Yöntem makalesi

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi In Situ TÜNEL Yöntemiyle

DOI:

10.3791/52211

⸱

16 Aralık 2014

 , 
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu videoda, fare iskelet kasının diseksiyonu, doku işlemesi, kesit alması ve floresan tabanlı TUNEL etiketlemesi açıklanmaktadır. Ayrıca, TUNEL etiketlemesinin yarı otomatik analizi için bir yöntemi de açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) deoksiüridin trifosfat (dUTP) nick ucu etiketleme (TUNEL), hücrelerdeki çift ve tek sarmallı DNA kırılmalarının 3' uçlarına etiketli bir dUTP formunu kovalent olarak bağlamak için TdT enzimini kullanma yöntemidir. DNA hasarını ve hücre ölümünü yerinde tespit etmek için güvenilir ve kullanışlı bir yöntemdir. Bu videoda, fare iskelet kasının diseksiyonu, doku işlemesi, kesitlendirilmesi ve floresan bazlı TUNEL etiketlemesi açıklanmaktadır. Aynı zamanda yarı otomatik TUNEL sinyal niceleme yöntemini de açıklar. Doğal normal doku özellikleri ve doku işleme koşulları, TdT enziminin DNA'yı verimli bir şekilde etiketleme yeteneğini etkiler. Doku işleme, TUNEL sinyal algılamasına müdahale edecek istenmeyen otofloresan da ekleyebilir. Bu nedenle, sonraki kantitasyon için en uygun sinyal-gürültü oranını verecek doku işleme ve TUNEL etiketleme yöntemlerini ampirik olarak belirlemek önemlidir. Burada açıklanan floresan tabanlı tahlil, dijital kanal çıkarma ile otofloresan sinyalini dışlamak için bir yol sağlar. Uygun doku işleme teknikleri ve kontrolleri ile kullanılan TUNEL testi, dokudaki apoptozu tespit etmek için nispeten hızlı, tekrarlanabilir, kantitatif bir yöntemdir. DNA hasarını ve apoptozu patolojik mekanizmalar olarak doğrulamak, etkilenen hücre tiplerini tanımlamak ve in vivo terapötik tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) dUTP 3 bağlamak için TdT enzim kullanılarak işlemidir 'çift ve tek bükümlü DNA 12,23 sonları arasında sona erer. Apoptoz ve DNA hasarının tespiti için TÜNEL metodu ilk Gavrieli ve ark. 1,12,24 tarafından, 20 yıl kadar önce bildirildi. O zamandan beri değerlendirilir ve farklı doku hazırlıkları 7,23,27,40 optimize edilmiştir. TÜNEL nöronlar 6,14,29 ve 43,44 kardiyomiyositlerde ve iskemiye bağlı hücre ölümü, eksitotoksik nöronal hücre ölümünü 30,31 incelemek için kullanılan ve artrit tedavisinde 39 bir biyolojik olarak edilmiştir. Aynı zamanda, çeşitli insan kanserlerinde 2,3,15,32,37,38,42 bir prognostik faktör ve tümör hücre markeri olarak kullanılmıştır.

Alternatif yöntemler DNA hasarı ve hücre ölümü tespiti için var, ama onlar, teknik zorlukları ve uyarılar var. Southern lekeleme quantif için kullanılabilmektedirY bir DNA tam doku lysate'lerin 7,9-11 hasar, ancak bu yöntem hücre düzeyinde çözümlemesi sağlamak ve ölçmek için zor değildir. kuyrukluyıldız tahlil hücrelerinden 4,20,28,36 korunmuş çekirdekleri ayıklanan gerektiren bir alternatif hücre tabanlı bir yöntemdir. Kuyrukluyıldız tahlil kültüre izole hücreler üzerinde iyi çalışır rağmen, iskelet kas dokusunda 8,21 den sağlam çekirdekleri hazırlamak için çok daha zordur. Güney blot gibi, kuyrukluyıldız tahlil bütün kas dokusu homojenattan hücre türüne özgü bilgi vermemektedir. TÜNEL yöntemiyle için başka bir alternatif, tek kordonlu DNA 25,33,41 karşı veya DNA hasarına ve hücre ölümü yolları (örneğin, p53, H2AX ve Kaspaz) 13,17,22,40 katılmak proteinlerine karşı antikorlar kullanılarak immunohistokimyasal olup. Bu gibi antikor bazlı yöntemler, yüksek bir sinyal-arka oranını elde etmek için antikorların tam karakterizasyon ve mükemmel antikor özelliklerini gerektirir. Hatta zaman spectüpte antikorlar antijen alma prosedürleri 34,35 ile hedef proteinin denatürasyon gerektirebilir, mevcuttur. Burada tartışmak gibi, kabul edilemeyecek kadar yüksek otofloresans kas dokusu sonuçlarında antijen alma. Alternatif yöntemlerin aksine, TUNEL basit pozitif ve negatif kontroller, iyi doku penetrasyonu antijeni alma gerektirmez ve hücresel düzey çözünürlük ile test edilebilir bir yüksek sinyal ve düşük arka plan, mükemmel özgüllük ile DNA hasarı algılama ulaşır. Alternatif yöntemler, tipik olarak gece boyunca inkubasyon gerek duyması karşısında ek olarak, TÜNEL metodu, işlemin tamamlanması için yaklaşık 4 saat sürer.

Biz Hsieh-Li ve arkadaşları 16 tarafından oluşturulan spinal müsküler atrofi (SMA) 10 bir fare modelinde iskelet kas hücresi ölümünü incelemek. Kas hücreleri apoptotik ölçmek için, farklı Skele genelinde sağlam çalışır doku hazırlanması, boyama ve kantitatif bir yöntem geliştirdikFarelerde farklı gelişimsel zaman noktalarında tal kas grupları. Biz piyasada mevcut TÜNEL-etiketleme kiti ve ticari olarak satılan görüntü analiz yazılımı kullanmak. Biz de başarıyla omurilik 10 immunofluorescent boyama birlikte TÜNEL tahlili kullandık.

Burada tarif edilen yöntemler, iskelet kası, doku patolojisi, hastalığın mekanizmaları, yaşlanmanın mekanizmasını ve gelişim (uygulama öncesi ve sonrası), hücre ölümünü değerlendirmek isteyen araştırmacılar için yararlıdır. TÜNEL tekniği hücrelerinin sadece bir alt grubu, etkilenen ve hücresel düzeyde çözünürlüğü gereklidir modeli sistemlerinde DNA hasarı tamir ve hücre ölümünün çalışmalar için özellikle yararlıdır.

Bu video diseksiyon, doku işleme, kesit ve fare iskelet kası flüoresan bazlı TÜNEL etiketleme tarif etmektedir. Aynı zamanda, yarı otomatik TÜNEL sinyal sayımı için bir yöntem tarif etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol açıklanan tüm hayvan prosedürleri Sağlık 26 National Institutes Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. protokol (MO13M391) Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Yenidoğan Fare Kurban, Diseksiyon ve Fiksasyon

  1. CO 2 inhalasyon yoluyla bir yenidoğan fare Kurban.
  2. Hemen diz üstünde hindlimb kesti. Yaklaşık doğum sonrası güne kadar 7, bacak kemikleri bir kriostat sonradan bölüm büyük laboratuvar makas veya keskin bıçak ile kesmek için yeterince yumuşak ve.
  3. 15 ml'lik bir tüp içinde, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit, 10 ml hindlimb yerleştirin.
  4. Daldırma 4 ° C'de 4-24 saat paraformaldehid hindlimb düzeltmek. Embriyonik doku sadece birkaç saat gerektirirtespitin s.
    1. Bu TÜNEL deneyi verimliliği azaltabilir gibi, 24 saat daha uzun tespit kaçının.
  5. Sukroz çözeltisi içinde daldırarak hindlimb cryoprotect.
    1. Aynı 15 ml tüp içinde, PBS içinde% 10 sakaroza paraformaldehit değiştirme, 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
    2. PBS içinde% 30 sakroz Change, 4 ° C 'de veya borunun alt arka bacak lavabolar kadar gece boyunca inkübe edilir. Doku sükroz steril olarak filtreden geçirilmiş olması koşuluyla, daha uzun bir süre için% 30 sukroz içinde bırakılabilir.

2. Doku Gömme

  1. Orta gömme ile etiketlenmiş gömme kalıp yarım doldurun.
  2. Bir kalıp duvarına mümkün olduğu kadar yakın kesilmiş yüzü, gömülü maddenin üzerine hindlimb yerleştirin. Kalıbın dışına hindlimb yönünü işaretleyin.
    1. Birkaç arka ayakların göm ve aynı blokta kesti. Ancak, tüm hin sağlamak için önemlidirblokta dlimbs bacak ekseni boyunca seviyeleri eşleşen en bölümleri elde etmek için birbirlerine paralel yönlendirilmiştir.
  3. Orta gömme arka ayakların örtün. Orta dökerken arka ayaklarında vardiya halinde, künt uçlu forseps veya bir kürdan ile yeniden yönlendirin.
  4. En az 15 dakika boyunca oda sıcaklığında doku sızmaya gömme orta izin verin.
  5. Doğrudan kuru buz veya kuru buz üzerinde izopentanın yerleştirin kalıpları orta gömme dondurmak için. Her zaman kalıpları seviyede tutmak ve gömülü doku kaymasını önlemek için emin olun.
  6. Birkaç aya kadar için kesmek için hazır olana kadar -80 ° C'de dondurulmuş kalıpları tutun.

3. Cryosectioning Gömülü Uzuvlar

  1. -20 ° C'ye ayarlayın kriyostat bölme sıcaklığı, -18 ° C malzeme sıcaklığında; Gerekirse aşağı nesne sıcaklığını ayarlamak.
  2. En az 30 dakika boyunca kriyostat bölmesinde içindeki doku bloğu dengelenmesi. Doğru blok sıcaklığıerature bölümü kalitesi için çok önemlidir.
  3. 10 um ya da daha az bir kalınlıkta enine kesitler halinde kesilmiştir. Kalın bölümler tamamen TUNEL reaktif nüfuz olmayacaktır. Anti-roll plaka, bıçak, bıçak ve açısını kullanın (tipik olarak 5 °) kriostat için tavsiye.
  4. Oda sıcaklığında gelatin- veya vectabond kaplı cam lam üzerine bölümleri toplayın. Kuru buz üzerinde bir slayt kutuya hemen yerleştirin. Kol ulaşılabilecek kriostat yakınına yerleştirilen kuru buz ile ayrı bir kapta slayt kutusunu saklayın.
    1. 100-200 mikron atlama, ekstremitenin uzun ekseni boyunca enine seri bölümleri kesin. Her seri seviyesinde en az 3 komşu bölümleri toplayın.

Piyasada Satılan Kit kullanarak Arka ayağın Bölüm 4. TÜNEL Testi (oda sıcaklığında tüm adımları belirtilmediği sürece)

  1. Oda sıcaklığında ve kuru bir gecede ya da hafta sonu bölümleri ile slaytlar çözülme.
  2. Immersin göre bölümleri rehydrateCoplin kavanoz, 2 x 10 dakika boyunca PBS g kayar. Bir laboratuarda Kuru mümkün olduğunca bölüm etrafında kadar sıvı kaldırarak, silin.
  3. Permeabilize bölümler
    1. Olmayan bir proteolitik, saponin tabanlı ticari reaktif veya% 0.5 Tween20 ve% 0.05 PBS Triton X100 birini kullanın.
    2. Bir nem odasına slayt yerleştirin. Yeterli su kutusunun alt kapağı için eklenen basit bir nem odası, sıkı kapaklı boş bir pipet ucu kutusu.
    3. Bölümü kapsayacak şekilde slayt üzerine Pipet yeterli reaktif (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir). Tekrarlanan ajitasyon slayt kaldırın bölümüne neden olabilir, bölüm doğrudan pipetle etmeyin.
    4. Künt uçlu forseps kullanarak, reaktif damla yaymak için bölümün üstüne parafilm küçük bir dikdörtgen koyun ve tamamen bölümü kapsamaktadır. Herhangi kabarcıklar parafilmle altında formu, hafifçe kuru, onu kaldırın ve yeniden.
    5. Permeabili ile slaytlar inkübekapalı bir nem odası içinde 1 saat boyunca yattığı reaktifi. Bölümler slayt kaldırın başlarsanız, permeabilizasyon süresi 30 dakikaya düşürülebilir.
    6. Bir Coplin kavanoz 2 x 5 dakika PBS slaytlar yıkayın. Parafilm dikdörtgenler yukarıda kalması gerekir ve daha sonra çıkarılır ve atılır edilebilir.
    7. Bir laboratuar kullanarak, mümkün olduğunca bölümler etrafında kadar sıvı kurutun wipe.
  4. TdT-aracılı DNA sonu etiketleme
    1. (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir) doku bölümünü kapsayacak şekilde slayt üzerine 1x TdT etiketleme tampon, pipet yeterli etiketleme tampon yapmak için kit talimatlarını izleyin. 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Alternatif olarak, bir coplin kavanoza TdT etiketleme tampon slayt batırmayın.
    2. TdT etiketleme karışımı yapmak için kit talimatlarını izleyin. Kit, kobalt, magnezyum ve manganez katyonları içerir; manganez katyonu iskelet kası, sinir sistemi Tiss de dahil olmak üzere, çeşitli dokuların üzerinde çalışırdaah karaciğer, deri ve kemik.
    3. Bir pozitif kontrol için, TdT etiketleme karışımı DNase (kit etiketli "Nukleaz") ekleyin. Seçenek olarak ise, kiti talimatlarına göre, 37 ° C'de 1 saat boyunca nükleaz tamponu içinde DNase ile pozitif bir kontrol bölümü ön-muamele. Çapraz bulaşmayı önlemek için uzak diğer deneysel bölümlerden DNaz çözüm ve DNaz-tedavi bölümleri tutun.
    4. Bir negatif kontrol için, etiketleme karışımından TdT enzimi atlarsanız.
    5. Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar TdT etiketleme tampon kaldırmak için mendil kullanın. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle TdT etiketleme karışımı, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak, ve 1 saat süre ile 37 ° C'de nem odasında inkübe edilir.
    6. 1x durdurma tamponu yapmak için kit talimatlarını izleyin. Slayt TdT etiketleme karışımını uzaklaştırmak için bir temizleme laboratuar kullanın ve doku kesitinin 200-300 ul durdurma tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Al ternatively, bir Coplin kavanoza durdurma tamponu slayt batırmayın.
    7. PBS slayt 2 x 2 dakika yıkayın. Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar PBS kaldırmak için mendil kullanın.
  5. Floresan etiketleme
    1. DNA kırıkları en dNTPs etiketlemek için floresan etiketleme çözümü hazırlamak için kit talimatlarını izleyin. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle çözeltisi, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak ve 20 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir.
    2. Coplin kavanoza PBS içerisinde 2 dakika süre ile yıkayın kayar. Bir laboratuar slayt mümkün olduğunca PBS kaldırmak için mendil kullanın.
    3. Slayt üzerine 1 mcg / ml PBS ve pipet Hoechst 33258 nükleer leke seyreltin (100-200 ul bölümünü kapsayacak yeterlidir). 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir.
    4. PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    5. Antifade floresan montaj medya ile lamel ve tırnak cilası ile kenarları mühür.
jove_title "> 5. Dijital Görüntü Alma

  1. DAPI, FITC, ve Texas Kırmızı filtreleri (veya eşdeğeri) ile geleneksel floresan mikroskop kullanılarak görüntü elde. Etiketleme başarılı oldu ve çekirdekler (bozulmamış veya parçalanmış) etiketli olduğunu doğrulamak için daha yüksek bir büyütme hedefi (20X veya 40X) kullanın. Bir 10X objektif TÜNEL pozitif puncta ölçülmesi için yeterlidir.
  2. Bir görüntüde kombine üç ayrı yanlış renk kanalları gibi Hoechst boyama, TUNEL boyama ve autofluorescent sinyal görüntüleri toplayın. TÜNEL fluorofor etiketi ve kırmızı filtre, görüntü autofluorescent sinyali, yeşil ise tam tersidir.
    1. Sonraki eşikleme ve kantitatif için slaytlar arasındaki eşdeğer tüm görüntüleme ayarları saklayın. Her filtre, önceden ayarlanmış ve kayıt pozlama süreleri, kazanç ve binning için (hiçbir binning en iyisi); Otomatik pozlama veya kazanç ayarlarını kullanmayın.
    2. En iyi niyet etme aralığını çekeceği pozlama ve kazanç ayarları bulmak için deneme-ve-hata kullanıntüm lekeli slaytlar arasında versiteler. Edinilen görüntülerde hiçbir doymuş piksel bu irade önyargı kantitatif olarak, olmadığından emin olun.
  3. Ilgi tüm kas grubunun görüntüleri çekmek. Bu arada "dikişli" olmak üzere birden çok görüntü gerektirebilir.

6. Görüntü Analizi

  1. TÜNEL boyama dijital görüntülerini analiz etmek piyasada mevcut görüntü analiz programları kullanın. Ticari yazılım kullanarak analiz burada gösterilmektedir. Alternatif olarak, NIH ücretsiz yazılım ImageJ TÜNEL boyama analiz etmek için kullanılabilir.
  2. Hematoksilen ve eosin (H & E) ile TÜNEL-lekeli bölümüne bitişik bir bölüm Leke ve geleneksel aydınlık mikroskop ile tam bölüm dijital görüntü almak. Sayısal olarak anatomik yapıları izlemek için bir anatomi atlası 5,18,19 ile birlikte bu H & E görüntüyü kullanın.
  3. TÜNEL kanalı kapalıyken, elle kullanırken, sayısal alanın anahat izHoechst ve rehberlik için otofloresansı kanalları. Bir maske içine izlenen alana dönüştürmek (seçilen piksel bir dizi analiz edilecek koordinatları).
  4. TÜNEL kanalı açın. Görüntü analiz programı işlevini eşikleme yoğunluğu kullanarak, tüm otofloresans sinyalini dışlamak için alt eşiğini ayarlayın.
  5. Çalışma kümesindeki tüm görüntüleri aynı eşik ayarlarını uygulayın. Maskeler içine eşiklenir seçimleri dönüştürün.
  6. Her görüntü için, kas alanı maskesi ve maske TÜNEL birleştirir. Yeni kombinasyon maskesi sadece takip kas alanı içinde TÜNEL sinyalini temsil edecek.
  7. Nesnelerin sayısını belirlemek ve takip kas alanı içinde TÜNEL sinyali alan nesne kombinasyon maske maske kantitatif gerçekleştirin. ImageJ Parçacık Analyzer işlevini kullanarak bu gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başarılı boyama ile, TÜNEL-pozitif sinyal yoğunluğu eşik ayarlayarak otofloresansı izole etmek yeterince parlak olmalıdır. Düşük büyütme TUNEL-pozitif nesneler iskelet kası (Şekil 1A) olarak parlak düzensiz parçaları görünebilir. Ilgili hücre ölümü türü apoptoz (Şekil 1B) ise, ancak daha yüksek bir büyütmede, klasik apoptotik morfolojisi olan bir TÜNEL pozitif amaçları, takip edilmelidir. pozitif kontrol (DNaz ilave edilir) bölümü (Şekil 1C) tüm dokular arasında düzgün ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yöntem algılamak ve nicel olarak açıklanan fare iskelet kasında DNA hasarı ile ilişkili apoptozu analiz etmek. Prosedür doku hasadı, TUNEL boyama, dijital görüntü alımını ve görüntü analizi içerir. Ortak histolojik malzemeler ve aletler gereklidir, ve özel ticari TÜNEL kiti gereklidir. gerekli temel büyük ekipman öğeleri Kriyostaz, dijital görüntü özelliğine sahip epifluorescent mikroskop ve görüntü analizi için bir bilgisayar sistemi vardır.

deneyci potansiyel tuzaklar farkında olmalıdı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH-NINDS hibesi RO1-NS065895 ve NIH-NINDS hibesi 5-F31-NS076250-02 tarafından desteklenmiştir.

Kriyostatın kullanımı için JHU SOM Mikroskop Tesisine teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfat tamponlu tuzlu su elektron mikroskobunda %4 paraformaldehitSciences19202Burada açıklanan prosedürler için, %4'lük çözelti tozdan taze olarak hazırlandı. Herhangi bir tedarikçiden paraformaldehit kullanılabilir. Hazırlanan formaldehit çözeltisi 4 ° C'de saklanmalıdır; C ve son kullanma tarihinden sonra (birkaç aya kadar) kullanılmamalıdır. Paraformaldehit, solunması ve cilt teması ile kanserojen ve toksindir. Paraformaldehit ile çalışırken lütfen MSDS'de belirtilen önlemleri alın.
SükrozSigmaS0389Dokuyu dondurmadan önce kriyoproteksiyon için kullanılır. Herhangi bir tedarikçiden gelen sükroz kullanılabilir.
O.C.T. bileşiğiTissue-Tek4583Kriyoseksiyon için gömme ortamı.
KriyostatLeicaCM 3050SBurada açıklanan preparatlar için bir Leica CM3050S kriyostat kullanıldı. 10 & mu kesebilen herhangi bir kriyostat; m kesitleri kullanılabilir.
Cam slaytlar, 25 x 75 x 1 mmFisher12-552-3Herhangi bir tedarikçiden slaytlar kullanılabilir.
Jelatin:SigmaG-9391Jelatin, cam slaytlara doku kesiti yapışmasını teşvik etmek için kullanılır. Cam slaytları jelatin ile kaplamak için 2.75 g jelatin ve 0.275 g krom şapı 500 ml damıtılmış suda çözün, 60 ° C'ye kadar ısıtın; C, slaytları birkaç saniye daldırın ve kurumaya bırakın. Herhangi bir tedarikçiden jelatin kullanılabilir. Alternatif olarak, jelatin önceden kaplanmış slaytlar satın alınabilir.
Krom (III) potasyum sülfat dodekahidrat (krom şap)Sigma243361Krom şap, cam slaytlar üzerinde doku yapışmasını desteklemek için jelatin çözeltisine eklenir. Solunması ve cilt teması ile olası bir kanserojen ve toksindir. Krom şapı kullanırken lütfen MSDS'de belirtilen önlemleri alın.
Vectabond doku yapışma reaktifiVector LabsSP-1800Cam slaytlara daha iyi doku yapışması için isteğe bağlı substrat; bunun yerine jelatin kaplı slaytlar kullanılabilir.
Tween20SigmaP9416Dokuyu geçirgen hale getirmek için kullanılan bir deterjandır. Herhangi bir tedarikçiden Tween20 kullanılabilir.
Triton X100SigmaT8787Dokuyu geçirgen hale getirmek için kullanılan bir deterjandır. Herhangi bir tedarikçiden Triton X100 kullanılabilir.
TACS 2 TdT floresan in situ apoptoz tespit kitiTrevigen4812-30-KFloresan bazlı TUNEL etiketleme için ticari kit.
DNase / nükleazTrevigen4812-30-K(kit ile birlikte verilir)
DNase / nükleaz tamponuTrevigen4812-30-K(kit ile birlikte verilir)
10x fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4Amresco780Yıkama ve seyreltmeler için 1x PBS yapın. Herhangi bir tedarikçiden PBS kullanılabilir.
DNaz içermeyen suQuality Biologicals351-029-131Herhangi bir tedarikçiden alınan su kullanılabilir.
Hoechst 33258Sigma94403Nükleer boya. Herhangi bir mavi floresan nükleer boya kullanılabilir. DNA bağlayıcı bir boya olarak Hoechst, şüpheli bir kanserojendir ve cilt temasını en aza indirmek için koruyucu ekipmanla kullanılmalıdır.
Parafilm Mmultiple807Başka herhangi bir hidrofobik film veya lamel kullanılabilir. Birden fazla tedarikçiden temin edilebilir.
Dijital kameralı floresan mikroskop -- --Ayrı kanallarda kırmızı, yeşil ve mavi floresanları dijital olarak yakalayabilen herhangi bir floresan mikroskop kullanılabilir.
Vectashield antifade mediaVector LabsH-1000Herhangi bir tedarikçiden antifade media kullanılabilir.
cam lameller, No.1 kalınlıkBeyin Araştırma Laboratuvarları2222-1Herhangi bir tedarikçiden alınan lameller kullanılabilir. 22 x 22 mm'lik en küçük boyut, yenidoğan fare bacağı bölümleri için yeterlidir.
OjeTed Pella114-8Lamelleri kapatmak için kullanılır. Herhangi bir tedarikçiden (normal perakendeciler dahil) oje kullanılabilir. Floresan görüntüleme sırasında ışığı yansıtabilecek renk veya katkı maddeleri içeren oje kullanmaktan kaçının.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83(2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA Hasar n n TespitiDoku lemeFloresan EtiketlemeSinyal KantitasyonuOtofloresans karmaApoptozis TespitiH cre l m AnaliziIn Situ Analiz

İlgili makaleler