |
| Fetal Sığır Serumu | HyClone | SH30910.03 | Hücre kültürü ortamını desteklemek için kullanılır. |
| Penisilin / Streptomisin | CellGro | 30-002-Cl | Hücre kültürü ortamında kullanılır. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | %1.0 ve %0.6 agar hazırlamak için kullanılır. |
| Sodyum Bikarbonat | Fisher | BP-328-1 | 2x hücre kültürü ortamında kullanılır. |
| Tripsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Steril Şişe Üstü Filtreler | Fisher | 09-761-126 | 2x orta steril filtre için kullanılır. |
| Lipofektamin Reaktifi | Invitrogen | 18324-020 | PPAR-RE lusiferaz testinde kullanılır. |
| 6 oyuklu Plakalar Doku Kültürü Tedavi Edildi | |||
| 37 & # 176; C/5% CO2 İnkübatör | |||
| Chemi-Doc Görüntüleyici | Bio-Rad | Kolonilerin fotoğraflarını çekmek için kullanılır. | |
| Miktar Bir Yazılım | Bio-Rad | Hücre kolonilerini saymak için kullanılır. | |
| 15 ml Konik Tüpler | |||
| 50 ml Konik Tüpler | |||
| 250 ml Erlenmeyer Şişeleri | |||
| Mikrodalga | |||
| 5 ml Serolojik Pipetler | |||
| Pipet Yardımı Mikropipet | |||
| Pipet Uçları | |||
| Ters Işık Mikroskobu | |||
| Santrifüj | |||
| Isıya Dayanıklı Eldiven | |||
| Saran Wrap | |||
| Buz Kovası |
Kaynaklar
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
