Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

6.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52205

⸱

5 Şubat 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

Bu makalede

Özet

İnflamatuar demiyelinizan bozuklukların kortikal lezyonlarında demiyelinizasyon ve nöronal apoptoz mekanizmalarını ele almak için farklı hayvan modelleri kullanılır. Biz burada, beyin dilimlerinde oligodendrosit spesifik CD8 + T hücreleri kullanarak, oligodendroglial ve nöronal ölümle sonuçlanan ex vivo bir yaklaşımı tanımladık. Modelin potansiyel uygulamaları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.

Özet

Multipl skleroz (MS) gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda kortikal ve subkortikal gri cevher lezyonlarında oligodendrositlerin ölümü ile nöron ve akson yıkımı tipik histopatolojik bulgulardır. Bu bozukluklarda, miyelin ve oligodendrosit ile ilişkili antijenler için varsayılan özgüllüğe sahip CD8 + T hücreleri bulunur, bu nedenle gri cevher lezyonlarındaki nöronal apoptoz bu hücrelerin bir yan etkisi olabilir. Bahsedilen patofizyolojik süreçlerin altında yatan mekanizmaları incelemek için farklı türde hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, MS'in bazı yönlerini taklit etseler de, "kollateral" nöronal hücre ölümünün kesin mekanizmasını ve zaman seyrini incelemek imkansızdır. Bu kursu ele almak için, burada oligodendrosit yönelimli bir CD8 + T hücresi saldırısını takiben nöronal hasarın mekanizmalarını ve zaman tepkisini incelemek için bir protokol gösteriyoruz. Sadece miyelin kılıfını ve oligodendrositleri hedeflemek için, in vitro aktive oligodendrosit-spesifik CD8 + T-hücreleri akut olarak izole edilmiş beyin dilimlerine aktarılır. Tanımlanmış bir inkübasyon döneminden sonra, miyelin ve nöronal hasar farklı ilgi bölgelerinde analiz edilebilir. Bu modelin potansiyel uygulamaları ve sınırlılıkları tartışılacaktır.

Giriş

Multipl skleroz (MS) geçiren bireylerde gri cevher lezyonlarında oligodendrositlerin ölümü ve miyelin kılıfının tahrip olması, nöron ve akson kaybına eşlik eden tipik patolojik bulgulardır1,2. Kortikal lezyonlar şimdiye kadar subpiyal, intrakortikal ve lökokortikal lezyonlar olmak üzere üç farklı alt tipe ayrılabilir2. Beyaz cevher plaklarıyla karşılaştırıldığında, infiltratlar CD8 + T hücrelerinin baskınlığı ile karakterize edilir, bu da gri madde iltihabında olası belirleyici rollerini düşündürür3. Ayrıca, kan, beyin omurilik sıvısı (BOS) ve enflamatuar lezyonlar içinde oligoklonal genişlemeler, CD8 + T hücrelerinin kendileri içinbulunabilir 4-6.

Buna paralel olarak, CD8+ T hücrelerinin farklı miyelin proteinleri için spesifik olabileceği varsayılmaktadır7,8. Gerçekten de, CD8 + T hücreleri, MHC I ekspresyonunu11 gösteren oligodendrositlerin ve miyelin kılıflarının9,10 yakınında bulunur ve bu nedenle miyelin kılıfının kaybından sorumlu olabilir. Bu süreç genellikle merkezi sinir sistemi (CNS) gri cevheri1,2 içinde geniş "kollateral" nöronal ve aksonal hasar ile birlikte görülür. Aslında, oligodendrositlerin ve nöronların doğrudan ve dolaylı ölümü, CD8 + T hücreleri tarafından iki farklı mekanizma ile indüklenir: (i) perforinlerin ve granzimlerin salınmasını takiben sitotoksik granüllerin oluşumuna bağlı hücre zarı şişmesi ve yırtılması ve (ii) Fas reseptörlerine bağlanma veya yüzeylerinde FasL açığa çıkması8,12,13.

Bahsedilen süreçlerin altında yatan mekanizmayı incelemek için farklı türde hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bu bağlamda, oligodendrositler veya astrositler gibi CNS glial hücrelerinde indüklenmiş ekspresyona sahip otoantijenlere özgü astarlanmış CD8+ T-hücreleri, daha sonra gri cevherde "kollateral" nöronal ve aksonal ölümü analiz etmek için evlat edinilebilir14,15. Bu tür in vivo deneyleri gerçekleştirmek, MS'in bazı patofizyolojik yönlerini taklit etmek için büyük bir yardımcıdır, ancak bu yaklaşım, aksonal hasar ve nöronal apoptozun altında yatan mekanizmayı ve kinetiği çözmek için uygun değildir.

Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için, oligondendrositlere yönelik bir CD8+ T hücresi saldırısını takiben nöronal hücre ölümünün mekanizmalarını ve zaman seyrini incelemek için ex vivo bir yaklaşım oluşturulmuştur. İmmün hücreler tarafından sadece oligodendrositler ve dolayısıyla miyelin kılıf üretiminin hedeflenmesi gerektiğinden, MHC sınıf-I sınırlı, ovalbümin (OVA)-reaktif OT-I Thücreleri kullanılır16. Bu hücreler daha sonra oligodendrositlerde (ODC-OVA fareleri) seçici olarak OVA eksprese eden farelerden elde edilen beyin dilimlerine aktarılır17.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Fareler kullanan tüm deneyler ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi kurallarına uygun olarak yapılmalıdır.

Fare Deneyler için 1. Genel Yorumlar

  1. Patojen içermeyen koşullar altında fareler tutun ve onlara yiyecek ve su ad libitum erişim sağlar.
    NOT: immünolojik desenler yaş ve cinsiyet ile değişebilir çünkü deney gruplarında yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanmak önemlidir.

2. hazırlanması ve Aktivasyon OVA-spesıfik CD8 + T hücreleri (OT-I)

  1. Beyin dilimleri hazırlama 5 gün, aşağıda tarif edildiği gibi OT-I T hücrelerinin uyarılmasını yapın.
    Not: 5 x 10 5 aktive efektör CD8 + OT-I T hücreleri, (CD8 + T hücreleri, MHC-I-molekülleri bağlamında sadece OVA257-264 peptidi tanıyan transgenik farelerin) dilim başına gerekli olan konsantrasyonu 5 x 10 5, deney seçildihücreler aynı zamanda, dilim içine göç ve başlar bir kez iyi bir hücre-hücre etkileşimi lehine optimum olarak müttefik, hücrelerin miktarı tek hücre 8,18 sayma sağlayan bir aşırı reaksiyonunu uyarmak için çok yüksek değil.
  2. OT-I T hücrelerinin kültürlenmesi için ortam hazırlar. % 5 fetal dana serumu (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve 25 ug / ml gentamisin 500 mi DMEM Supplement. Kullanılana kadar 4 ° C 'de orta saklayın.
  3. Referans 16'daki gibi OT-I transgenik farelerin dalak çıkarın. Hazırlanan ortama aktarabilirsiniz.
  4. 5 dakika, 4 ° C 300 xg'de 70 mikron süzgeç ve santrifüj süspansiyon yoluyla dalak ezme yoluyla tek bir hücre süspansiyonu oluşturun.
  5. Kırmızı kan hücreleri lize etmek için 5 dakika boyunca 5 mi amonyum klorür-potasyum (ACK), tampon (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM EDTA, pH 7.3) ile bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
  6. Kuluçkalamadan DurTekrar 10 ml ortam santrifüj o ile ilgili yukarıda tarif edildiği gibi.
  7. Orta hücre süspansiyonu seyreltin ve sayıları hesaplamak. Plaka 3 x 10 7 hücre yoğunluğunda hücre / kuyuda 12-kuyu plaka ve birinci bunları inkübasyon tarafından OVA 257 - 264 (SIINFEKL; 1 nM) ve IL-2 (IL-2), (500 lU / ml) 5 gün.
  8. 4 gün sonra, 500 IU / ml yoğunlukta yeniden IL-2 ilave edin.
  9. Uyarımı takiben, imalatçının talimatları izlenerek bir negatif seçim göre fare CD8 + T hücresi izolasyon kiti kullanılarak hücre süspansiyonundan OT-I T hücrelerinin saflaştırılması. Arıtma CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Sınıf II Ter-119 ve TCRγ karşı bir antikor kokteyli olmayan tüm CD8 + hücrelerinin azalmasına dayanmaktadır / δ daha sonra saflaştırılmış CD8 + T hücrelerinin, yıkama için manyetik sütun kullanarak atılır olan.
    NOT: Bu procedu Kritik adımlaryeniden üretici tarafından gösterilir: bu topakların bulunması yıkama aşaması esnasında sütun bloke çünkü reaksiyon sadece tek hücreler içeren çok önemlidir; Byotin kokteyl ilave edilmeden önce hücre sayımı örnek saflık derecesi için önemlidir ve işlem spesifik antikor bağlantıları en aza indirmek için, buz üzerinde yapılmalıdır.

OT-I T-hücreleri ile Akut Beyin Dilimleri ve Co-kültür 3. Hazırlık

  1. Akut beyin hazırlanmasından önce 19, 200 mM sakaroz, 20 mM PIPES, 2.5 mM KCI, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0.5 CaCl2 ve 10 mM dekstroz ile placedine buz soğukluğunda fizyolojik yemek tuzu çözeltisi hazırlamak dilimler ve yapay serebrospinal akışkan (ACSF) 125 mM NaCI, 2.5 KCl, ile 1.25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 10 mM dekstroz, 2 mM CaCl2,. Usin ile 7,35 her çözeltinin pH ayarlamag NaOH. ACSF pH değerinin ayarlanması önce çözelti,% 95 O2 ve% 5 CO2 karışımı ile kabarcıklar halinde olmalıdır.
  2. Çözüm Öncesi serin.
  3. 8 uyutmak - (10 haftalık fareler gibi, C57Bl% 5.0 izofluran,% 5.0 halotan veya bekleyin ip üzerinden 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazini enjekte kullanarak kontrol veya inhalasyon ile transgenik ODC-OVA fareler 17 gibi / 6 anestezi. anestezi düzeyini değerlendirmek ve bir kerede onları başını kesmek için bir ayak tutam kullanmak ve kurumsal hayvan bakımı göre fareler Euthanize ve ötenazi için komite kriterlerini kullanabilirsiniz.
  4. Ventral pozisyonda fare koyun. Dezenfekte ve sagittal saç derisini kesti. , Sagitally kranial kemik açın, bir kepçe yardımı ile hızlı bir şekilde beyin kaldırmak ve tutkal kullanarak bir vibratome plaka üzerine sabitleyin.
  5. Hazırlanan placedine buz soğukluğunda fizyolojik yemek tuzu çözeltisi ile plaka doldurun.
  6. Vibratome ile 300 mikron koronal dilim kesin.
    NOT: Bu prosedür biliyorumn, en az 8 saat, 19-21 arasında bir zaman aralığı içinde işlevsel hücresel çalışmalar için uygun olan canlı sağlam doku örneklerinin elde edilir. Nitekim, zaten 6 saat sonra başlayan bu süre, sonra, hazırlık azaltılmış kalite, aksiyon potansiyeli üretimi ve yayılması gibi temel ve fonksiyonel özelliklerinde yani değişiklikleri gösterir.
  7. Kesit sonra ACSF ile dolu bir 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hemen bir dilim aktarın.
  8. Dilim başına dikkatli bir şekilde 5 x 10 5 OT-I T hücrelerinin ekleyin.
  9. Bir kuluçka makinesi içinde en fazla 8 saat (37 ° C,% 5 CO2) için dilim inkübe edin.
  10. Kuluçka dönemi, hasat dilimleri ve sonra Ekim bileşik Doku Tek kullanarak onları gömmek ve sıvı azot onları dondurmak. Değerlendirilmesi, örneğin, daha fazla histolojik çalışmalar için -20 ° C 'de nöronal yapı (örneğin, kullanılarak anti-MAPII ya da anti-sinaptofisin antikorlar) ya da apoptozu (saklayın örneğin, bir anti-Kaspaz-3 antikorları, anti-neun anti kullanarakorganları), standart prosedürlere göre yöntem.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Oligodendrosit yönelik CD8 + T hücreleri ile beyin dilimlerindeki inkübasyondan sonra, oligodendrositler olarak nöronlar apoptoz (Şekil 2A ve 1C, sırasıyla) tabi tutulur. Apoptoz histolojik bulgular (örneğin, Kaspaz-3, Tünel) ilk inkübasyon 3 saat sonra tespit edilebilir. Kuluçka dönemi hazırlanması ve tekrarlanabilir sonuçlar iyi kalitesini garanti etmek için uzun 8 saat daha olmamalıdır. Apoptotik hücreler tüm miyelinli alanlarda üstünlüğü ile dilim üzerinde bulunabilir. Yapısal bü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Farklı hayvan modelleri MS gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarının patolojik özellikleri ele son on yıl içinde tarif edilmiştir. In vivo fare hem de sıçan modelleri yaygın bir hastalık patofizyolojik özelliklerini taklit etmek için kullanılır, yani, demiyelinasyon ve remiyelinizasyon işlemlerinin sonuçlarının analizi ve inflamasyon ve nörodejenerasyonda içiçe bölüm. Bununla birlikte, sadece bir ex vivo yaklaşım tam altında yatan mekanizmaları incelemek için izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 - S.G.M. ME3283/2-1 - S.G.M.) ve Yenilikçi Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB ve SGM) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 kuyulu plakaCorning3513
2-MerkaptoetanolGibco31350-010
2-MetilbutanRoth3927.1
70 & mikro; m süzgeçFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500kalsiyum klorür
CD8+-izolasyon kitiMiltenyi Biotech130-090-859
D (+) - glikozMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-02137 & derece sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
EDTA SigmaE5134
FCSPAA LaboratuvarlarıA15-151fetal buzağı serumu
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500potasyum klorür
KHCO3SigmaP9144potasyum hidrojen karbonat
L-GlutaminGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500magnezyum sülfat
NaClSigma31434sodyum klorür
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500sodyum hidrojen fosfat
NaHCO3Merck1.06329.0500sodyum hidrojen karbonat
NaOHMerck1.09137.1000sodyum hidroksit
NH4ClSigma213330amonyum klorür
Esansiyel olmayan amino asitGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbümin
BORULARSigmaP6757
SükrozMerck1.07687.1000
Doku-Tek OCTSakura4583

Kaynaklar

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CD8 T h cresi izolasyonuBeyin kesiti haz rlamamm nofloresan mikroskopiOligodendrosit apoptozuN ronal apoptozT h cresi ko k lt rHistolojik analiz
Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.