Yöntem makalesi

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

DOI:

10.3791/52228

⸱

23 Kasım 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki fotonlu intravital görüntüleme, dorsal kolon travmatik omurilik ezilme yaralanması olan kemik iliği kimerik bir hayvanda omurilikteki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Travmatik omurilik yaralanması, kan kaynaklı makrofajları ve merkezi sinir sistemi (CNS) yerleşik mikrogliaları içeren inflamatuar bir reaksiyona neden olur. İntra-vital iki foton mikroskobu, canlı hayvandaki omurilik lezyonundaki makrofajların ve mikrogliaların incelenmesini sağlar. Bu, dorsal kolonda travmatik bir yaralanma olan yetişkin hayvanlarda yapılabilir. Burada, yalnızca makrofajların veya mikrogliaların genetik olarak kodlanmış yeşil bir floresan proteini ile etiketlendiği hayvanları elde etmek için bir ışınlama kemik iliği kimerası kullanarak CNS'deki makrofajları mikrogliadan ayırt etme yöntemlerini açıklıyoruz. Ayrıca, omuriliğin dorsal kolonunu ezen ve böylece bir hayvanda laminektomi yoluyla kolayca görselleştirilebilen basit, kolay erişilebilir, dikdörtgen bir lezyon üreten bir yaralanma modelini de tarif ediyoruz. Ayrıca, yaralanmadan sonraki ilk birkaç gün ila haftalar boyunca hücresel etkileşimlerin incelenmesi için anatomik yaralanma bölgesindeki hayvanları sıralı olarak görüntülemek için prosedürleri özetleyeceğiz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

merkezi sinir sistemi (MSS) hastalık veya yaralanma iltihabi reaksiyon kötü, özellikle doku içinde bağışıklık ve yerleşik hücreleri arasındaki etkileşimler açısından, anlaşılmaktadır. Omurilik bu hücresel etkileşimler araştırmalar canlı bir hayvanda özel bir öneme sahiptir. Sadece kolayca erişilebilir MSS beyaz cevher yolu bu mümkün deneysel yaklaşımı geliştirmeye çaba için önemli bir alan yapım, omurilik dorsal sütunlar bulunmaktadır. Bu araştırmalar nedeniyle erişmek ve görüntüleme için MSS stabilize teknik zorluk sınırlı olmuştur. Omurilik Canlı görüntüleme ilk tetkikten sonra birkaç saat ötesinde bir omurilik yaralanması önce, ancak, birkaç çalışma 1-13 ele hücresel hareketi tarif edilmiştir. travmatik omurilik lezyon nöronlar, astrositler, fibroblastlar, NG2 progenitör hücreleri ve bağışıklık hücreleri includi ile, karmaşık bir ortamdırmikroglia, nötrofiller, makrofajlar, T-hücreleri, B hücreleri ve dendritik hücreler 14,15 ng. Makrofajlar dolaşımdan infiltre lezyonda fagositoz sorumlu bağışıklık hücrelerinde, bir alt kümesidir. Bu fagositik hücrelerin rolü bu hücrelerin yaralı dokuda hasar ve koruyucu rolleri hem alabilir belirten raporları ile tartışma konusu olmuştur. Bu roller yaralı hayvan 21,23,24 fonksiyonel açıklarının bir yara alarak fenotip şifa ve azalan bir yaralanma sonrasında sekonder aksonal tepe kurumalarına artan ve bir fagositik bir şekilde 16-22 hareket aralığı.

Daha önce, öncelikle sağlıklı dokuda morfolojisi dayanıyordu mikrogliada gelen makrofajlar ayırt çalışır. Ancak, aktif mikrogliya ve makrofajlar aynı belirteçlerin birçoğu ifade ve bas çalışmak zordur, bu hücrelerin farklı etkinlikler ayrılmasını yapma, yaralanma 25-29 sonra ayırt morfolojisi gösterilecek30 yalnız bu faktörlere ed. Bu yaklaşım, in vivo olarak, bu hücre tiplerinin ayırt edilmesi daha az yararlı olmasına rağmen, bu hücreler, 33,34, akış sitometrisi kullanılarak CD45 ayırıcı ifadesi ile ayrılabilir. Monositler gibi bu belirteçlerin ifadesi dinamik değişimler doğru analiz 35,36 komplike edebilir makrofajlar içine ayırt rağmen mikroglia ve makrofajlar içinde CCR2 ve CX3CR1 ve kullanmak diferansiyel ifadesi de, araştırılmaktadır. Makrofajlar kemik iliği atalarıdır türetilen ve bir hakaret 31,32 sonra yaralı MSS girmek sırasında mikroglia, MSS ikamet bağışıklık hücreleri ve fetal gelişim sırasında sarısı kesesi atalarıdır kaynaklanmaktadır. Bu iki hücre tiplerini ayırt etmek morfoloji kullanarak alternatif bir yaklaşım MSS ikamet korurken, donör atalarıdır türetilen makrofajlar izlenebilir işaretleyici ifade eden bir donör hayvandan atalarıdır ile kemik iliği değiştirmektir, tilki kuyruğutakabilir türetilen mikroglia. Bu kemik iliği kimerik modelleri yaygın pek çok diğer uygulama 37-40 kullanılmaktadır. Bu yöntem, bu nedenle belirli uygulamalardaki kullanımını sınırlamaktadır konakçıda, ilik progenitörlerinden ortadan kaldırmak için, kullanılan ışıma ya da sitotoksik ilaçların neden olduğu kan-beyin engelinin bütünlüğüne hasar ile ilişkili benzeri olmayan uyarılar yer alır. Son zamanlarda, MSS mikroglia ve makrofajlar arasındaki işlevsel farklılıklar flow sitometri, gen çip dizisi analizi ve gelecekte çok yararlı olacağını kimerizm yöntemleri 24,26,41-44 kullanarak ayırt edilmesi başlıyor. Bu iki hücre tipleri ayıran zor olmasına rağmen, kendilerine özgü işlevleri anlamak CNS içinde hem de mikroglianın ve makrofajlar içeren bozuklukların daha hedefli tedaviler yol açan önemlidir.

Spinal kordon hasarı hücresel etkileşimler Açıklaması ilk olarak hücre kültürü modelleri çalışmalardan elde gelmiştir. Bu dcanlı bir hayvanda bir araya görüntüleme spinal kordon hasarı ve bağışıklık hücreleri ile ilgili sorunlara vi. Değişen tipine ve şiddetine spinal kord yaralanması Güncel kemirgen modelleri kontüzyon modelleri 45,46, pin-prick yaralanmalar 2, laserasyon 47, ve burada 16,18,48 açıklanan dorsal kolon ezilme yaralanması bulunmaktadır. Meninkslerde Enflamasyon yaralanma şiddeti artar ve seri görüntüleme için pencere veya cerrahi implantasyon için benzersiz zorluklar oluşturmaktadır. Bu sorunlardan bazıları fagositik hücrelerin infiltrasyonu yanı sıra cerrahi sitesi üzerinden fibröz doku oluşumunu içerir. Dorsal kolon ezilme yaralanması incelemek için buraya yapıldığı gibi, bu konuların bazıları, küçük lezyonlar oluşturmak ve dura ve sonraki yeniden açılması ameliyatı için izin paraspinöz kaslar arasındaki olmayan bağışıklık cerrahi pansuman ile maruz omurilik kapsayan üstesinden gelinebilir . Spin görüntü sadece dorsal kısmı yeteneğikontüzyon modelleri öncelikle sık yaralanma 45,49 sonra özellikle erken zaman noktalarında, sırt sütunların en dorsal kısmını koruyucu, merkez kordon zarar beri el kablosu da, yaralanma seçim sınırlar. Bu nedenle, lezyon içi ve lezyona aksonal konumda kolayca ölçümü için hücre hareketinin gözlenmesi için yararlıdır olan temiz, tekrarlanabilir, dikdörtgen şekilli bir lezyon verir, basit bir yaralanma modeli açıklar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm hayvanların barındırıldığı ve kurumdaki hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) uyarınca kullanılmalıdır. Burada açıklanan tüm işlemler Case Western Reserve Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmıştır.

1. Transgenik Hayvanlar

  1. Aksonlar (Thy-1 YFP H) 50 ve mikroglia / monositler etiket piyasada mevcut floresan muhabiri fareler kullanın (CX3CR1 GFP / GFP 51; malzemelerin listesine bakınız). Bu fareler intercrossed ve kurumsal hayvan bakım politikalarına göre bireysel üreme kolonilerinin olarak muhafaza edilmelidir.

2. Kemik İliği Chimeras

  1. Alıcı hayvan olarak kullanma yaşı en az 8 hafta olan hayvanları tanımlamak.
  2. Hatta, tüm vücut ışınlaması sağlamak için bir konumda fare tutmak için tasarlanmış bir dairesel ışınlama tutan kafeste konak hayvanları yerleştirin.
  3. Bir sezyum üzerine zamanlayıcı ayarlayın (Cs-137) ışınlayıcı bir tüm vücut radyasyon dos yönetmek içinÜreticinin talimatlarına uygun olarak, hayvanlara 800-1.000 Rads yaşı (Burada gösterilen örnekler 980 Rads vardır).
  4. 4 saat en az dinlenmek için kafeslerine hayvanları dönün.
  5. Uygun genotip verici hayvanlar seç iliği projenitör hücrelerin kaynağı olarak (Şekil 2A 'ya bakınız).
    NOT: Uygun donör farklı hücre popülasyonlarının, ya da kontroller aynı genotip birini tanımlamak için ana bilgisayardan farklı soy-spesifik floresan gazetecilere ifade hayvanlardır.
  6. Bir Petri% 70 alkol ile çanak ve 10 ml Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) medya ve medyada batırılmış bir 40 mikron hücre süzgecinden ile ikinci tabak doldurun. RPMI medya ile bir 15 ml konik tüp doldurun. Buz üzerinde yemekleri ve tüp tutun.
  7. Kurumsal kurallarına göre CO 2 boğulma donör hayvanlar Kurban. Tüm kürk ıslak kadar% 70 etanol ile tüm hayvan iliklerine cildi ve kürk temizleyin.
  8. Sk kaldırorta bölümünde etrafında kesme ve tam bacak kaslarını ortaya çıkarmak için arka ayakları üzerinde cildi aşağı doğru çekerek hayvanın alt yarısında gelen.
  9. , Kemik yerinden sonra steril forseps ve makas, kabuğu kullanarak ve tibia her iki ucunda uzak kasları kesmek için diz ekleminde anterior fazla uzaması ile tibia çıkarın. Ortamı içeren bir Petri kabı içinde hücre süzgecinden transfer sonra 30 saniye boyunca bir alkol ile Petri kabındaki kemik yerleştirin.
  10. Kalça eklemini yerinden ve femur bağlı kasları soymaya, alkol femur kısaca yerleştirilir ve daha sonra çanak içinde aynı hücre süzgecinden koyun.
  11. Bir doku kültürü kaputu, kemiklerin her iki ucunu kesti ve kemik ucunu bir 1 ml şırınga üzerindeki bir 21 iğne eklemek için steril makas kullanın. Medya ile 15 ml'lik konik içine iliği yıkayın. Kalan kemikler için prosedürleri tekrarlayın.
  12. 3 ml şırınga pistonu arka kullanarak, ezilme, kemik hücresinde biterpetri üzerinde süzgeç daha fazla hücre elde etmek.
  13. 50 ml konik tüp üstüne filtreyi yerleştirin ve 15 ml konik tüp aspire hücreler ile medya aktarın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere kemik iliği ezmek için, pistonun geri kullanın. 15 ml konik tüp, kemik parçaları ve 50 ml konik bir tüp içine ortam 30 ml hücre süzgecinden yıkayın.
  14. Pelet hücreleri, 500 x g'de 5 dakika boyunca hücreler santrifüjleyin.
  15. Amonyum Klorür-potasyum (ACK) 2 ml ile lizleyin kırmızı kan hücreleri, 2 dakika boyunca liziz tamponunda. % 10 fetal sığır serumu içeren ortamda 10 ml liziz tamponu söndürüldü. 500 xg 5-10 dakika süreyle santrifüj pelet.
  16. Her bir yıkama için pelet haline getirmek üzere, 5-10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj, tuzlu su içinde iki kez RPMI ortamında 10 ml bir kez hücreler yıkanır ve.
  17. Tuzlu su, 200 ul içinde 3 x 10 6 hücre bir nihai konsantrasyona kadar tekrar süspansiyon hücreleri.
  18. IRR kuyruk ven enjeksiyon yoluyla Transferi 3 x 10 6 iliği hücreleriadiated alıcı fareler.
  19. Alıcı kafeste asitleştirilmiş su (pH 3.0), koyun ve fare kurtarmak için izin verir.
    NOT: transplantasyonu sonrası 10-14 gün içinde ölecek başarısız Fareler.
  20. 8 hafta sonra, akış sitometri (Şekil 2B-C) ile periferik kan bağışıklık hücrelerini inceleyerek iliği sulandırılması doğrulayın.

3. Sırt Sütun Crush Yaralanma

NOT: Uygun chimera hayvanları veya istenilen deneye dayalı cerrahi çift transgenik hayvanların seçin. Ya etiketli ikamet veya kemik iliğinden elde edilen hücrelerle Hayvanlar önceki adımlarda oluşturduğunuz bulundu.

  1. Hazırlayın ve rongeurs dahil cerrahi aletleri, otoklav, Dumont # 4 forseps, iris makas, holding dokular, iğne sürücüleri ve yara klipleri için forseps.
  2. Ağrı kontrolü için farelere yönetmek için ilaçlar hazırlayın. Bupernex ve Marcaine yaygın ağrı kontrolü için kullanılır. Gerektiği gibi uygun ilaçlar kullanınnd Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış.
  3. % 4 izofluran ile anestezi øndükle ve min başına 60-100 nefes bir nefes oranını elde etmek için% 1-2 izofluran ile korumak. Anestezi altında kuruluğunu önlemek ve ayak tutam tarafından tepki eksikliği onaylamak için hayvanın gözlerine göz yağlayıcı. Bir ısıtma pedi kullanarak sıcaklığını korumak ve bir rektal prob kullanılarak sıcaklığını izlemek.
  4. Hedeflenen omurilik seviyesinin üzerinde bir elektrikli tıraş makinesi ile fare arka Tıraş ve daha sonra iki kez% 70 alkol takip povidon-iyot ile alanı üç kez çubukla. Steril bir örtü üzerinde hayvan yerleştirin ve cerrahi siteyi görselleştirmek için uygun bir konumda kesilmiş bir delik ile başka bir steril örtü ile hayvan kapak. Ameliyat boyunca steril örtüler üzerinde tüm araçları koruyun.
  5. Hayvan arkasındaki kas maruz iris makas ile istenilen spinal düzeyde orta hat boyunca cildi kesin.
  6. Bir diss altındamikroskop etkilemeden, trapez ve dorsal spinal süreçleri eklemek orta hat boyunca latissimus dorsi ligamanlarında dahil sırt kasları, kesip, ve vertebra sütun maruz.
  7. Belirli vertebra lamina ortaya çıkarmak için vertebra dorsal ve enine süreçleri arasındaki rotator kasları çıkarın (bu durumda T11) kaldırılacak. Bu süreçte üzerine son olmayan yüzen kaburga sokulmasıyla T11 belirleyin.
  8. Kaldırılacak süreci üstünde ve altında uzaya rongeurs ipuçları yerleştirin ve emin onlar omurga zarar çok derin vertebra lamina etrafında yerde güvenli ama yapmak için biraz kaldırın. Tek harekette yakın rongeurs lamina kaldırmak için.
  9. Kalan vertebra küçük parçalarını kaldırmak için rongeurs kullanarak gerektiği gibi laminektomi büyütün.
  10. Bir cetvel karşı tutarak ve kalıcı bir kalem ile işaretleyerek bir 4. forseps ipuçları 1 mm ölçün. Ayırma bahiste 1 mm ölçüncetvel karşı forseps tutarak iki uçlarını ween ve forseps milin üzerine yerine bir lastik forseps halka kaydırarak 1 mm ipuçları maksimum genişliğini düzeltmek.
  11. Omuriliği erişmek için forseps uçları iki ekleme noktasında dura ile 30 iğne takarak küçük bir delik oluşturun.
  12. Işareti dura üzerinde emin, forseps tarafta işaretlenmiş 1 mm derinliğe kadar deliklerden dura bir 90 ° açıyla forseps uçlarını takın. Forseps kapatın ve 10 saniye tutun sıkıştırın. Yayın ve tekrar forseps üç tutan toplam iki kez daha sıkın. Omurilikten forseps çıkarın.
  13. Yaralanma sitesi üzerinden tuzlu ve yerinde emilebilir jelatin sünger sıkıştırılmış bir parça bekletin.
  14. Bir çalışan dikiş kullanarak, # 4 sentetik olmayan emilebilir dikişlerle naylon ile laminektomi üzerinde yer kas ve batırılmış jelatin sünger sütür.
  15. 5 mm'lik yara cli kullanarak yerinde cilt Klipps.
  16. Kas gluteus kas içine 10 ul Marcaine 490 kesi yeri etrafında tuzlu subkutan ul ve 5 ul Bupernex (0.1 mg / kg) (1.0 mg / kg) enjekte edilir.
  17. Hayvan sıcak pad üzerinde kurtarmak ve arka bacaklarda herhangi bir harekette zorluklar veya felç belirtilerini izlemek için izin verin. Tam anestezi kurtarıldı kadar gözetimsiz veya diğer hayvanların varlığında hayvan bırakmayın. Gözlemlenebilir motor açıkları görüntüler herhangi bir hayvan kullanmayın.
    NOT: Bu ezilme lezyon omurilik boyunca herhangi bir düzeyde yapılabilir rağmen, pratikte, T10-L4 nefes ve kelepçeler kullanarak vücut hareketini stabilize göre görüntüleme için daha az teknik zorluklar oluşturmaktadır. Kelepçe yerleştirme torakal düzeyde görüntü göğüs kafesinin etrafında modifiye edilmelidir.

4. Intravital Görüntüleme

  1. Hazırlayın ve doku, iğne d tutmak için Dumont # 4 forseps, iris makas, forseps, cerrahi aletler, otoklavnehirler ve yara klipleri.
  2. Izofluran ile daha önce olduğu gibi fare anestezisi. % 4-5 anestezi øndükle ve dakikada 60-100 nefes bir nefes oranı ve ayak tutam yanıt eksikliği korumak için gerektiği gibi% 1-2 korumak. , Isıtmalı fare tutun görüntüleme değil nefes oranını izlemek ve sürekli bir rektal prob ile hayvan sıcaklığını izlemek.
  3. Alkol daha sonra yara Betadine ile klipleri ve etrafındaki deriyi temizleyin ve üretici talimatlarına göre yara klipleri çıkarın. Yara klipler çıkarıldıktan sonra, gerekirse Nair ile tüylerden ve povidon-iyot ve% 70 alkol ile tekrar siteyi temizleyin.
  4. Makas ile cilt yeniden açın. Kas kalan sütür çıkarın ve gerekirse makasla kesme, forseps ile ayrı kas çekin.
  5. Omurilik üstünde ve altında Lami vertebra bir vertebra düzeyinde enine süreçlerin tarafında makas ile keserek kasın kelepçeleri için bir mikroskop altında, cepler oluşturmaknectomy.
  6. Bu omur her etrafında kelepçeleri yerleştirin ve sıkın. Omuriliği ulaşmak için mikroskop amaç için oda izin gerektiği gibi ayarlayın. Spinal kord görüntüleme platformu paralel olduğundan emin olun ve görüntüleme için doku istikrarı korumak. Solunum artefakt görülürse, görüntüleme alanında hareket aza indirmek için buna göre kelepçeleri yeniden ayarlayın.
  7. Parafilm kelepçeleri örtün.
  8. , Forseps ile omurilikten emilebilir jelatin sünger sıkıştırılmış çıkarın ince de mümkün olduğunca meninkslerden yerinden kadar skar dokusu kaldırarak, mümkün olduğunca çok sayıda parça kapalı alıyorum. Gerekirse Kapak tuzlu ve yeni sünger ile omurilik maruz.
    NOT: Herhangi bir kanama sünger ile sadık ya da gerektiği gibi dağlamak ya, çevredeki kas oluşursa. Ancak, koter ile omurilik dokunmamaya özen gösterin. Dağlama sırasında nemli dokusu veya jelatin sünger sıkıştırılmış bir parça ile ya omuriliği örtün.
  9. Bir wel oluşturunl İlk omurilik sahibinin iki kelepçe ve hayvan taraflar arasında iyi kurmak için diş akrilik kullanarak daha sonra Vetbond ile deri ve doku sızdırmazlık, tarafından daldırma sıvısı tutun. Akrilik tedavileri kadar bekleyin.
  10. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile kuyu doldurun ve cerrahi site çevresinde kanama herhangi tekrar kontrol edin.
  11. İsteğe bağlı bu noktada, görüntüleme sırasında kan damarlarını vurgulamak için kuyruk ven enjeksiyon yoluyla intravenöz floresan gemi boyaları enjekte.
    NOT: kuantum noktaları ve floresan etiketli lektinleri olarak da yararlı gemi boyaları hizmet rağmen 70 kDa üstünde Floresan dekstran sıklıkla kullanılır. 150.000 WM TRITC-dekstran 50 ul, tipik olarak intravenöz yolla enjekte edildi.
  12. Fizyolojik olarak uygun immün hücre motilitesini elde edilmesi için, fare ve sıcaklık 37 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir. Görüntüleme için mikroskop altında bir sıcaklık kontrollü bir ortamda fareyi hareket ettirin ve doğru Anes için hayvan izlemeknefes hızı ve ayak tutam tarafından hipestezi seviyesi. Dakikada 100 nefesten - 60 bir solunum hızı elde etmek amacıyla, anestezi derinliğini belirlemek için görüntüleme sırasında sık sık hayvan izleyin.
  13. Mikroskop mercek aracılığıyla görüntüleme sitesini bulun.
  14. Dinamik görüntüleme verileri elde etmek z-yığın görüntüyü her 30-60 sn almak için 2-foton lazer tarama mikroskobu ayarlayın.
  15. Görüntüleme oturumu tamamlandıktan sonra ısıtılmış kutusundan hayvan kaldırmak.
  16. Spinal kelepçelerini gevşetin ve kelepçeler fareyi çıkarın. Kelepçeler çıkarırken deriden de uzak akrilik çekin.
  17. Fare tekrar görüntüsü gerekiyorsa, omurilik üzerinde tuzlu batırılmış jelatin sünger sıkıştırılmış yerleştirin. Cerrahi sitesi üzerinden kas ve cilt kapatın. Anestezi kurtarma sırasında gözetimsiz bırakmayın hayvan veya diğer hayvanların varlığında yok. Hayvan kurtarma sonra nörolojik belirtisi gösterirse, hayvan ötenazi edilmelidir. Aksi takdirde, euthanizebir CO2 odası içinde fare bu IACUC onaylı ötenazi protokolüne uygun olarak anestezi ortaya çıkmadan önce.
  18. Üreticinin yönergeleri izleyerek görüntü analiz yazılımı kullanarak floresan görüntüleri analiz.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorsal kolon ezmek lezyon gösteren bir şematik Şekil 1A gösterilmiştir. Lezyon sonra hayvan hazırlanır ve spinal kelepçeleri (Şekil 1B) kullanılarak intravital mikroskobiyle için stabilize edildi. Dorsal kolon ezilme yaralanması hemen sonra çekilen bir görüntü açıkça belirtilmektedir forseps tine ekleme noktaları ile açıkça görülebilir dikdörtgen lezyon gösterir. Yara bölgesinde Aksonlar tüm sırt kolonu (Şekil 1C) süresi boyunca ayrılır. kan damarlarının bütünlüğü bozulmadan kalır ve damar Sızıntı hiçbir kanıt floresan sayesinde ispatlanmıştır. Hafta boyunca aynı lezyonun seri görüntüleme gerçekleştirmek için, kaslar ve cilt sonra yeniden maruz kalma laminektomi üzerinde dikilebilir. Benzer lezyon morfolojisi sonra zaman noktalarında (Şekil 1D, E) görülür. 5 gün yaralanma sonrası, forseps ekleme siteleri hala görünür ama lezyon boyutu d artmaya başlamıştırinflamasyon nedeniyle ikincil yaralanma vi. Lezyonun kuyruk ucundaki akson "aksonal geriye doğru kurumaların yaygın" denilen bir işlem yoluyla yaralanma ilk siteden geri gelmiş. Lezyonun rostral sonunda aksonlar Wallerian gibi dejenerasyon (Şekil 1D, E) sergiledi. Gün 5 ve yaralanma sonrası 22 arasında, lezyonun büyüklüğü stabilize. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu hücrelerde (makrofajlar karşı mikroglia) kimlik hazırlanmasında ayırt edilemez, ancak eş zamanlı olarak, CX3CR1 + hücrelerinin büyük bir akışı, ve bu zaman noktalarının sırasında ezilme lezyon çevresinde infiltre görülebilir.

Ezilme lezyon mikro-içinde mikroglia ve makrofajlar davranışını ayırt etmek için, bir ışınım kimera modeli (Şekil 2A'da tarif edilmektedir) kullanılmıştır. İlk olarak, bir CX3CR1 + / GFP fare kemik iliği projenitör hücrelerin florenas özelliğine sahip olmayan verici cel ile değiştirilirls, böylece sadece GFP + MSS-resident mikrogliya floresan görüntüleme görebilir. kemik iliği yeniden etkinliği 8 hafta iliği nakli (Şekil 2B, C) ​​sonra periferal kan incelemesi akış sitometresi ile teyit edilebilir. Şekil 2B, F4 / 80 ve GFP pozitif makrofajlar ise, mavi vurgulanan, hangi bazı GFP negatif ama F4 / 80 olumlu monositler de mevcut, bir CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 kimerik fare tespit edilir. Şekil 2C, herhangi bir çift pozitif F4 / 80 ve GFP pozitif hücrelerinde vahşi tip kemik iliği CX3CR1 + / GFP alıcı kemik iliği değiştirilmesinden sonra bırakılır. Yaralanma önce mikrogliya eşit bir dinlenme, dallanmış morfolojisi (Şekil 2B) görüntüleme, omurilik içinde dağıtılır. 8 gün yaralanmasından sonra, sadece bir kaç mikroglia ve lezyon çevresinde tespit edilebilir. Bu mikroglia bir amoeboid morfolojisi (Şekil 2E) görüntüler. İkinci olarak, kemikBir floresan olmayan fare kemik iliği projenitör hücrelerinin, bu nedenle, kemik iliği CX3CR1 + monositleri / GFP floresan görünür makrofajlar (Şekil 2A) türetilen, bir fazla CX3CR1 + / GFP fare kemik iliği hücreleri ile değiştirilmiştir. Yaralanma önce, sadece GFP + tespit hücreler, kemik iliği kaynaklı ve sürekli olarak düzenli bir şekilde 28 (Şekil 2F) ile teslim olduğu rapor edilmiş olan, büyük ölçüde perivasküler bulunmaktadır. Ezilme yaralanması sonrasında, CX3CR1 + / GFP hücreleri lezyon (Şekil 2H-J) çevreleyen kan damarlarının iç kısmı boyunca görülebilir, ve lezyon merkezi CX3CR1 + / GFP makrofajlar (Şekil 2G) infiltre ile doldurulur.

Dorsal sütunları Zaman atlamalı görüntüleme 6 saat kadar için yapılabilir. Burada dolaşımdan hücreleri görmek mümkündür Şekil 3'te, yaralanmadan sonra hemen olmayan bir kimerik CX3CR1 + / GFP fare göstermektedirn lezyon çekirdeğe doğru kan damarı dışarı hareket ve yaralanma sitesinde (Şekil 3A, B, Ek Film 1) içinde hareket. Makrofajlar (; Ek Film 1 Şekil 3A, B) tarafından alınan yolları izleyebilirsiniz hücreleri tanımlamak için floresan yoğunluğu kullanan Görüntü analizi. Gibi görüntü analizi, elde edilen istatistikler lezyon makrofajların ortalama motilite 3.6 mm / dakika (Şekil 3D) olduğunu göstermektedir. Yaralanma, akson, mikroglialar ve makrofajlar sonra 22 gün hala görüntüleme alanını gösteren lezyon içinde tespit edilebilir nihayet, zaman (Ek Film 2) uzun süreler boyunca stabildir.

figure-results-1
Şekil 1: Yaratılış ve dorsal kolon ezilme yaralanması sıralı görüntüleme. (A), sırtSütun ezilme yaralanması ilgi düzeyinde vertebra dorsal sürecini kaldırarak yapılır. Forseps dışında omurilik 1 mm dorsal sütuna yerleştirilir ve daha sonra mor gösterilen lezyonu üretmek için 3 kez kapalı. (B) Hayvan daha sonra omurilik ile konumlandırılmış intravital görüntüleme için istikrar elde etmek için kelepçeler. (C) Hemen yaralanma sonrası, forseps ekleme siteleri (kırmızı oval) ve dikdörtgen ezilme yaralanması hacmi (gri kutu) açıkça tespit edilebilir. Dorsal kök aksonların (beyaz oklar) yanı sıra, bir lezyon (dolu ok başları) kaudal tarafında akson yaralı uçlara görülebilir. (D) 5 gün yaralanma sonrası, forseps girme mevkilerini (kırmızı, oval ), ve lezyon (gri kutu ölçüde) hala kolayca görülebilir. lezyon ilk hakaret beri boyutu artmıştır. Wallerian gibi dejenerasyon geçiren aksonlar Additi lezyon (açık ok başları) rostralinde görülebilirdorsal kökler (beyaz oklar) ve yaralı akson uçlarında (beyaz ok başları). (E) 22 gün yaralanma sonrası akson üzerine, lezyon site hala 5 gün sonra yaralanma benzer boyutları ile tanımlanabilir. Ve hasarlı alana çevresinde CX3CR1 + hücrelerinin büyük sayısını not edin. Etiketli Özellikler (D) 'de olduğu gibidir. Tüm ölçek çubukları 200 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: kimerik farelerin İnşaat dorsal kolon ezilme lezyon CNS-yerleşik mikroglia veya kemik iliği kökenli makrofajlar ifade CX3CR1 + / GFP izlemek için. (A), CX3CR1 + / GFP ya da mil ifade kimerik farenin üretimi bir şematik diyagramıdırcroglia ya da makrofajlar. İlk olarak, Thy-1 YFP lH farenin ışınlanır ve kemik iliği olan makrofajlar GFP + olan bir kimerik fare ile sonuçlanan bir CX3CR1 + / GFP fareden izole edilen kemik iliği hücreleri ile sulandırılır. İkinci olarak, Thy-1 YFP lH / CX3CR1 + / GFP farelerden ışınlanır ve kemik iliği olan mikroglia GFP + olan bir kimerik fare üreten bir floresan olmayan bir fareden izole edilen kemik iliği hücreleri ile yeniden oluşturulur. (B) veri akış sitometrisi Örnek ışınlanmış, C57BL / 6 alıcıya nakledilen bir CX3CR1 + / GFP kemik iliği verici ile bir kimerik bir hayvandan alınan kan F4 / 80 + ve CX3CR1 GFP + hücreleri ile. Bir C57BL6 bir kimerik hayvanda F4 / 80 + ve CX3CR1 GFP + hücreleri ile veri akış sitometri mavi bir alan öne hem de GFP ve F4 / 80 pozitif olan CX3CR1 pozitif donörlerden elde edilen hücreler gösterilmiştir. (C), Örnek Donör iliği bir ir nakledilenYayılan CX3CR1 + / GFP alıcı. Mavi alan vurgulanan içinde çift pozitif CX3CR1 + / GFP ve F4 / 80 hücrelerinin eksikliği dikkat. (D) birinci kimerik düzeni bir fare bir intravital iki foton mikroskobik anlık, dorsal içinde dallanmış morfolojisi ile GFP + mikroglia gösteren Kolon (ok başı). Bu hücreler dorsal kök ve dorsal sütununda akson (sarı) arasında serpiştirilmiş. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (E) aynı fare Intravital görüntüleme (B) 8 gün dorsal kolon yaralanma süreçleri (ok kafa) eksik olan büyük ve şekilli amoeboid hücre gövdeleri ile bir kaç CX3CR1 + mikroglia ortaya sonra. MSS parankimi içinde yetersiz GFP + makrofajlar gösteren Ölçek çubuğu ikinci kimerik düzeni bir fare = 100 mikron. (F) Fotoğraf (A),. 100 um. 8 gün sırt kolon yaralanmadan sonra (G) (F) 'de, aynı fare intravital görüntüleme al ortaya = Ölçek çubuğuve lezyonun etrafında makrofajların arge akını. Ölçü bar = 100 um. (H), yaralanmamış hayvanda damarları ile temas CX3CR1 + kan kökenli hücrelerden daha yüksek bir büyütme görüntü. Ölçü bar = 30 um. Kabın iç tarafından bakıldığında kabı ile temas halinde CX3CR1 hücrelerinin (I) yeniden oluşturma. Ölçü bar = 30 um. (J), tekne ile temas içindeki CX3CR1 bir hücre yeniden düzenleme, kabın dışarıdan görülebilir. Ölçek çubuğu = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3 :. Hemen dorsal kolon ezmek sonra olmayan bir kimerik CX3CR1 + / GFP fare Temsilcisi hücre izleme verileriyaralanma. (A) hemen dorsal kolon ezilme yaralanması sonrası CX3CR1 + mikroglia ve Katkı Film 1 makrofajlar etrafında hasarlı aksonlar (sarı) bir anlık. (B) (gri) yolları (A) CX3CR1 + hücreleri tarafından alınan bir 110 sırasında dk Intravital görüntüleme oturumu. (C) (B) parçaların bir zaman kodlu gösterimi. Zaman çubuğunda gösterilen parçalar, bütün 110 dakika film içindeki zamana göre renklidir. CX3CR1 + hücrelerin genel motilite (D) Histogram. Tüm ölçek çubukları 30 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Film 1: hemen çift heterozigotlarda dorsal kolon ezilme yaralanması sonrası Temsilcisi intravital film Thy-1 YFP / + GFP / + fare. Intravital spinal görüntüleme T11 seviyesinde dorsal kolon ezilme yaralanması hemen sonra yapıldı. Sağ paneli CX3CR1 + mikrogliya ve makrofajlar hareketini gösterir. Hücre hareketinin yolları sol panelinde beyaz parça olarak gösterilmiştir. yaralanma sol üst köşesine yer almaktadır. CX3CR1 + hücreleri, bu raylar boyunca yaralanma bölgesinde doğru hareket görülebilir. Aksonlar sarı gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 40 mikron =. Toplam süre: 110 dak. Çalma hızı: 300x.

Ek Movie 2:. Çift heterozigot Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + fare dorsal kolon ezilme lezyon sonra 22 gün Temsilcisi intravital film burada gösterilen 22 gün ilk dorsal kolon ezmek sonra bir fare alınan bir temsilci film Spinal düzeyde T11 de yaralanması. enjUry çerçevenin sağ üst köşesinde yer almaktadır. Aksonlar (sarı) artan rostrally sağ alt köşesinde gösterilir. dorsal ven ve kan damarları (kırmızı) TRITC-dekstran ile etiketli. Hemen yaralanma sonrası kıyasla daha yavaş bir hızda hareket lezyon içinde CX3CR1 + hücreler. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Toplam süre: 90 dk. Çalma hızı: 600x.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerçek zamanlı olarak patolojiyi izleyen sırasında kendi doğal doku bölümlerinde farklı hücre tiplerinin Görüntüleme etkileşimleri büyük ilgi yarattı. MSS, hücre-hücre teması yoğun ağ içinde ve komşu hücrelerle sinyal normal fonksiyon ve MSS patolojiyi anlamak için gereklidir. Burada, spinal kord mekanik lezyon içinde hücresel hareketin gözlem için 2-foton lazer tarama mikroskobu kullanımı nitelendirdi. Cerrahi ve doku hazırlık kalitesinin yanı sıra, doku mekanik stabilite başarılı time-lapse mikroskobu, hareket objeyi nefes spinal kord özellikle izolasyonu için her şeyden önemlidir. Stabilite hayvanın kalp atış hızı ve solunum tekabül eden bir mikroskop altında, omurilik hareketi için ideal ile değerlendirilebilir. Cerrahi performans ve ayrıca görüntüleme başlamadan hemen önce ise Kararlılık hem değerlendirilmelidir. Anima Eğerl ayarlamaları omurilik kelepçeler yerleştirme ve gerginlik yapılmalıdır, istikrarlı değildir. Kemik iliği kimera yaklaşımları ile birlikte hücre tipi özel flüoresan raportör fare modelleri mikroglia ve akson karşı monositik hücrelerin tanımlanmasına izin vermiştir. Önceki çalışmalar, kan türevi monositler ve mikroglia burada 43 tarif metodoloji kullanılarak travma sonrası ikincil akson hasar için sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Dextran'ın konjuge damar boya hem işaretlerini sağlamak ve damar bütünlüğü ihlalleri tespit etmek damar tanımlama sağlar. Uygun flüoresan raportör fare modelinde seçimi arzu edilen hücre tipleri uygun bir şekilde tanımlanması görüntülü izin vermek için çok önemlidir.

Üstlenilen çalışmalar için uygun floresan fare modellerinin geliştirilmesi de deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. CX3CR1 + / GFP iki fagositik nüfus ayırt MSS hücreleri geleneksel zor olmuştur. Burada gösterildiği gibi, ortak bir immünolojik teknik, ışınlama kimeralar, kemik iliği türevli makrofajlar radyo dayanıklı, merkezi sinir sistemi yerleşik mikroglia ayırmak için kullanılabilir. ışınlama işlemi hücre fenotipleri kan beyin bariyerini zarar ve değiştirme potansiyeline sahiptir, bu nedenle bu modelin kullanımı dikkatle düşünülmelidir. Bu değişikliklerin ölçüde radyasyon dozu hem de geri kazanım dönemi süresi farklıdır ve farklı ateşli modelleri üzerindeki etkisi tam olarak incelenmemiştir. merkezi sinir sistemi, kan-beyin bariyeri ile ışınlama etkileri uygulama sırasında kafa koruyucu ile minimize edilebilir ve bu, omurilik, doğrudan 52 korunmamış olsa bile, aydınlatmadan sonra, omurilik içine, hücre sızmasını azaltmak için gösterilmiştir. Burada kimera oluşmasının bir sonucu olarak kalıcı halde CNS'ye nüfuz eden hücre sayısı uyuşmuş aksine önemsiz olduğunu gözlemiştirlezyon giren hücrelerin er. Dikkate diğer alternatif modeller ilaca bağlı kimeralar 52 veya Parabiyotik fare modelleri 53 içermektedir.

Burada, biz 2-foton mikroskopi kullanılarak görüntü kolay omurilik dorsal beyaz cevherde bir lezyon ile sonuçlanan, belirli basit ve tekrarlanabilir küçük yaralanma modeli sunduk. Bu yöntem aynı zamanda literatürde tamamlayıcı sabit doku analizi 16,18,43,48,54 ile birleştiğinde olmuştur dorsal sütunları aksonal kurumaları derecesini tahlil için ölçülebilir lezyon sağlar. Bu modelde, hayvanlar sadece asgari açıkları görüntülemek ve yaralanma sonrası özel bakım gerektirir. Burada anlatılan dorsal kolon ezilme yaralanması ve görüntüleme teknikleri kullanılarak gelecekteki çalışmalar spinal kord yaralanması tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için güçlü tarama araçları olabilir. Bu tedaviler, küçük molekül inhibitörleri, ilaçlar, hücre ürünleri, doku greftleri ve kombinasyon tedavisi bulunabilirs. makrofajlar, mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşim ayrıca, çoklu skleroz, tümör, menenjit ve amiyotrofik lateral skleroz, omurilik diğer hastalık modellerinde, bir rol oynaması olasıdır ve bu teknik de bu hastalıkların incelenmesinde yararlı olabilir .

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki ajanslar bu çalışma için kritik finansman desteği sağladı: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Vakfı (A.Y.H.), St. Baldrick's Vakfı (A.Y.H.), Alex's Limonata Standı Vakfı (A.Y.H.), Gabrielle's Angel Vakfı (A.Y.H.) ve Hyundai Gezici Umut Programı (A.Y.H.). Yazarlar, Jerry Silver ve Sarah Busch'un Dorsal Column Crush (DCC) yaralanmasını öğrenmedeki vazgeçilmez yardımları için minnettarlar. Yazarlar ayrıca genotipleme konusunda teknik yardım için Jingquang You, Elisabeth Hare ve Hongmei Hu'ya ve spinal stabilizasyon ünitesini monte etmek için Ross Anderson'a minnettardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CX3CR1 GFP fareleriJackson laboratuvarları5582
Thy-1 YFP H fareleriJackson laboratuvarları3782
Fare turtası kafesiBraintree ScientificMPC 2 seti
60 mm 2< / sup> Petri kabıCorning430166Kemik iliği izolasyonu için
Falcon 40 & mu; m hücre filtresiFisher Scientific08-771-1Kemik iliği izolasyonu için
1 x 15 ml ve 1 x 50 ml konik tüpFisher ScientificKemik iliği izolasyonu için
21 gauge iğneBD305177Kemik iliği izolasyonu için
1 ml şırıngaBD309628Kemik iliği izolasyonu için
ACK lizis tamponuGibcoA10492-01Kemik için kemik iliği izolasyonu
HBSSCorning Cellgro21-022-CVKemik iliği izolasyonu için
RPMI ortamıSigmaR8758Kemik iliği izolasyonu için
F4/80 antikoruEbioscience12-4801 PEKimeraların FACS doğrulaması için
30 gauge insülin şırıngasıBD328280Kuyruk damar enjeksiyonu için
Omurilik KelepçeleriNarshingeSTS-AGörüntüleme için
Ortho-Jet Dental Akrilik tozLang DentalREF1320Görüntüleme için
Ortho-Jet Dental Akrilik sıvıLang DentalREF1404Görüntüleme için
Jelköpük jelatin süngerlerPfizer9034201Görüntüleme için
4-0 Ethilon sütürlerEthilon1667GAmeliyat için
Refleks Klipsler, 7 mmKent ScientificINS750344Ameliyat için. Kullanmadan önce sterilize edin
İris MakasGüzel Bilim Araçları14061-09Ameliyat için
45/5 Forseps, Dumoxelİnce Bilim Araçları11251-35Ameliyat için
RongeursGüzel Bilim Araçları16021-14Ameliyat için
30 gauge iğneBD305106Dura Forceps'ta erişim delikleri açmak için
Dumont #4 Biyoloji ipuçlarıDumont11242-40Ameliyat için
İğne SürücüleriGüzel Bilim Araçları12002-12Ameliyat için
Michel Yara Klipsi ForsepsKent ScientificINS700753Ameliyat için
Yara klipsi çıkarıcıGüzel Bilim Araçları12033-00Ameliyat için
Forseps için O-ringlerGüzel Bilim Araçları11200-00Ameliyat için, Genellikle # 4 forseps ile sağlanır, ayrıca ayrıca sipariş edilebilir
Akülü Şarj Edilebilir Hayvan düzelticiWahlSerisi 8900ameliyat için
Vetbond3M1469SBAmeliyat için
Betadine Çözeltisi (%10 Sağlam-İyot Topikal Çözeltisi)Purdue Products L.P.NDC 67618-150-08Ameliyat için
Nair Saç çıkarıcı losyonKilise & Dwight Co., Inc.NRSL-22329-05Ameliyat için
İzofluranButler ScheinNDC 11695-6776-2İlaçlar – ameliyat için
MarcaineHenry ScheinNDC 0409-1587-50İlaçlar – ameliyat için deri altından verilen 1.0 mg / kg
BupernexHenry Schein121-7793İlaçlar – ameliyat için buprenorfin 0.1 mg / kg
aCSFSigma'dan kimyasallar119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2P4
1.3 mM MgCl2
10 mM glikoz		Ameliyat için
Cold Spring Harbor Protokollerinden
TRITC-dekstran 150.000 MWSigmaT1287Damar sistemini etiketlemek için intravenöz uygulama için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  2. Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
  3. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760(2012).
  4. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
  5. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  6. Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081(2013).
  7. Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
  8. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
  9. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
  10. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  11. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
  12. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  13. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
  14. Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
  15. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  16. Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
  17. Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
  18. Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
  19. Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
  20. Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
  21. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
  22. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113(2009).
  25. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  26. Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
  27. Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
  28. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  29. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  30. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
  31. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  32. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  33. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  34. Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
  35. Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693(2010).
  36. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  37. Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
  38. Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
  39. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  40. Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208(2012).
  41. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  42. Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89(2012).
  43. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
  44. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  45. Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
  46. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
  47. Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030(2013).
  48. Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
  49. Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021(2010).
  50. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  51. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  52. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  53. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544(2013).
  54. Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Omurilik YaralanmasMikroglia MakrofajlarKemik li i Kimeraski Fotonlu MikroskopiFloresan EtiketlemeOmurilik StabilizasyonuH cresel Etkile im AnaliziGFP Reporter Fareler

İlgili makaleler