Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme İn Vivo Optik Görüntüleme

15.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52136

⸱

5 Ocak 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

in vivo görüntüleme için floroforların kullanımı, opsonizasyon, hızlı klirens, düşük saptama hassasiyeti ve konakçı üzerindeki sitotoksik etkiler nedeniyle büyük ölçüde sınırlanabilir. Floroforların lipozomlardaki film hidrasyonu ve ekstrüzyon ile kapsüllenmesi, floresan söndürme ve korumaya yol açar, bu da yüksek algılama hassasiyeti ile in vivo görüntülemeyi mümkün kılar.

Özet

Optik görüntüleme, çok çeşitli tanı yöntemleri sunar ve biyomedikal görüntüleme için bir araç olarak büyük ilgi görmüştür. Şu anda mevcut olan çok sayıda görüntüleme tekniğine ve enstrümantasyondaki ilerlemeye rağmen, in vivo görüntüleme için uygun olan son derece hassas problara hala ihtiyaç vardır. Mevcut preklinik floresan probların tipik bir sorunu, görüntüleme hassasiyetlerini azaltan in vivo hızlı temizlenmeleridir. Hızlı klerensi atlatmak, hedef bölgedeki boya moleküllerinin sayısını artırmak ve böylece arka plan otofloresansını azaltmak, yakın kızılötesi floresan boyanın, lipozomlarda DY-676-COOH'nin kapsüllenmesi ve inflamasyonun in vivo görüntülenmesi için potansiyelinin doğrulanması yapıldı. DY-676, yüksek konsantrasyonlarda kendi kendine sönme özelliği ile bilinir. Önce kendi kendine su verme için uygun konsantrasyonu belirledik ve daha sonra bu su verme konsantrasyonunu PEGile lipozomların sulu iç kısmına kapsülledik. Lipozomların su verme ve aktivasyon potansiyelini doğrulamak için, kapsüllenmiş boyayı etkilemeden lipozomal membranların hasar görmesine yol açan sert bir dondurma yöntemi kullanıyoruz. Yüksek düzeyde floresan söndürme ile karakterize edilen lipozomlar Lip-Q olarak adlandırıldı. Farklı hücre dizileri ile yapılan deneylerle, Lip-Q alımının ağırlıklı olarak fagositoz ile olduğunu ve bunun da fare modellerinde inflamasyonun in vivo görüntülenmesi için bir araç olarak potansiyelinin karakterizasyonunu sağladığını gösterdik. Ayrıca, in vivo inflamasyonun optik görüntülemesinde Lip-Q'nun potansiyelini doğrulamak için farelerde zimozan kaynaklı bir ödem modeli kullanıyoruz. Enflamasyonun neden olduğu gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisine bağlı olası alım göz önüne alındığında, düşük, söndürülmemiş DY-676-COOH (Lip-dQ olarak adlandırılır) ve serbest DY-676-COOH konsantrasyonuna sahip her zaman açık bir lipozom formülasyonu Lip-Q ile karşılaştırıldı hayvan deneylerinde.

Giriş

Lipozomlar, yoğun bir şekilde araştırılmıştır ve klinik uygulamalarda 1,2 en, biyo-uyumlu biyomedikal ilaç verme sistemlerinden biri olarak hizmet edilmiştir. Bunlar ağırlıklı olarak doğal hücre zarlarının bölümleri taklit eden biyolojik olarak uyumlu bileşikler, her ikisi de fosfolipidler ile kolesterol, oluşmaktadır. Hidrofilik maddelerin sulu iç kısım içinde kalan edilebilir iken, lipofilik maddeler, lipozomal fosfolipid çift-katlı 3 içine dahil edilebilir. Lipozomların, sulu iç kısmında maddelerin kapsüllenmesi, in vivo bozulmaya karşı koruma sağlar ve aynı zamanda tümör hücreleri yok etmeyi amaçlayan, örneğin kemoterapi için hastalıkların tedavisi için kullanılan sitotoksik ilaçların toksik etkileri ana sistemi engeller. polietilenglikole gibi polimerler ile lipozomal yüzeyinin modifikasyonu (PEGylation) ayrıca nedeniyle sterik stabilizasyon 4 in vivo lipozomal kan dolaşımı süresini uzatır. Moreover, lipozomlar gibi proteinler 5,6, hidrofil maddeler 7,8 ve enzimler 9 gibi çeşitli maddelerin yüksek konsantrasyonları çekilmek olabilir. Bu nedenle kanser tedavisi 4 doksorubisin gibi sitotoksik ilaçların verilmesi için onların onayını hak güvenilir klinik tedavi ve tanı araçları hizmet vermektedir. Dolayı esneklik, lipozomlar da teşhis ve görüntü kılavuzluğunda cerrahi amaçlı fluorochromes ile yüklenebilir.

Floresan görüntüleme sağlayan bir maliyet-etkin ve ancak, bazı temel gereksinimleri talep in vivo teşhis aracı non-invaziv. Bu, in vivo görüntüleme için en uygun fluorokromun ışık dağılımı ve saçılma yanı sıra sudan kaynaklanan doku otofloresansı ve hemoglobin düşük aralıkta karakteristik absorpsiyon ve emisyon maksimum seviyesine sahip olduğu gösterilebilir. Böylece, bu tür sondalar 650 nm ve 10 900 arasında kendi abs / em maxima var. Opsonizasyon ve hızlı temizleme büyük ölçüde, in vivo görüntüleme 11 için bunların uygulanmasını kısıtlar; gibi bu yanı, in vitro ve in vivo olarak florokromlar stabilitesi çok önemlidir. Bu tür zayıf kararlılık ve düşük hassasiyet ya da indosiyanin yeşilinin (ICG) 12-16 görüldüğü gibi hedef organlarda üzerinde sitotoksik etkiler gibi diğer etkiler, istenmeyen ve in vivo görüntüleme için sondalar tasarlarken dikkate alınması gerekir. Bu gözlemler, birçok ön-klinik NIR florokromlar, nanopartiküller olarak enflamatuar süreçler, kanser, in vivo görüntüleme ve görüntü kılavuzlu ameliyat 17-20 için yeni teknikler aktif gelişmesine yol açmıştır. En klinik öncesi NIRF (yakın kızıl ötesi floresan) stabilitesi rağmen boyalar in vitro karaciğer ve böbrek yoluyla hızlı bir perfüzyon ve temizlik hastalıkları ve inflamatuar süreçlere in vivo optik görüntüleme kullanılmasını engellemektedir.

ntent "> Bu nedenle örneğin florokrom kapsüllenmesi için bir protokol mevcut iyi karakterize yakın kızılötesi lipozomlar içinde oldukça yüksek konsantrasyonlarda 21 kendi kendini söndürme eğiliminden bilinen fluoresan boya DY-676-COOH. Yüksek konsantrasyonlarda H dimer oluşumu ve / veya bir pi-istiflenmesi, flüorofor molekülleri artışı arasındaki düşük bir konsantrasyonda. alan florokrom moleküller arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) birbirlerinin Förster yarıçapı sonucu içinde bulunan florofor molekülleri arasındaki etkileşimi ve böylece bir pi-istifleme etkileşimi önleme ve 'H-dimer oluşumu ve yüksek floresan emisyonu. Yüksek ve düşük konsantrasyonu ve eşlik eden floresans ve aktivasyonu arasında geçiş optik görüntüleme 22 yararlanılabilir gelecek vaat eden bir stratejidir. NIRF boyanın yüksek konsantrasyonlarda Bu bağlamda, sarma Lipozomlar, sulu iç DY-676-COOH daha falıdırserbest boya daha in vivo görüntüleme için vorable. Yöntemin meydan boya yüksek konsantrasyonlarda kapsüllenmesi kaynaklanan faydaların doğrulama, ikincisi doğru kapsülleme tüm ilk ve yatıyor. Boya düşük konsantrasyonlarda olmayan bir söndürüldü lipozom formülasyonu ile ücretsiz boya o ile söndürüldü lipozomlann görüntüleme özelliklerinin karşılaştırılması ve vazgeçilmezdir. Biz lipozomlarda DY-676-COOH söndürme konsantrasyonlarının kapsülleme mümkündür alternatif donma ve çözülme döngüleri ile birlikte basit, ama son derece etkili bir film hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü tarafından gösteriyor. Bu tür ters fazlı buharlaştırma yöntemi 23 olarak etanol enjeksiyon metoduna 24 gibi lipozomlar elde etmek için kullanılan diğer yöntemler, bir çok hidrofilik madde için yüksek bir kapsülleme randımanı olan lipozom preparatı sağlamaktadır. Bununla birlikte, maddenin doğası kapsülleme etkinliğini etkileyebilir haline getirilir. Sonuç olarak,Burada sunulan film, hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü DY-676-COOH enkapsülasyonunda en yüksek verimi ortaya çıkardı. Birkaç saat içinde iltihap işlemlerinin çalışmasına izin verir DY-676-COOH, bir zimosan kaynaklı ödem modelinde, lipozomal kapsülleme yararlarını göstermek için kullanılmıştır. Burada, bu kapsüllenmiş DY-676-COOH konsantrasyonu yüksek olan lipozomlar, serbest boya ya da düşük boya konsantrasyonları olmayan söndürüldü lipozom formülasyonuna göre ateşli süreçlerin ve in vivo optik görüntüleme bütün vücut için daha uygun olduğu gösterilmiştir. Böylece, alt protokol söndürüldü floresan lipozomlar ve in vitro ve in vivo olarak hem aktivasyonu ve görüntüleme potansiyelinin doğrulama üretmek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm işlemler, bölgesel hayvan komitesi tarafından ve hayvanların etik kullanımı ile ilgili uluslararası kurallara uygun olarak onaylanmıştır.

Malzeme ve Araçların 1. Hazırlık

  1. Kendiliğinden oluşan kese dağılımının hazırlanması (SFV)
    1. Aşağıdaki fosfolipidlerin stok çözelti çözülür ve hazırlanması: 214 mg / ml, yumurta fosfatidilkolini (EPC), 134 mg / ml kolesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - [metoksi (polietilen glikol) -2000] (amonyum tuzu) (mPEG 2000 -DSPE) ve 2 mg / ml 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - (7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4 Cam şişeler içinde kloroform ve mağaza il) (amonyum tuzu) (NBD-DOPE).
    2. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, yaklaşık 3 mi kloroform vermek ve EP oluşan lipozomlar elde etmek için yuvarlak dipli bir şişeye fosfolipid stok çözeltisinin uygun hacim transferiC: 3: 0.5 Kol: 6.5 bir mol oranında, mPEG 2000 -DSPE. Lipozomlar çift floresan etiketleme için lipit çözeltisine 0,3 mol% NBD-DOPE ekleyin.
    3. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 55 ° C'de indirgenmiş basınç altında (300 mbar) altında organik fosfolipid çözeltisinden kloroform buharlaştırın.
    4. Homojen bir fosfolipid filmi oluşturulduktan sonra, kalıntı kloroform para çıkarmak için 1-2 saat boyunca 10 mbar basınç azaltır.
    5. Kloroform buharlaştırılır iken, 10 mM Tris tamponu pH 7.4 içinde DY-676-COOH (6,181 uM) çözülür ve sıvı azot ile birlikte bir Dewar kabı doldururlar. Ultrasonik banyoda açınız ve 50 ° C'ye ayarlanmış.
    6. DY-676-COOH (6,181 uM) bir kendiliğinden oluşan kese (SFV) dağılım oluşana kadar kuru fosfolipid filmi ve kuvvetli bir şekilde girdap hidrat yuvarlak tabanlı bir şişeye çözeltinin uygun hacmi (0.5-1 mi) aktarın. Fosfolipidlerin tüm lipit kaybını önlemek için dağınık emin olun.
    7. Dikkatle transfer yuvarlak dipli sıvı azot içine SFV dağılımını içeren şişe ve 3-5 dakika dağılımını dondurma. Daha sonra dağılım çözülme 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde dağılmasını vorteks 50 ° C'de ultrasonik bir banyo içine tabanı yuvarlak bir şişe yerleştirin. Yedi dondurma ve çözülme döngüleri toplam yapım, bu prosedürü altı kez tekrarlayın.
  2. SFV'nin Ekstrüzyon homojen lipozom veziküller oluşturmak için
    1. 1 ml şırınga (enjektör-a) içine SFV dispersiyon aktarın ve şırınga-b bir LiposoFast-Temel ekstrüder kullanılarak 100 nm'lik polikarbonat zardan dispersiyon a'ya.
    2. Geri şırınga-a içine şırınga-b dağılımını a'ya, sonra döngüden on kez tekrarlayın. Nedeniyle ekstrüzyon, zaman ile belirgin bir dispersiyona bulanık bir görünüm şırınga değişir çözelti. On döngüleri (yirmi tek ekstrüzyon adım) cihazdan şırınga-b kaldırmak ve steril içine şırınga doğrudan son kez dağılımını a'ya sonra1.5 ml'lik tepkime tüpü.
  3. Lipozomal saflaştırılması serbest boyadan DY-676-COOH kapsüllü
    1. 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 (kolon uzunluğu 28 cm, çap 0.8 sm), batırılmış G25 boncuklar kullanılarak, bir jel kromatografi kolonu hazırlayın.
    2. Jel matrisi içine örnek drenaj jel yatağa çekilmiş vezikül dağılımı 0.5 ml aktarın ve izin.
    3. 10 mM Tris tamponu pH 7.4 (Şekil 1A) ile lipozomlar Zehir ve sütun tamamen ücretsiz boya drene kadar sütun yıkayın. Ihtiyaç olması halinde, toplamak ve üreticinin talimatlarına göre tuzsuzlaştırma ve dehidrasyon ile ücretsiz boya geri dönüşüm.
    4. Daha sonra 10 steril mM Tris tamponu, pH 7.4 içinde yeterli hacim içinde eritilmek, ultra santrifüje (200,000 x g, 8 ° C 'de 2 saat) ile elüte lipozomlar konsantre edilir.
  4. Kapsüllenmiş DY-676-COOH konsantrasyonunun miktarının belirlenmesi
    1. DY-676-COOH (0, 82, 124 eritilmesi ile bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak,, 10 mM Tris tampon maddesi içinde 247, 494, 988 nM), pH 7.4,% 0.1 Triton X100 ihtiva etmektedir.
    2. Veziküller yok etmek ve kapsüllenmiş boya serbest bırakmak için% 1 Triton X100 içeren 100 ul Tris tamponu içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca lipozomların, 2 ul (50 mmol / lt stokunun, 100 nmol son lipid) içinde çözülür. Daha sonra% 0.1 bir son Triton-X100 konsantrasyonda 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 ile seyreltilmiş numuneleri (h / h) 1 ml'lik bir toplam hacim adrestir. Nüsha halinde tüm örnekleri hazırlayın.
    3. Bir uyarma λ = 645 nm ve emisyon λ = 700 nm emilimi ve emisyon tüm numunelerin (ücretsiz DY-676-COOH ve Triton-X100 tedavi lipozomlar) ölçün. Kurmak ve kapsüllenmiş boyanın konsantrasyonu belirlemek için serbest bir boya kalibrasyon eğrisi kullanır.
  5. Lipozom karakterizasyonu
    1. Dinamik ışık saçılması ile lipozomların boyutları ve zeta potansiyeli belirlemek. Ac steril filtre (0.2 um), 10 mM Tris tamponu, pH 7.4 ile lipozomal örnekleri seyreltin100-300 uM (lipit) olarak oncentration. Düşük hacimli tek kullanımlık bir küvet içinde seyreltilmiş örnekleri aktarın ve üretici talimatlarına göre numune ölçer.
    2. Standart protokollere göre lipozomal veziküllerin boyutu, bütünlüğünü ve homojenliği kanıtlamak için elektron mikroskobu ile lipozomlar karakterize etmektedir.

2. Floresan-söndürme Doğrulama ve Hazırlanmış Liposome'lara Aktivasyon

  1. Floresans ve aktivasyon fiziko kimyasal analizi
    1. Dudak-Q iki 1.5 ml tüpler ve ücretsiz DY-676-COOH için 2 tüpleri hazırlayın. Aktarım, 100 nmol toplam lipitler uygun tüplere (kapsül haline DY-676-COOH 138 ug / ml içeren 42 mmol / L olarak Dudak-S stok çözeltisi 2.38 ul). Dudak-Q boya içeriği (138 ug / 1.000 ul kullanılan Dudak-Q ul x 2.38 örneğin sonuçları 0.38 mikrogram) ücretsiz DY-676-COOH eşdeğer aktarın. Bir küvet inkübe4 ° C 'de her bir prob e ve -80 ° C'de gece boyunca (16 saat), ikinci boru dondurma.
    2. 30 ° C bir ısıtma bloğu ısıtın. Ezilmiş buz ile soğutma kutusu doldurun ve oda sıcaklığına kadar, 10 mM Tris tampon maddesi pH 7.4 bir kısım dengeye getirin.
    3. 4 ° C ila probları çıkarın ve 5 dakika boyunca 30 ° C 'de -80 ° C ila problar (ışıktan korunması için bir alüminyum folyo ile sarılmış) ve hızlı bir şekilde çözülme oda sıcaklığında dengeye getirin. (Ayrıca ışıktan korumak için aliminyum folyoya sarılmıştır), oda sıcaklığında aktarmadan önce 1 dakika boyunca buz üzerinde eritildi probları soğutun.
    4. 100 ul son hacim olması için sondaların her biri için, 10 mM Tris tampon (pH 7.4) ilave edilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bütün sondalar dengeye getirin.
    5. Pipet 80 düşük hacimli cam küvetin içine her sonda ul ve bir spektrometre üzerinde 400-900 nm her sonda emilimini ölçmek. Bunlara karşılık gelen tüplere probu dönün.
    6. Uygun bir cam küvet içinde her bir prob 80 ul transferve 674 nm heyecan verici prob tarafından spektroflorometre floresan emisyon ölçümü ve 694-800 nm floresan ölçüm.
  2. Bir hücresel kabul etme ve floresan aktivasyon
    1. Standart koşullar (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nemlendirilmiş atmosfer içinde) 'e uygun mukabil kültür ortamı aşağıdaki hücre çizgileri almak ve kültür. Burada, mürin makrofaj hücre çizgisi J774A.1 kullanımı (Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı,% 10 (h / h) fetal dana serumu ile takviye edilmiş), insan glioblastoma hücre çizgisi olan U-118 mg (temel vitaminler ve% 10 gliserol içeren MEM (h / h) fetal dana serumu) ve insan fibrosarkoma hücre çizgisi, HT-1080 (% 5 FCS ile RPMI).
    2. Poli-L-lisin ile kaplayın 8 oyuklu bölmeli lamlar (her bir oyuğa 100 ul% 0.001 poli-L-lisin ilave edin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Aspire çözeltisi ve bölmeli lamlar en az 4 için kuruması steril bir tezgah üzerinde oda sıcaklığında saat. odacık slaytları durulayın 3gerekli kadar 200 ul Hank tamponlu salin solüsyonu ile katı daha sonra 4 ° C de parafin, alüminyum folyo ve mağaza ile kapatın.
    3. Odası slaytlar kuruyor iken gerekli kadar, 4 ° C'de lipozomlar ve boya çözüm ve mağaza filtre sterilize.
    4. In vivo, NIR floresan görüntüleme sisteminde tüm vücutla sistemi alım analizi için 3 test hücre çizgilerinin her biri için 5, küçük kültür şişeleri (toplam 15 şişeler) hazırlanması. Tohum, 2 x 10 6 J774A.1 U-118 mg ve (beşe olarak) ilgili kültür ortamına 5 ml kültür şişesi başına HT-1080 hücreleri ve 16-24 saat süre ile büyür. , Kültür şişeleri paralel sırasıyla odası slayt 2 kuyuları her hücre hattı (J774A.1 ve HT-1080) veya 20.000 hücreleri (U-118 mg) 30.000 hücrelerini tohum ve 16-24 saat 500 ul kültür ortamında büyümek .
    5. Bir sonraki gün, hücre hattı başına slaytı üzerinde her bir hücre hattı bir oyuğuna 2 şişelere Dudak-Q, 100 nmol (nihai yağ miktarı) ekleyin.Hemen 1 4 ° C'ye hücre hattı başına şişeyi geri inkübatör ikinci şişeyi aktarmak.
      NOT: odacık slaytlar üzerinde konsantrasyon yapma, prob hacmi şişelere ilave ve oda slaytlar aynı 10 kat daha yüksek (5 ml 500 ul kültür ortamı için). Mikroskobik algılama şişeler hücre topakları görüntülü NUR floresan görüntüleme sistemi daha az duyarlı olduğu için bu gereklidir.
    6. Hücre hattı başına slaytı üzerinde her bir hücre hattı bir oyuğuna 2 şişelerinde hücrelere Dudak-Q boya içeriğinin eşdeğer bir konsantrasyonda serbest DY-676-COOH eklenmekte, daha sonra, hemen hücre çizgisi başına 1 bir balona 4 ° C'de (enerji tüketimi) ve arka inkübatör slaytı ile birlikte başka bir şişeye alın. Karşılık gelen koşullar altında, 24 saat süre ile, tüm hücreleri inkübe edin. prob olmadan şişede hücreler işlemden geçirilmemiş kontrol vermektedir.
  3. NIRF görüntüleme ve yarı-kantitatif analizi
    1. 24 saatlik bir bekletme süresinden sonra, Hanks ile hücreler 2 defa yıkayarak şişelerinde hücreler hasat 500 ul tüplerinde tuz çözeltisi (HBSS), daha sonra santrifüj (200 xg 5 dakika) ile 500 ul HBSS içinde hücreleri ve pelet kazıma tamponlu.
    2. Uyarma (615-665 nm) ve emisyon (> 700 nm olarak kesme) için hücre pelet (ve HBSS) bir NIRF görüntüleyici ve görüntü kullanarak filtreleri tüpleri yerleştirin.
    3. Otofloresans düşeriz ve üretici talimatlarına göre otofloresansı karşı hedefin yoğunluğunu değerlendirmek. Bu ölçümler birbirleri arasında karşılaştırılabilir, böylece pozlama süresi, kamera kazanç, binning ve bit derinliği ölçeklendirme sonra sayım düzeylerini temsil eden ortalama sinyali olarak floresan yoğunluğu (ölçekli sayım / sn), yarı-kantitatif seviyelerini verecektir.
  4. Konfokal mikroskopik analizler
    1. 24 saat inkübasyondan sonra, 500 ul HBSS ile 2 kez yıkayarak odası slaytlar üzerinde hücreleri hasat.
    2. Ce Fix200 ul HBSS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 3.7 (h / h) formaldehid içeren rf.
    3. Fiksasyon devam ederken, DNA leke montaj çözümü ile, Hoechst-33258 01:50 sulandırmak.
    4. Tespit edildikten sonra, daha sonra HBSS ile hücreleri 2 kez yıkayın cam slaytlar gelen odaları ayrı. Kamara slayt kuyulara gelen her yerinde DNA leke içeren 50 ul montaj çözümü ekleyin. RT (karanlık) saydam tırnak cilası ve havada kurumaya 10 dakika boyunca kenarları mühür, cam kapak slipleri ile hücreleri örtün.
    5. Uygun bir floresan mikroskop veya konfokal mikroskop görüntü hücreleri. Çekirdekler (Hoechst-33258: Uyarma 405 nm, emisyon 420-480 nm) karşılık gelen bileşenlerin görünüm için aşağıdaki uyarma ve emisyon ayarlarını kullanın. NBD-DOPE (lipozom, lipid: eksitasyon 488 nm, emisyon 530 nm). DY-676-COOH (NUR floresan boya: Uyarma 633-645 nm, emisyon 650-700 nm).
      NOT: emin olun floresan mikroskop birgurupları yüksek 630 nm'den daha dalga boylarının uyarılma ve emisyon izin uygun filtreler ile donatılmıştır.

3. iltihabın canlı Floresans görüntülenmesi Lipozom temelli

  1. Hayvanlar ve malzemelerin hazırlanması
    1. Ev 8-12 haftalık yiyecek ve su ad libitum ile, standart koşullar altında, yaklaşık 36 g ağırlığında, erkek NMRI fareleri.
    2. Yedi gün önce deney başlamadan önce, doku otoflüoresan azaltmak için tüm fareler düşük pheophorbide diyet verir.
    3. Yirmi dört saat, her bir deney başlamadan önce, arzu edilen alanda, fareler tıraş (örneğin, arka ayak ödemi görüntüleme arzu edildiği takdirde, tüm arka bölge).
    4. Hayvanlar tartılır ve prob miktarını hesaplamak Dudak-Q kullanılan içeriğini boya ağırlık ve ücretsiz DY-676-COOH (eşdeğeri kg başına) 10 ľmol (lipit konsantrasyonda fare (Dudak-Q ve Dudak-dK'un başına enjekte edilecek) .
    5. Resim hayvanlardaHücre pelet için kullanılan aynı ayarlarla bir tüm vücut NUR Floresan görüntüleyici. Bu ölçüm, hayvanların otoflüoresanı içerir.
    6. 1 ml izotonik tuzlu su çözeltisi, 10 mg zimosan-A çözülür ve 4 ° C de bir gece boyunca muhafaza ediniz.
  2. Enflamasyon ve in vivo NIRF görüntüleme İndüksiyon
    1. Aşağıdaki çözümleri içeren fare başına 3 şırınga hazırlayın. 50 ul zimosan-bir (10 mg / ml) ve 50 ul izotonik tuzlu su çözeltisi ile ikinci şırınga ile bir şırınga doldurun. Kontrol hayvanlar için Dudak-Q ve Dudak-dK (10 mmol / kg ağırlık (lipit)) (Dudak-Q gibi konsantrasyon) deney hayvanlarında ve ücretsiz DY-676-COOH için belirlenmiş sayede sondalar, üçüncü şırınga doldurun. Sondalar 150 ul son hacim olması için steril HBSS ile seyreltildi olduğundan emin olun.
    2. (Kuruluğu önlemek ve derinden uykuda kadar% 2 izofluran ile hayvanları uyutmak ve pençeleri üzerinde dokunulduğunda tepki yok etmek için hayvanların gözleri göz kremi uygulayınBu) yaklaşık 2 dakika sürer.
    3. (Hala anestezi altında) sıcak minder üzerinde fareyi yerleştirin ve sağ arka bacağında zimosan-A çözüm deri altına ve sol arka bacak üzerinde tuzlu su çözeltisi enjekte. (T 0 saat = gibi) enjeksiyonu / ölçüm kayıt süresi hemen intravenöz prob enjekte ve daha sonra sonra görüntü hayvan. Görüntü küp olarak ortaya çıkan görüntüleri kaydetmek ve tüm diğer hayvanlar ve ilgili problar için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    4. Görüntü hayvanlar ölçüm odasının aşaması (örneğin, altında sıcak mat koyarak) sıcak olduğundan emin her 10 saat sonrası enjeksiyon için 2 saat ve daha sonra 24 saat sonrası enjeksiyon, hipotermi önlemek için. Her ölçümden sonra, yiyecek ve su ad libitum bir kafese hayvanları yerleştirin ve ılıman bir hayvan odasında kafes yerleştirin. Hayvanlar artık dokunmak tepki kadar, daha sonra, 5-10 dakika boyunca karbon dioksit ile euthanize yapma% 2 izofluran ile ilk anestezi ile hayvanlar EuthanizeEmin hayvanlar tamamen nefes durdurmak ve rigor mortis oluşur.
    5. Standart çevrimiçi değerlendirilebilir protokoller (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) ve görüntü organları göre fareler parçalara ayır.
    6. İlk hayvanlarda (karışmama) (serum fizyolojik ile arka bacak sol) otofloresansı ilgi ve iltihaplı bölgenin hedef floresan (zimosan-A ile sağ arka bacak) sonra atama bölgelerin genel floresan indirilmesiyle üreticinin talimatlarına göre ölçüm sonuçlarını değerlendirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

lipozomlar, sulu iç Burada kullanılan NIRF boya DY676-COOH gibi floresan boyalar yüksek konsantrasyonlarda kapsülleme floresans yüksek bir seviyeye neden olur. Floresan söndürme, yüksek konsantrasyonda birçok floroforlar görülen bir fenomen, hedef alan bir yüksek hassasiyet ve güvenilir algılama talep edilen in vivo görüntüleme uygulamalarında çeşitli istismar edilebilir. Lipozomların kullanımı, aynı zamanda, in vivo uygulamalar için gerekli olan boya koruma sağlar. Lipozomların ayrıntılı bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Lipozomlar aynı zamanda flüoresan boyalar için iletim sistemleri olarak kullanılabilir olduğundan, bunlar hedef hastalıklar görüntüleme sağlar. örneğin NIRF boya, burada kullanılan DY676-COOH, gibi floresan boyalar yüksek konsantrasyonlarda kapsülleme tutulmuş boyanın flüoresan söndürme yüksek düzeyde olur. Floresan söndürme, yüksek konsantrasyonda birçok floroforlar görülen bir olgu hedef alan bir yüksek hassasiyet ve güvenilir algılama talep edilen in vivo görüntüleme uygulamaları, birkaç istismar ed...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 hibe ve RU-1652 / 1-1 ile desteklenmiştir. Biz mükemmel teknik yardım ve destekleri için şirket DYOMICS GmbH, Jena için Doreen Mayıs teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lipozomların
yumurta fospahtidilkolinAvanti Polar Lipids840051PKloroformda çözün ve cam şişelerde saklayın (214 mg / ml)
kolesterolSigmaC8667Kloroformda çözün ve cam şişelerde saklayın (134 mg / ml)
1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu)AvantiPolar Lipids880120PKloroformda çözün ve cam şişelerde saklayın (122 mg / ml)
1,2-dioleoil-sn< / em>-glisero-3-fosfoetanolamin-< > N< / em>-(7-nitro-2-1, 3-benzoksadiazol-4-il) (amonyum tuzu)Avanti Polar Lipids810145PKloroformda çözün ve cam şişelerde saklayın (2 mg/ml
)Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)Sartorius AGResearch RC 210 P, fosfolipidleri tartmak için kullanılır
RotavaporBü chi Labortechnik AGR-114fosfolipid film
WaterbathBü'un hidrasyonu için kullanılır; chi Labortechnik AGR-481fosfolipid film
Vakum Kontrol CihazıBü'un hidrasyonu için kullanılır; chi Labortechnik AGB-720fosfolipid film
VacoboxBü'un hidrasyonu için kullanılır; chi Labortechnik AGB-177fosfolipid filmin hidrasyonu için kullanılır
Sirkülasyon SoğutucuLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230fosfolipid filmin hidrasyonu için kullanılır
DY-676-COOHDyomics GmbH676-0010 mM Tris'te çözün ve stoğu -20 ° C'de saklayın; C
Tris- (Hidroksimetil) -aminometanApplichemA1086tamponu 10 mM, pH 7.4
TriklormetanCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2lipozom hazırlığı için kullanılır
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hlipozom hazırlığı için kullanılır
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)Scientific Industries Inc.Lipozom hazırlama için kullanılanSI-0256
Sephadex G25 medium GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01lipozom saflaştırması için kullanılır
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002lipozomları yok etmek için kullanılır  boya miktar tayini için
LiposoFast-BasicAvestin Inc.lipozomların ekstrüzyonu için kullanılır
Polikarbonat filtre membranı, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membran, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRLiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG ilemiktar tayini için kullanılan
Zetasizer Nano ZSMalvernlipozom boyutu ve zetapotansiyelin belirlenmesi için kullanılır
Ultrasantrifüj Numunelerin konsantrasyonu için kullanılanBeckmann Coulter GmbHXL 80
Numunelerin
Saccharomyces cereviciae'den lipozom ve optik görüntülemenin değerlendirilmesi için malzeme ve ekipmanlarZymosan-A Sigma Z4250-250MG inflamasyonun indüksiyonu için kullanılır
İzotonik Salin (% 0.9)Fresenius GmbHPZN-2159621Zymosan-A
İzofluran buharlaştırıcınınOhmeda Isotec 4hayvanları anestezi yapmak için kullanılır
IsofluraneActavis GmbH PZN-7253744anestezi
Thermo Mat Pro 20 WŞanslı Sürüngen61202-HTP-20anestezi sırasında hayvanları sıcak tutmak için kullanılır
Omnican-F (1 ml enjeksiyon) Probların deri altı ve intravenöz uygulaması için kullanılanBraunPZN-3115465
Panthenol göz kremiJenapharmPZN-3524531anestezi sırasında hayvanların gözlerinin kuruluğunu önlemek için kullanılır
Hanks tamponlu tuzlu su çözeltisiPAA Laboratories /Biochrom AGL2045Mg2+, Ca2+ ve fenol kırmızısı olmadan. Probların seyreltilmesi ve hücrelerin yıkanması için
8 Kuyulu oda slaytlarıBD Biosciences354108hücre kültürü ve ardından mikroskopi için kullanılır;
Hücre kültürü şişeleriGreiner BioOne
Hücre kültürü ortamıGibco (life technologies GmbH)
Fetal buzağı serumu İnvitrojen
Poli-L-Lizin çözeltisi (% 0.01, 50 < ml)SigmaP4832hücre kültürü odası slaytlarını kaplamak için kullanılır,
Mountant PermafluorThermoScientific S21022-3Mikroskopi için montaj çözümü
Hoechst-33258Mikroskopi için AppliChemDNA boyası
Hera-SafeHeraeus Instrumentshücre kültürü için kullanılan steril çalışma tezgahı
HERA hücresiHeraeus InstrumentsHücre kültürü için kullanılan inkübatör
LSM510-MetaZeissKonfokal mikroskopi
için kullanılırMaestro-TM in vivo floresan görüntüleme sistemiCRi, Woburnküçük hayvanların tüm vücut floresan görüntülemesi için kullanılır
Spektrofotometre (Ultrospec 4300 pro UV)Absorpsiyon ölçümü için kullanılanGE Healthcare
Spektroflorometre (Jasco FP-6200)Floresan emisyonu
Animals
NMRI fareleri (8-12 haftalık, erkek)Elevage Janvier, Fransainflamasyon denemeleri için kullanılır
hazırlanması için malzeme ve ekipmanlar , lipozomların ekstrüzyonu için kullanılır Boya konsantrasyonu için kullanılan Rotor Beckmann Coulter GmbH SW 55 TI, seyreltilmesi için kullanılır, , ,, , ölçümü için kullanılan Jasco

Kaynaklar

  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  3. Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
  4. Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
  5. Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
  6. Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
  7. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
  8. Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
  9. Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
  10. Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
  11. Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
  12. Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
  13. Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
  14. Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
  15. Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
  16. Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
  17. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
  18. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  19. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
  20. Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
  21. Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
  22. Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
  23. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
  24. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
  25. Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
  26. New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
  27. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
  28. Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
  29. Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
  30. Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
  31. Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
  32. Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
  33. Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
  34. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14(2005).
  35. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  36. Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
  37. Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
  38. Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
  39. Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
  40. Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
  41. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
  42. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
  43. Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipozomal KapsüllemeYakın Kızılötesi FloresansIn Vivo GörüntülemeFagositik AlımLipid Film HidrasyonuEkstrüzyon SaflaştırmaSpektrometrik ÖlçümlerZymosan Kaynaklı ÖdemPEGillenmiş Lipozomlar
Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme İn Vivo Optik Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.