Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi Ex vivo Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri
Bu makalede
Özet
Özet
Ince bağırsak mukoza iki temel yapıdan organize tekrarlayan bir mimari sergiler: villus, bağırsak lümen içine uzanan ve olgun enterocytes goblet hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan; ve submukozası ve muskularis, barındıran yetişkin kök ve progenitör hücreler ve olgun Paneth hücrelerinin proksimaline yanı sıra stromal ve crypt mikroçevresinin bağışıklık hücrelerini ikamet kriptler. Son birkaç yıl öncesine kadar, ince barsak in vitro çalışmalar, iyi huylu veya kötü huylu ya da tümörlerden türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı olan ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. Burada, Sato et al adapte edilmiş bir metot. (2009), C57BL / 6 farelerinden elde edilen primer fare bağırsak kript organoids kültürlenmesi için göstermektedir. Buna ek olarak, biz tedbir gerçek zamanlı crypt metabolik profili tahlil için crypt organoid kültürlerin kullanımını sunmakBazal oksijen tüketimi, glikolitik oranı, ATP üretimi ve solunum kapasitesinin etkin kılar. Organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan özelliklerini korumak ve oksijen tüketimi ve hücre dışı asidifikasyondaki yansıyan onların metabolik adaptasyon yönlerini yitirmemek. Bu crypt organoid kültür sisteminde gerçek zamanlı metabolik çalışmalar crypt organoid enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir araçtır ve nasıl beslenme ve farmakolojik faktörler tarafından modüle edilebilir.
Giriş
Kolorektal kanser (CRC) Amerika Birleşik Devletleri'nde kanser ile ilişkili ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. Sporadik kolon kanseri - yani o yaşamda daha sonra ortaya çıkan (> 50 yaş) ve net bir predispozan genetik faktörler ile - için hesaplar ~ güçlü uzun vadeli beslenme şekilleri 1,2 etkilenir insidansı ile tüm vakaların% 80. Bu tümörler tümör hücre çoğalması 3-5 oranları yüksek izin ve belki de sürücü kısmen (glutaminolysis aracılığıyla) mevcuttur hücresel yapı blokları ve enerji yüksek konsantrasyonlarda yapabilir Warburg etkisi olarak bilinen oksidatif glikoliz bağımlılığı doğru metabolik kayma, sergi . Ince bağırsak kan....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu tavsiyeleri doğrultusunda gerçekleştirildi. Protokol Tıp Albert Einstein College Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. Crypt İzolasyon ve Kültürü
- İnce Barsak gelen Crypts İzolasyonu:
- Ilgi herhangi bir fare modeli bağırsak kriptaları izole eder. Servikal dislokasyon CO 2 ile fareler öldürülür.
- Uzunlamasına karın aç ve buz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su ile, ince bağırsağa (SI) dolgu PBS (-Ca 2+; -MG 2+) 2x antibiyotik-antimikotik (Anti-anti) ile. Hızla ince bağırsağı izole.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kript organoids 8 aylık bir C57BL / 6 farelerinden alınan oluşturulmuştur Beslenme 76A (AIN76A) kemirgen diyeti American Institute of arıtıldı yapıyordu. Bağırsak crypt organoids tek bir crypt (Şekil 1A, tek bir kırmızı ok) Uzun süre kültüründe yetiştirilebilir. Organoids kültürde 18-20 gün içinde (Şekil 1B, kırmızı oklar) kript benzeri yapılar büyür. Kriptler her 3 hafta geçirildi ve organoids verimli bir şekilde her geçmesinin ardından kurtarıldı.
Hippocam.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz bazal hızının ölçülmesi sonra, kript metabolizması oligomycin, karbonil siyanit eklenmesi ile değerlendirildi. Oksijen tüketim oranı (OCR) ve 8 aylık bir fareden izole edilmiş ve organoids eks vivo haline kript hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) test ardışık -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve rotenon.
29 dakika boyunca (Şekil 2A ve 2B) - Bazal OCR ve bazal ECAR 0 kaydedildi. 29. dakikada, (bağlantı noktası A) oligomy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiçbir açıklama bulunmamaktadır.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 ve P3013330 tarafından desteklenmiştir.
Biz crypt izolasyon protokolünün geliştirilmesinde değerli yorumlarınız için Michele Houston, Elena Dhima ve Dr. Anna Velcich teşekkür etmek istiyorum.
Biz de doğrudan ve sırasıyla, Denizatı tesisi işletmek Diyabet Eğitim ve NIH P60DK20541 tarafından desteklenen Tıp Albert Einstein College Araştırma Merkezi ve Dr. Michael Brownlee ve Dr. Xue-Liang Du, teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| BD Matrigel Bodrum Membran Matrisi, GFR, Fenol Kırmızısı içermez, LDEV içermez | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (fosfat tamponlu salin), magnezyum yok, kalsiyum yok, pH 7.2 | Yaşam Teknolojileri | 20012-027 | |
| İleri DMEM/F-12 (1x) | Yaşam Teknolojileri | 12634-028 | |
| Dulbecco ve başbakan; s Modifiye Eagle & Prime; s Glikoz, L-glutamin, fenol kırmızısı, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat içermeyen ortam | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Fenol kırmızı sodyum tuzu | Sigma-Aldrich | P4758 | DMEM'de Nihai Konsantrasyon 15 mg / l (D5030) - adım 2.2.2< / güçlü > |
| Antibiyotik-Antimikotik, 100x, 100 ml | Yaşam Teknolojileri | 15240-062 | Nihai konsantrasyon 1x veya 2x |
| Penicilin-Streptomisin, sıvı | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | Nihai konsantrasyon 1x |
| Gibco® GlutaMAX ve ticaret; ek | Yaşam Teknolojileri | 35050061 | Son konsantrasyon 1x |
| Gibco® HEPES (N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Nihai konsantrasyon 10 mM |
| N-asetil-L-sistein, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Nihai konsantrasyon 1 mM |
| 100x N-2 takviyesi, sıvı | Invitrogen | 17502-048 | Nihai konsantrasyon 1x |
| 50x B-27 & reg; takviye eksi A Vitamini, sıvı | Invitrogen | 12587-010 | Nihai konsantrasyon 1x |
| Rekombinant Fare R-Spondin 1, CF, 50 & mu; g | Ar-Ge D Sistemleri | 3474-RS-050 | Nihai konsantrasyon 500 ng/ml |
| Rekombinant Murin EGF, 100 & mu; g | Peprotech | 315-09 | Nihai konsantrasyon 50 ng/ml |
| Rekombinant Murin Noggin, 20 & mu; g | Peprotech | 250-38 | Nihai konsantrasyon 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutamin, 200 mM | Yaşam Teknolojileri | 25030-081 | Nihai konsantrasyon 2 mM |
| Gibco® glikoz tozu | Yaşam Teknolojileri | 15023-021 | Nihai konsantrasyon 5 mM |
| Ambion® 0,5 M EDTA (etilendiamintetraasetik asit), pH 8,0 | Yaşam Teknolojileri | AM9260G | Nihai konsantrasyon adım 1.1.5 için 3 mM; adım 1.1.8 için 2 mM |
| [header] | |||
| DTT (dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Nihai konsantrasyon 3 mM |
| Sığır serumundan albümin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | %0.1 |
| Life Technologies | 16000-044 | PBS Recovery & trade'de %1 | |
| ; Hücre Kültürü Dondurma Ortamı Yaşam | Teknolojileri | 12648-010 | |
| ROCK inhibitörü (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Nihai konsantrasyon 10 & mu; M: |
| Oligomisin | , Sigma-Aldrich, | O4876 | Nihai konsantrasyon: 1 & mu; M |
| : Karbonil siyanür-p-trifloro-metoksi-fenil-hidrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Nihai konsantrasyon 1 & mu; M |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Nihai konsantrasyon 1 & mu; M |
| Sodyum hidroksit | Sigma-Aldrich | 221465 | nihai konsantrasyon 0.1 N |
| Denizatı Biyobilimi |
Kaynaklar
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
