Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyonun sadece küçük bir kısmını temsil eden, sadece birkaç yüz hücrelerden oluşur. Bu nedenle, genel embriyonik transcriptome tarafından maskelenen kardiyak transcriptome önlemek için, ayrıca analiz için kalpleri yeterli sayıda toplamak için gereklidir. Zebra balığı kalp geliştirme hızla devam Dahası, kalp toplanması ve RNA ekstraksiyonu yöntemleri numunelerin homojen olmasını sağlamak için hızlı olması gerekir. Burada, biz Zebra balığı embriyolarının fonksiyonel / yenerek kalpleri toplamak için hızlı manuel diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu transcriptome analizleri ile bu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) halinde, kalp-özgü gen ekspresyon seviyelerini belirlemek için daha sonra, kalp-özel RNA ekstraksiyonu için bir temel oluşturur. yöntem, diğer dokulara göre zebra balığı embriyonik kalp diferansiyel yapışma özellikleri dayanmaktadır; Bu hızlı laşılmakla sağlarakışkan kesme kuvveti bozulması, aşamalı filtrasyon ve transgenik floresan etiketli kalplerin manuel toplama bir kombinasyonu ile dışı dokusundan kalp ceği ayrılması.
Giriş
Balığı (Danio rerio), yaygın küçük olması nedeniyle ve floresan proteinleri dokuya-özel ifadesi transjenik raportör hatları durumu ile birleştirilmiş olan, hızlı, şeffaf ve rahim dışı embriyonik gelişme, in vivo olarak organogenez çalışma gelişim biyolojisi kullanılır. Bu küçük omurgalı, özellikle de erken Zebra balığı embriyonun oksijenlenme, kalp atışı ve kan akımı dayanmaz çünkü kalp gelişimini incelemek için uygundur; Bu özellikler kardiyovasküler mutantların 1,2 sayıda karakterizasyonu izin ve zebra balığı artık kalp hastalıkları 3 incelemek için yaygın olarak tanınan bir model organizmadır.
Embriyo gelişimi esnasında gen ekspresyonunu incelemek için, transkriptler genellikle tüm montaj in situ melezleşme (VVISH) 4 ile analiz edilmiştir, RT-qPCR 5, mikrodiziler 6, ya da bir sonraki nesil sıralama (RNA Dizi) 7. SüreWISH analiz tüm embriyo olan gen ifadesinin uzamsal ve zamansal analizi, transkript seviyeleri, genellikle, RT-qPCR mikrodizilerdeki ya da RNA-Seq yaklaşımlarla değerlendirilir sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, belirli bir gen ekspresyonu profillemesi doku zenginleştirme gerektirir.
Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyo küçük bir kısmını temsil ettiğinden dolayı, kalp gelişimi sırasında transcriptome çalışmaları diseksiyon ve kalpleri zenginleştirilmesi için bir protokol gerektirir. Buna ek olarak, fizyolojik olarak ilgili veri elde etmek için, bu RNA ekstraksiyonu kadar tam olarak işlevsel kalp dokusunu muhafaza etmek önemlidir. Burada, biz hızla fizyolojik, normal izole ve verimli bir şekilde ileri analizler için yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek için Zebra balığı embriyolarının yüzlerce kalpleri yenerek bir protokol açıklar. Bu yöntem Burns ve MACRAE 2006 8 tarafından bildirilen protokol dayanmaktadır. Kalp dokusunun zenginleşmesi için, her iki yöntem bir transgenik miyokard muhabiri hattını kullanmakve diğer dokulara karşı Zebra balığı embriyonik kalpleri diferansiyel yapışma özelliklerine yararlanmak. Kısaca, dar bir pipet ucu ile yukarı ve aşağı doğru çok sayıda embriyolar pipetleme, kalpler aynı embriyonik gövdelerinden serbest bırakılır ve daha sonra, iki hızlı bir filtreleme adımlarından embriyonik enkaz ayrılır; floresan etiketli kalpler sonra el kalan enkaz sıralanır ve daha fazla işlem için toplanır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol Alman ve Berlin eyalet yasasının hayvan bakım kurallarına şöyle; Zebra balığı işleme hayvan koruma (LaGeSo, Berlin-Brandenburg) yerel otorite tarafından izlendi.
1. Kalp Ekstraksiyon için Zebra balığı Embriyolar Alınması
- Transgenik hat 9 twu34 Kalbe spesifik GFP ile embriyolar elde etmek için: bu tür Tg (EGFP myl7) halinde çapraz kalp raportör zebra balığı.
- İstenilen embriyonik aşamada 10,11 yılına kadar 28.5 ° C'de yumurta suda embriyolar koruyun. Toplanan embriyo nüfus gen ifadesi değişikliklerini sınırlamak için hem genetik ve gelişimsel aşamada homojen olduğundan emin olun.
- Elle embriyolar Dechorionate.
2. Kesme Zebra balığı Embriyonik Kalpler
NOT: buz üzerinde tüm çözümleri tutun. Mümkünse, takım çalışması yapın: Bir kişi emb gelen kalpleri masayaryos başka bir kişi floresan stereomikroskop altında kalpleri sıralar ise. Bu, birkaç saat içinde embriyo yüzlerce işlenmesine olanak tanır.
- 1.5 ml santrifüj tüpüne yaklaşık 100 embriyolar transfer. Tricaine embriyo (E3 ortamı içinde 0.16 mg / ml) anestezisi. Embriyolar açıkça anestezi kez devam edin (onlar yüzmek ve tüpün dibine tortu, ama yürekleri hala yenerek değil).
- Tricaine / E3 çözeltisini çıkarın ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez embriyolar yıkama ve buz üzerinde muhafaza.
NOT: L-15 /% 10 FBS orta kalpleri RNAlater veya Trizol içine devredilmiştir kadar tüm diseksiyon işlemi sırasında canlı organ ve hücreleri tutmak önemlidir. - Sarısı tamamen bozulur kadar Yuvarlak Jel Yükleme İpucu yukarı ve aşağı embriyolar ve pipet 5-8 kez 1 ml L-15 /% 10 FBS orta ekleyin. Embriyolar damla damla çözeltinin yüzeyine açılan patlama böylece pipet veEmbriyolar hafifçe bozulur.
NOT: yukarı pipetle ve aşağı, yani daha pipet geç evrelerde (örneğin 56 hpf) ihtiyaç olduğu, embriyoların gelişim aşamasında bağlıdır edilecek Nasıl şiddetle ve ne sıklıkta embriyolar var. - Çok hafifçe pipetle, bazı kalpleri embriyoların takılı kalabilir çünkü disseke embriyoların ilk parti için, embriyoların bütünlüğünü ve bir stereo mikroskop altında disseke kalpleri oranını değerlendirmek. Buna göre diseksiyon sonraki tur için pipetleme şeklini ayarlayın.
NOT: plastik yapışmasını kalpleri en aza indirmek için düşük tutma pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri kullanın. - 50 ml'lik santrifüj tüpüne yerleştirilen 100 mikron filtre üzerine numuneyi uygulayın; 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile 1.5 mi tüp durulama ve sonra, (bir kupa tüpün duvarlarına yapışmasını olabilir) örnek kaybını en aza indirmek amacıyla, filtreye, bu geçerlidir. 1 ml L, iki kez filtre yıkayın-15/10% FBS. Bu adımda, kalpler filtre içinden geçer ve 50 ml'lik bir tüp içinde toplanmıştır.
- 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilir, 30 mikron filtre üzerine akış yoluyla uygulanır ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez durulayın. Bu ikinci filtrasyon adımında, kalpler filtre muhafaza edilir ve küçük çöp yıkanır.
- Baş aşağı çevirin ve filtreyi 1 ml L-15/10% FBS ile arka arkaya üç yıkar uygulayarak% 1 agaroz kaplı petri içine filtre dışarı kalpleri yıkayın.
- Elle floresan stereomikroskop altında forseps bir çift ile nonfluorescent embriyonik enkaz (örn göz mercekleri) GFP-pozitif kalpleri ayırmak ve yemeğin ortasında onları konsantre. Adım 3'e göre onları toplayın.
NOT: embriyolar daha eski 24 hpf iseniz, kalpler, dayak dokular hala fizyolojik normal olduğunu belirten olmalıdır.
3. Dissec mRNA izoleted Kalpler
- (Buz üzerinde) ve 0.75 ml RNAlater ihtiva eden 1.5 ml'lik bir tüp içine mümkün olan en küçük hacimde kalpleri (örneğin, 10 | il) ve pipet toplayın. Hiçbir kalpler bir floresan stereomikroskop altında görüntüleyerek pipet kalır emin olun.
- Alternatif olarak, bir kimyasal başlık floresan mikroskop hemen yakınında varsa, kimyasal başlık altında Trizol (DİKKAT) toplanır kalpleri aktarmak. Bu pipet ve aynı zamanda kalplerin santrifüj sırasında yapışmasını kalplerin olası kaybını circumvents (3.4, 3.5 ve 3.7 adımları). Trizol ile aynı tüpe izolasyon birkaç tur kalpleri havuzu ve 3.8 adıma doğrudan gitmek; Nihai hacim orijinal Trizol hacminin% 10 geçmemelidir.
NOT: Kullanmadan önce Trizol Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) okuyun. Bir başlık altında Trizol reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Cilt, göz ve clothi ile temastan kaçınınng. Tüm tutuşma kaynaklarını uzaklaştırın. - RNA izolasyonu etkinliği toplanan doku miktarı ile iyileştikçe, (buz üzerinde) RNAlater aynı tüp içine tecrit birkaç tur kalpleri havuzda toplayın. Toplam örnek hacmi, orijinal RNAlater hacminin% 10'unu aşması halinde, (buz üzerinde) depolama için 0.75 ml RNAlater ile ek bir tüp kullanın.
- Kalpleri çökeltmek için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15.700 x g'de örnekleri santrifüjleyin.
- Flöresanlı bir stereomikroskop altında, 3 ml L-15/10% FBS ortamı içeren bir% 1 agaroz kaplı petri içine mümkün olduğu kadar çok dikkatli bir şekilde süpernatan toplamak ama santrifüj tüpünün tabanına tabakalandığı kalpleri rahatsız yoktur. Kalpleri% 15 e kadar bağlı RNAlater yüksek bir viskoziteye sahip süpernatan içinde kalabildiği için aşama 3.7'de tarif edildiği gibi, bunları almak.
- Bir kimyasal Kaputun altında, sedimante kalpleri içeren tüp 0.5 ml Trizol ekleyin ve buz üzerinde tutmak.
- Floresan microsco altındaPE, sulandırmak için 3 ml L-15/10% FBS ile bir% 1 agaroz-kaplanmış çanak içine RNAlater / l-15/10% FBS çözeltisi ihtiva eden,% 1 agaroz-kaplanmış çanak (adım 3.5 den) kalpleri aktarmak RNAlater dışarı. Petri kasesinin ortasına kalpleri toplamak ve kimyasal bir başlık altında Trizol tabakalandığı kalplerin tüp içine, küçük bir hacim içinde aktarın.
- Girdap Trizol kalpleri ihtiva eden 1.5 ml'lik bir tüp kalpleri bozabilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübasyona.
- Bir kimyasal Kaputun altında, 100 ul kloroform (DİKKAT) ekleyin, iyice karıştırın ve (kullanmadan önce maksimum hızda santrifüj 30 sn) 1.5 ml önceden bükülmüş PLG tüp Trizol / kloroform çözüm aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Kullanmadan önce kloroform MSDS okuyunuz. Bir başlık altında kloroform reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Deri, göz ve giysilere dokunmayınız. Alkaliler, metal gibi uzak Uygunsuz maddelerden tutunuz. - Santrifüjge 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15.700 x g'de numune ve yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine, sulu faz aktarılır.
- 5-10 mikrogram glikojen ve izopropanol (-20 ° C'de) soğutulmuş 250 ul ekleyin; iyice karıştırılır ve -20 ° C 'de gece boyunca inkübe edilir.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,700 x g'de santrifüjleyin ve süpernatant atılır.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15.700 x g'de 1 mi% 75 etanol, santrifüj ile pelet yıkayın ve süpernatant atılır.
- Bu (10-15 dakika, örneğin), beyaz hale gelinceye kadar oda sıcaklığında pelet kurutulmasıyla etanol buharlaşmasını olsun.
- Pelet 20 ul RNase içermeyen GKD 2 O ekleyin ve RNA çözmek üzere 55 ° C de 10-15 dakika inkübe edilir; Daha sonra buz üzerinde tutmak.
- Absorbans ölçümü RNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirin. Bir% 1 agaroz jeli üzerinde örneği çalışmadan RNA bütünlüğü değerlendirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sadece miyokardın (. Şekil 1) içinde twu34 transgenik hattı 9, yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eder: Burada, biz zebrabalıkları Tg (GFP myl7) kullanarak bir temsilci kalp diseksiyon deneyi tarif. Biz disseke kalpleri ve kalp numunenin saflığını değerlendirmek için elde edilmiştir hangi embriyolar hem topladı. Kısaca, homozigot Tg (myl7 GFP) twu34 zebra balığı 9, embriyonik kalpleri GFP etiketli ki, vahşi tip ile çaprazlanırlar. Yaklaş...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol gen ifadesi için Zebra balığı Embriyonik kalp dokusunun hızlı zenginleşme analizleri verir. RNA arıtma sadece yeterli çalışır çünkü, kalplerin kaybı protokolü her aşamasında önlenir, ilk numune miktarı büyük ölçüde artırıldı: kardiyak spesifik RNA örnek miktarı ve kalitesi büyük ölçüde bir kaç önemli adımlar bağlıdır başlangıç malzemesi. İkinci olarak, deneyi ile tamamen bağlıdır numune saflığı, sıralama ve sıkı bir şekilde diğer dokuları hariç tutulduğunda petri çanağı içinde kalpleri toplayarak tespit ed...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu saflaştırma protokolünün temel ilkesini ana hatlarıyla belirttikleri için C. Burns'e, C. McRae'ye ve bu yöntemin laboratuvarımızda ilk kez uygulandığı için F. Priller'e teşekkür ederiz. S.A.-Ş. Deutsche Forschungsgemeinschaft'ın (DFG) Heisenberg profesörlüğü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma DFG hibesi SE2016/7-1 ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Balık yetiştirmek ve yumurta toplamak için donatım | ayrıntılar için Zebra Balığı Kitabı11 bakın | ||
| Floresan stereomikroskop | |||
| Soğutmalı Mikrosantrifüj | |||
| UV-Spektrofotometre | örn. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nükleik asit elektroforez odası | |||
| Petri kapları 4 cm Ø, E3 ortamında | |||
| Mikropipetler ve uçlar (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml santrifüj tüpleri | |||
| 15 ml ve 50 ml santrifüj tüpleri | |||
| Dumont #5 forseps | |||
| çiftiExactaCruz ve ticaret; Steril rafta yuvarlak jel yükleme uçları, 1-200 & mu; l | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μ m filtresi (BD Falcon 100 mm Hücre Süzgeci) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ m filtre (Ön Ayırma Filtreleri-30 & mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Faz kilitli jel, ağır, 1.5 ml tüpler ve nbsp; | Prime | 2302810 | |
| Yumurta suyu ortamı | 60 μ g/ml ddH2O'da Anlık Okyanus Deniz Tuzları, %0.00001 (a/h) Metilen Mavisi | ||
| E3 orta | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Trikain (3-amino benzoik asitilester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Trikain stok çözeltisi, pH 7 |
| %1 agaroz (E3 ortamında) | |||
| %1 agaroz jel (TBE tamponunda) | |||
| Leibovitz ve akut; s L-15 orta | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Sığır Serumu) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glikojen ve nbsp; | Invitrogen | 10814-010 | 20 ve mikro; g/&mikro; l RNaz içermeyen su |
| kloroform | |||
| izopropanol | |||
| %75 etanol (DEPC-ddH2O'da) | |||
| Nükleaz içermeyen su veya sterilize edilmiş DEPC ile muamele edilmiş ddH2O | |||
| Elektroforez | |||
| TBE (Tris/Borat/EDTA) tamponu |
Kaynaklar
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
