Yöntem makalesi

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

19.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52313

⸱

5 Aralık 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 2Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame

Bu makalede

Özet

Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre çizgileri, 3D hücre kültürleri, biyolojik araştırmaları için değerli bir model olarak yetiştirilebilir. Bu protokol numune hazırlama platformu gelişmeler de dahil olmak üzere 3D hücre kültürleri, kütle spektrometresi görüntüleme açıklanır. Bu protokolün amacı kütle spektrometresi görüntüleme analizi için 3D hücre kültürleri hazırlamak için kullanıcılardan etmektir.

Özet

Üç boyutlu hücre kültürleri, biyolojik araştırmalar için çekici modellerdir. Hücre kültürünün esnekliğini ve maliyet etkinliğini, dokunun uzamsal ve moleküler karmaşıklığının bir kısmı ile birleştirirler. Örneğin, birçok hücre hattı, uygun in vitro koşullar verildiğinde 3 boyutlu yapılar oluşturur. Kolon kanseri hücre hatları, avasküler tümör nodüllerinin in vitro taklitleri olan 3D hücre kültürü sferoidlerini oluşturur. İmmünohistokimya ve diğer klasik görüntüleme yöntemleri spesifik analitlerin dağılımını izlemek için popüler olsa da, kütle spektrometrik görüntüleme molekül sınıflarının dağılımını tarafsız bir şekilde inceler. MALDI kütle spektrometrik görüntüleme başlangıçta insanlardan veya hayvan modellerinden elde edilen numuneleri sorgulamak için geliştirilmiş olsa da, bu rapor, numune hazırlama stratejilerindeki iyileştirmeler de dahil olmak üzere in vitro üç boyutlu hücre kültürlerinin analizini açıklamaktadır. Burada, matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-kütle spektrometresi (MALDI-MS) görüntüleme yoluyla 3D hücre kültürlerinin büyümesi, hasat edilmesi, kesitlenmesi, yıkanması ve analizi için yöntemler açıklanmaktadır. Kolon karsinomu 3D hücre kültürlerini bir model sistem olarak kullanan bu protokol, MALDI-MSI ile 3D hücre kültürü sistemi boyunca analitleri tarafsız bir şekilde izleme yeteneğini göstermektedir.

Giriş

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI), moleküler türlerin ilgilenilen örnekler arasındaki dağılımını incelemek için güçlü bir tekniktir. Araştırmacılar bu teknikle bütün hayvanlardan tek hücrelere kadar biyolojik örnekleri görüntülediler. 1-4 MSI kullanılarak, geleneksel konfokal mikroskopi için ek floroforların geliştirilmesini veya histoloji için boyamayı gerektiren tek substrat teknikleri yerine, yüzlerce analit tek seferde görüntülenebilir. 5–7 Ek olarak, MSI hedefli veya keşfe dayalı bir şekilde kullanılabilir, bu da onu kimyasal türlerin dağılımı arasındaki örtüşmeye bakmak için çekici bir yaklaşım haline getirir. İçinde, üç boyutlu çok hücreli hücre kültürlerinin küçük örneklerinin (~ 1 mm çapında) büyümesi, hazırlanması ve matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu / desorpsiyonu (MALDI) görüntülemesi için yöntemler sunulmaktadır. 8–11

3D hücre kültürleri, geleneksel monotabaka kültür ile in vivo tümörler arasında bir aracı olarak biyolojik topluluk için özellikle ilgi çekicidir. Adından da anlaşılacağı gibi, 3D hücre kültürleri, küçük avasküler tümör nodüllerinde gözlemlenen mikro çevredeki kimyasal gradyanların çoğunu içeren heterojen hücresel agregalardır ve bu da onları doğal tümör ortamına tek katmanlı kültürden daha gerçekçi bir model sistem haline getirir. 10 Kolon, meme, yumurtalık, prostat, böbrek ve akciğer dokularından türetilen hücre hatları dahil olmak üzere birçok insan hücre hattı 3D kültürler olarak büyütülebilir. 10 Kütle spektrometresi görüntülemesi için yaygın olarak kullanılan birçok örnekten daha küçük oldukları ve bu nedenle dikkatli bir örnek hazırlama gerektirdikleri için üç boyutlu hücre kültürlerinin görüntülenmesinde doğal zorluklar vardır. 7 Bununla birlikte, bu izlenebilir model sistemlerinin avantajları, hayvan modellerine kıyasla daha düşük maliyet ve daha hızlı büyüme ve analiz süresini içerir. Sonuç olarak, üç boyutlu hücre kültürlerini içeren çalışmalar, geleneksel hayvan çalışmalarından daha yüksek verime sahip olabilir. 12–14

Tüm bu avantajlar, biyolojik araştırmalarda üç boyutlu hücre kültürlerinin popülaritesinin artmasına neden olmuştur; bu sistemlerdeki moleküllerin hem bileşimini hem de mekansal dağılımını araştırmak için yeni analitik stratejiler geliştirmeye karşılık gelen bir ihtiyaç vardır. 12,15–21 Bu makalenin amacı, kütle spektrometresi görüntüleme yöntemlerinin ve numune hazırlamanın üç boyutlu hücre kültürlerine uyarlanmasını tanımlamaktır.

Protokol

Görüntüleme 1. 3D Hücre Kültürü ve Hazırlık

  1. Kültür, bir uygun hücre hattı, yani, HCT116 kolon karsinomu hücre soyu, iki boyutlu, tek tabakalı kültürü.
  2. Genellikle birkaç gün sürer, 50-70% konfluansa kadar bir% 5 CO2 inkübatörü içinde +% 10 fetal bovin serumu McCoy'un 5A ortamı bir T-25 balonuna HCT 116 hücreleri büyütün.
  3. % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile Yayın hücreleri ve bir hemositometre kullanılarak bir hücre kısmı sayısı ve hücre yoğunluğu ve viyabilitede kontrol etmek için mavi boya tripan.
  4. Sayımının ardından / oyuk 6000 hücre, uygun bir tohum yoğunluğu elde etmek için tam ortam ile hücreleri, seyreltik ya 30,000 hücre / ml olmuştur.

2. Agaroz, 96 gözlü levhalar Kaplı hazırlayın

  1. 50 ml'lik konik bir tüp içinde standart ortam, 10 ml (ortam içinde% 1.5 agaroz çözelti) ile 10 agaroz 0.19 g ekleyin. Nazik karıştırma ile birleşmesini sağlamak. Bir su banyosu içinde agaroz otoklav20 dakika karıştırıldı.
  2. Düz dipli 96 kuyu plaka kültür plakasının 60 merkez kuyulara, agaroz + medya karışımı aspire 50 ul bir çok kanallı pipet kullanarak. Levhanın çevresel kenarları bir kuyu biraz daha yüksek buharlaşma oranları bilgisi olarak, 200 ul 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yerine, bu kenarlarına agaroz ekleyin.
  3. Agaroz karışım iç oyuklara ilave edildikten sonra, soğumaya kenara plaka ~ 37 Hücrelerin eklenmesinden önce ° C.

3. Tohum ve Üç-boyutlu Kültür meyilliyim

Not: Daha fazla veya daha az hücrelerin yer kültür şartlarına bağlı olarak ekilebilir, ancak bu koşulların kültür 10-14 gün sonra çapı yaklaşık 1 mm 3D hücre kültürü yapıların neden olduğu tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir) .

  1. Uygun hücre çözeltisinin 200 ul ekle (~ 6.000 hücreler içeren seyreltilmiştir) agaroz kaplı96 çukurlu levha. Plaka örtün ve hücre büyümesi için 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde ayarlanır.
  2. Hücre Ortam her 48 saat en az değiştirme, ya da medya göründüğünde renk değişiyor gibi.
    1. Dikkatle agaroz altındaki (2 gün çıplak gözle görülebilen), küçük 3D hücre kültürü etrafında eski medya aspire medya değiştirin. Yavaşça 3D hücre kültürü üzerinde taze medya 200 ul ekleyin.
    2. Bu ortam değişiklikleri sırasında (İsteğe bağlı adım), test için kemoterapi ya da diğer ilaçlar ekleyin. Tam ortam ile nihai konsantrasyona kadar tercih edilen bir ilaç seyreltilir ve her bir oyuğa 200 ul gerekli ekleyin.
    3. 3D hücre kültürleri, çap olarak yaklaşık 1 mm kadar bir optik mikroskop ile 3D hücre kültürü büyüme izleyin.

4. Hasat 3D Hücre Kültürleri

  1. Yavaşça agaroz yatak 3D hücre kültürü çıkarmak için 2 ml serolojik pipet kullanın.
  2. hafifçe bekleyen 24 oyuklu bir plaka içerisinde, yaklaşık 1 ml PBS içine pipetleme PBS ile 3 boyutlu hücre kültürleri yıkayın.
  3. Transfer protein veya metaboliti çıkarılması için santrifüj tüplerine serolojik pipet aracılığıyla 3D hücre kültürleri hasat, ya da onlara görüntüleme uygulamaları için dilimleme yardımcı bir kesim orta embed.

Jelatin 5. Göm 3D Hücre Kültürleri

  1. Yüksek saflıkta su içinde ~ 175 mg / ml jelatin içinde bir çözeltisi hazırlandı (18 M tercih edilir). 22,23 kuvvetli bir şekilde jelatin karıştırın. Viskoz ve işlemek için zor hale çözümü gözlemleyin. Çözüm aspirat açık ve kolay hale gelinceye kadar ~ 60 ° C su banyosunda jelatin içeren konik tüp yerleştirin ve ılık.
    NOT: Sıcak jelatin çözüm soğur hızla sertleşir, bu nedenle hızla dondurmadan önce aşağıdaki adımların tümünü gerçekleştirmek.
  2. O ısıtılır sonra, hücre kültürü kaputu hemen jelatin almak. Bir bea jelatin ile tüp tutunyaklaşık 60 ° C'de ısıtılmış, su ile ker Jelatin çözeltisi sertleşmesini önlemek için C °.
  3. 2 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, 24 düz tabanlı plakanın her bir kuyucuğu içine sıcak jelatin solüsyonu, 0.6 ml yatırmak. Bu hacim, ince bir tabaka halinde alt kapak için yeterlidir. Yavaşça derhal 3D yapısının kırılması için değişik bir 2 mi pipet kullanarak jelatin katmanın üzerine 3D hücre kültürleri yatırmak.
    Not: Bakım jelatin içine PBS yerleştirmek için bu aşamada alınmalıdır. Bu durumda, bununla birlikte, bir 200 ul bir pipet kullanılarak jelatinin en PBS çıkarın.
  4. 3D hücre kültürleri, jelatin katmanın yüzeyine yerleştirilir sonra kültür konumunu rahatsız etmeyecek şekilde, dikkatli bir şekilde, 3 boyutlu hücre kültürleri üzerinde sıcak jelatin karışımı bir 0.6 mi pipetle. İkinci katman yerleştirildikten sonra, -80 ° C'de jelatin-gömülü 3D hücre kültürleri dondurma.

6. Dilim ve çözülme Dağı incie Kütle Spektrometrik Görüntüleme 3D Hücre Kültürleri Jelatin-gömülü

  1. Dondurucu 3D hücre kültürleri içeren 24 plaka çıkarın. Bir cımbız veya bisturi iyi tarafı aşağı hafifçe kaydırın edecek kadar elinizden ısı ile plakanın alt ısıtın.
  2. Sorunsuz merkezi çözülme olmadan jelatini kurtararak, cımbız veya neşter kaydırın. Kriyostat desteği bir damla su alın ve destek jelatin diski uymak için kullanabilir.
    1. Jelatin gömülü 3D hücre kültürleri, -30 ° C de dilimleme en uygundurlar. Kullanmadan önce% 70 etanol ile kriyostat bıçak ve cam temizleyin. Bıçak veya bıçak matlaştırmadan önlemek için her 3D hücre kültürü-jelatin disk için yeni bir bıçağın farklı bir kısmını kullanın.
  3. 3D hücre kültürleri görünür hale gelene kadar sirostat kullanarak, yavaşça aşırı jelatin karşıya.
  4. Bu noktada yavaş yavaş 12-16 mikron bölümlerde bir yumuşak hareket ile 3D hücre kültürleri dilim.
    NOT: dilimleme kritik faktörler yüzden tüm bu tutarlı sonuçlar sağlanması için kontrol edilmelidir bıçak cam mesafe, bıçak açısı, kriostat sıcaklığını ve destek diskin açısını içerir.
  5. Dikkatle dilimleri Çözülme ve uygun şekilde etiketlenmiş indiyum titanyum oksit (ITO) kaplı cam slaytlar onları monte ve bir desikatörde saklayın. Maksimum kalite için mümkün olduğunca çabuk dilim kullanın.

MALDI Görüntüleme için 7. Matris Başvuru ve Numune Hazırlama

  1. MALDI görüntüleme önce, uygun matris ile dilimleri hazırlamak.
    1. Küçük moleküllü analizi için, herhangi bir yıkama basamağı, genel olarak ihtiyaç duyulur. Sağlam protein tespiti için, soğuk% 100 aseton içinde dilimleri yıkama Carnoy sıvı veya% 70 /% 95 izopropanol gibi bir sinyal maske lipidler gibi küçük moleküller çıkarmak için 24 -. 26
    2. Yavaşça bir anda en fazla 30 saniye boyunca yıkayın. YapamazHerhangi bir dilim rahatsız.
  2. % 0.1 TFA ile, bir organik çözücü ve sudan oluşan bir çözelti içinde matris hazırlayın. Örneğin α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA) kadar küçük bir molekülü için,% 60 ACN kullanın:% 40 H2O:% 0.1 TFA (10 mg / ml) eklenmiştir. Protein tespiti için bu, daha sonra sinapik asit (30 mg / ml), aynı çözücü solüsyonu kullanın. Sinapik asit optimum çözünürlük için TFA ilave edilmesinden önce asetonitril ilk çözülür: H2O çözeltisi. Diğer matrisler, uygun olarak kullanılabilmektedir.
    Not: The Matrix çeşitli farklı yöntemlerle uygulanabilir, ancak bazı matrisler kullanılamaz örnek oluşturma, örneğin ferulik asit, jelatin, ile birlikte kristalize olduğu bulunmuştur not edilmelidir. Küçük kristalleri tespit edilir ve biyolojik özelliklerinden ziyade matris etkilerinden kaynaklanmaktadır daha moleküler türler sağlayan, daha tutarlı bir kütle spektrumu üretir.
  3. Yöntemi handspotting matrisi uygulayın.
    1. MATR 0.5 ul uygulamak için ince uçlu şırınga kullanınix 3D hücre kültürü dilim çözüm ve matris kristalize sağlar.
  4. Alternatif olarak, airbrush yöntemini kullanın. Matris çözeltisi ile ticari sınıf ucu kullanarak doldurun.
    1. 8-12 santim uzakta slayt püskürtücü tutun dilim bir ince sprey hedefliyoruz. Geçişler arasında ise, 1 dk en iyi kristal oluşumuna izin vermek için matris kurumasını bekleyin. Havalı fırçalar kadar 10-20 geçer matrisi 22 arasında optimum bir tabaka elde etmek için gereklidir.
  5. Alternatif olarak, yüceltme yöntemi başka ayrıntılı kullanın. 25,27
  6. Bağımsız olarak matris uygulama yönteminin önceden MALDI-MSI için en az 30 dakika boyunca bir desikatör içinde kuru kayar. 25

Bir MALDI-TOF Sisteminin Kullanılması 8. MALDI-MSI Analizi (yani, autoflex III)

NOT: Bu bölümde MALDI-TOF görüntüleme deney parametrelerini ayarlamak için talimatlar ve tavsiyeler içermektedir. Ins bağlıtrument üretici ve yazılım kullanılan, süreç değişebilir.

  1. Güvenli görüntü İTO kaplı slaytlar bağlı 3D hücre kültürü dilimleri 75 mm x 25 mm slayt tutmak için yapılan bir adaptör slaytlar takın. Aracı haline slayt adaptörü yükleyin.
  2. Söz konusu kitle aralığı için uygun bir kalibrasyon standardı seçerek MALDI-MSI aleti hazırlayın. Küçük moleküllerin sorgulama için, kullanılan matris, α-CHCA uygun bulgulanan sinyaller, kalibranlarla biri ortak bir gruptur. Proteinlerin analizi için, ilgi konusu kütle aralığı bilinen proteini standartları (yani, ubikitin, tripsinojen) seçilebilir ve kalibranlarla 3D hücre kültürleri bitişik fark vardır. Yöntem geliştirme ile devam etmeden önce cihazı kalibre.
  3. Önceki görüntüleme, cihaz üreticisi tarafından sağlanan yazılım kullanılarak seçim kütle aralığı için veri elde etme yöntemlerini geliştirmek. Bakınız Şekiller 1 ve 2 içinküçük molekül ve protein görüntüleme. Küçük moleküllü görüntüleme için, en yüksek kitle çözünürlük modunu reflektron kullanın.
    1. 100-1,000 m / z arasında 8,000- 25,000 m / z arasındaki proteinler için küçük molekül veri toplama için kitle aralığını ayarlayın. Alet ile mümkün olan en yüksek kitle çözünürlük sunarken seçim bölgesini kapsayacak şekilde kitle aralığını ayarlayın.
    2. Lazer gücü, frekans, kalibrasyon çözümü ve yakındaki bir 'kurbanlık' 3D hücre kültürü dilim kullanarak lazer çekim ve spot boyutu sayısını ayarlayın. Ana enstrüman kontrol yazılımı bu ayarları uyun. % 60 güç, 400 lazer çekim, ultra küçük nokta boyutu: tavsiye edilen başlangıç ​​noktası olarak aşağıdaki ayarları kullanın. Bu ayarlar araçlar ve yöntemler arasında değişir, bu yüzden her özel araç için en kaliteli spektrumları vermek için enstrüman parametreleri optimize eder. Ayarlanabilir diğer parametreler dedektör kazanç, örnek oranı, ve elektronik kazanç vardır. Sgörüntüleme yazılımı kullanmak için bu yöntemi ave (yani., AutoExecute Yöntemi FlexImaging üzerine çekecektir ki).
      Not: tesbitine müdahale etmeyecek şekilde ilgi kütle aralığı altında Bastırma iyonları (yine cihaz kontrolü olarak bulunur).
    3. Seçim kütle aralığı için protein veri toplama yöntemlerini geliştirin. Yukarıda belirtilen aynı adımları uygulayın, ancak orta-yüksek kütle aralıkları için, yaklaşık 3 kDa üzerinde, doğrusal kipi kullanmak.
      NOT: Ayarlar küçük molekül yöntemleri için kullanılanlardan farklı olacaktır.
  4. Böyle Bruker MALDI-TOF sistemleri için FlexImaging gibi enstrüman üreticisi tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı kullanarak Kur özgü MS cihazı parametreleri.
    1. Yöntemleri önce geliştirilen ve kaydedilmiş kullanarak, yeni bir görüntüleme dosya ve klasör oluşturun. Böyle raster nokta (adım 8.3.2 veya Madde 8.3.3 kurulum) enstrüman kontrol yöntemi kurmak boyutu (yaklaşık 200 um 50 um varsayılan değişim), ve pozisyonlara gibi enstrüman parametreleri seçin3D Hücre kültürü üzerinde tarama yon.
    2. Sırayla her lazer hareketli, numune üç Uygun öğretmek noktalarını seçin. 'Baskı ekranı' kullanarak MALDI-TOF lazer kontrol yazılımı optik fotoğraf edinin.
      NOT: Birçok görüntüleme yazılımı programları 'öğretmek' bir tarayıcı veya sık sık enstrüman kamera ile elde edilebilir lazer bulunduğu yazılımı, numune bir optik fotoğraf gerektirir.
  5. Ardından görüntüleme yazılımı (değil araç kontrolü) den görüntüleme işlemini başlatmak ve her dilim kitle spektrumları kazanır. Belirli alanlarda lokalize çoğu 3D hücre kültürü karşısında kitleleri ve diğerleri uyun.

9. İsteğe Bağlı Veri Analiz Yöntemleri

  1. Hedeflenen analizi için, ortalama spektrumunda bir kitle tıklayarak spektrumları manuel analizi gerçekleştirmek, ya da (görüntüleme yazılımı otomatik olarak belirli bir eşiğin üzerinde kitleleri almak için izin örn., Ab zirveleri) Üst% 20 barajını ove. Kalite kontrolü için, matris doruklarına dağıtım veya ortalama spektrumunu incelemek.
  2. Ar veya Matlab gibi matematiksel yazılım ekstre veri setleri ile istatistiksel analizler gerçekleştirin.
    1. Seçim yazılımı içine yüklemek için ASCII formatında, bir okunabilir bir metin dosyasına, İhracat tek spektrumları.
    2. , Birkaç farklı yazılım programları tarafından 28 okuma mzML formatında ASCII, mzXML, bireysel spektrumları dönüştürme -. 31 ya da analiz (.img) dosya biçimi, MRI gibi diğer görüntüleme uygulamaları için kullanılan ortak bir biçimi olarak veri ihracat 32 analizi için iki açık kaynak seçenekleri MSiReader ve BioMap 32,33 vardır.
    3. Dosyaları yazılım tarafından okunabilir bir biçime ihraç edildikten sonra, ilgili yazılım talimatları yoluyla veri kümesini yükleyin. Yükleme sonrasında, bu tür temel çıkarılması ve normalleşme gibi, alım sonrası işlem gerçekleştirmek.
    4. Bu veri kümesi ile, Amerika gerçekleştirmekörneğin Matlab 18 gibi yazılım algoritmaları inşa özel komut dosyaları veya kullanarak hiyerarşik kümeleme temel bileşen analizi gibi STICAL tedaviler.

Sonuçlar

MSI görüntüleme 3D hücre kültürlerinde çok farklı moleküler dağılımı ortaya çıkarmak için bir potansiyele sahiptir. Yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak, küçük moleküller, büyük proteinleri (Şekil 1) (Şekil 2) gelen türler kültür boyunca izlenebilir. Bu sonuçlar MSiReader. 32 Sonuçlar ilgi bir bölge ya da tüm taranan bölgede ya görselleştirme yazılımı ile 3D hücre kültürü üzerinde ilgi tek iyonları için analiz edilebilir ücretsiz araç ile tek iyon görselleştirme göstermektedir. Ayrıca çoğu yazılım otomatik keşif çalışmalarını yardımcı olabilir kullanıcı tarafından belirlenen belli bir eşiğin üzerinde iyonları görselleştirmek olacaktır. Tek iyon haritaları elde edildikten sonra, çoğu yazılım iyonlarının ko görmek görüntüleri bindirmek için bir yeteneğini de içerir. Ya yaklaşımları keşif-tabanlı veya hedeflenen bir şekilde, kütle spektrometresi görüntüleme 3D hücre kültürleri analiz etmek için güçlü bir araçtır.

sayfa içinde figure-results-1
Şekil 3D hücre kültürü büyümesi ve kesit. Sol) önce hasat gün 14 inceledi gibi sağlam bir kolorektal HCT-116 3D hücre kültürü yapısının Optik görüntü 1. Temsilcisi sonuçları. Sağ) bir kolorektal 3D hücre kültürü çözülme yaklaşık ekvator dilim Optik görüntü görüntüleme için bir ITO kaplı slayt üzerine monte. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3D hücre kültürü. Üst) düşük kütleli (küçük molekül) aralığında α-CHCA ile elde ortalama kütle spektrumları bir ekvator bölümünde küçük molekül MALDI-MSI 2. Temsilcisi sonuçları. Bottom) Temsilcisi görüntüleriTek bir kütle: 327.8 m / z esas olarak 3D hücre kültürü ve iç lokalize 429,7 m / öncelikle 3D hücre kültürünün kenarına lokalize z. Kesikli çizgi sfero yaklaşık kenarını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3D hücre kültürü. Üst) yüksek (protein) kütle aralığında sinapik asit ile elde ortalama kütle spektrumları bir ekvator bölümünde MALDI-MSI protein görüntüleme 3. Temsilcisi sonuçları. Altta) tek bir kitle Temsilcisi görüntüleri: öncelikle sfero kenarına lokalize 10.871 m / z ve daha sfero içine doğru lokalize 12.184 m / z. Kesikli çizgi sfero yaklaşık kenarını belirtir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Yukarıda belirtilen yöntemler kullanılarak, 3D hücre kültürleri büyütülmüş ve MALDI-MSI ile analiz edilebilir. Ne zaman uygun bir şekilde. 9,10 Tedavi, yani, çok fazla kez geçen düşük geçiş numaraları edilmemiş hücrelerin kültive edilmesi için alınması gereken bir çok kültürlenmiş ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri 3D yapılar oluşturacaktır. Genel olarak, on ve alt geçişi numaraları ile hücreler 3D hücre kültürlerinin yetiştirilmesi için uygun bulunmaktadır. Geleneksel agaroz destek 3D hücre kültürleri Büyüyen bu sistemi denemek için 3D hücre kültürü ile ilgilenen araştırma grupları için uygun maliyetli bir yol sağlar. Bu yöntem değildir zaten çoğu memeli hücre kültürü laboratuvarlarında birkaç bileşenleri kullanır. Dikkat dikkat büyümesi için agaroz levhalardan hazırlanması dikkat edilmelidir 3D hücre kültürleri bir boyut ve şekilde tutarlı olacak şekilde; dikkat edilmesi gereken bazı yönleri herhangi bir hava kabarcığı karışımına ilave edilir ve uygun bir menisküs her birinin alt ağ oluşturulduğu şekilde tutulmuş olduğunu kontrol etmek,ell. Menisküs düzgün formu yoksa, hücreleri, küremsi şekiller ya da küçük topaklar halinde gelişebilir. Ayrıca, bakım sferoidlerle jelatin içine PBS yerleştirmek için dikkat edilmelidir. Bu durumda, 200 ul pipet kullanarak jelatin üst PBS kaldırmak. Fiyatı bir faktör değilse, çok düşük bir bağlanma yuvarlak taban levhaları ticari olarak temin edilebilir ve bu adımların sadeleştirilmesi sunmaktadır. Diğer doku gömme yöntemleri de pahalı olmayan kütle spektrometrisi uyumlu olabilir, jelatin gömme ucuz ve çok yönlü hem de olduğu gösterilmiştir. 3D hücre kültürleri yüksek kalitede veri elde etmek için, yukarıda özetlenen Hazırlık stratejileri optimize edilmiştir. Jelatin gömme kütle spektrometresi analizi ile uyumlu olacak şekilde gösterilmiş olmakla birlikte, bu işlem, yardımcı-kristalleştirme için uygun matrisler dar yapar. Dondurulmuş sonra, 3D hücre kültürleri sürece dondurularak çözülmüş değildir gibi ay boyunca stabildir. jelatin donmuş zaman opak olur, ve 3D cepKültürler benzer bir renk vardır, bu yüzden dilimleme yardımcı olmak için 3D hücre kültürü yerleştirme belgelemek için dondurmadan önce tavsiye edilir.

Slaytları hazırlanırken, matris çeşitli farklı yöntemlerle uygulanabilir, ancak bazı matrisler kullanılamaz örnek oluşturma, örneğin ferulik asit, jelatin, ile birlikte kristalize olduğu bulunmuştur unutulmamalıdır. Daha küçük matris kristaller daha tutarlı kitle spektrumu üretir. Handspotting matris uygulamasının basit bir yöntem olmasına rağmen, daha büyük bir çözücü hacmi daha büyük kristal boyutlarının ve önemli analit göç neden olabilir.

Kütle spektrometresi olarak, başlangıç ​​analizleri için gerekli olan uzmanlık azalttı MALDI-MSI teknolojileri gelişmeler. Veri toplama ve analiz ITO kaplı slaytlar yüksek kaliteli bilgi edinmek için bile bir acemi izin Çoğu sistemde, üzerinde basittir. Yakındaki olmayan görüntü layık 3D cep Kültür optimize cihaz parametrelerinin dikkatli seçimi,es, yüksek kalitede veri elde etmek için önemlidir. Örneğin, lazer gücü artan pik yoğunluğunu artırabilir ancak lazer gücü azalan çözünürlüğü artırmak ve daha simetrik pik şekilleri verebilir. 3D hücre kültürleri, uygun örnek kalitesini sağlamak için dilimleme sonra hızlı bir şekilde kullanılmalıdır. Protein sinyalinin bozulması (20 kDa üstünde) özellikle yüksek kütle bölgesinde, uygun saklama (Desikatör / -80 ° C dondurucu olmadan) daha az bir hafta içinde görülebilir. Nedeniyle artan talep nedeniyle, birçok farklı görselleştirme yazılım programları geliştirildi ve araştırma halka ücretsiz edilmiştir. Çoğu görüntüleme kitle spektrometre her cihazda kullanılan tescilli formatları ile tek kitleleri görselleştirmek için gerekli yazılım yüklü. Bu yazılım programları verileri tek kitle görüntüleri elde etmek ve ihracat için kullanılabilir. Çoğu yazılım da ilgi iki veya daha fazla kitlelerin kaplamayı sağlayacaktır. Ayrıca, MSI verileri birçok farklı izleyiciler gibi MSiReader An gibi, indirmek için ücretsizd BioMap. Ayrıca ön plana daha yararlı bilgiler getirerek, kolaylıkla alım sonrası işlenebilir elde edilen 32,33 kütle spektrometresi veri.

Proteinlerine lipidlere farmasötik kaynaktan, yukarıda belirtilen sistem 3B hücre kültürü yapısı boyunca, ilgi konusu moleküllere dağılımını değerlendirmek için hızlı veri edinimi için izin verir. Seri kesitler 3D hücre kültürü bir dilim her 2D görüntü oluşturarak görüntünün tamamını 3D yapıyı alınabilir. protokol teknikleri ve notlar tek tabakalı kültürü ve hayvan modelleri arasında bir köprü olarak üç boyutlu hücre kültürü başlamak isteyen araştırmacılara yararlı olacaktır. Hakim sonra, bu teknikler, bu hangisi örnekleri görüntünün araştırmacılar izin 3D hücre kültürleri, doku ve hücre çok tip için uygulanabilir.

Açıklamalar

Bu makale, Bruker Biospin sponsorluğunda Multimodal Klinik Öncesi Görüntüleme konulu özel bir sayının parçasıdır. Temsili sonuçları elde etmek için kullanılan MALDI-TOF sistemi bir Bruker AutoFlex III'tür.

Teşekkürler

Bu çalışma, Notre Dame Üniversitesi Harper Kanser Araştırma Enstitüsü'ne (DARW) Temel Kanser Araştırmalarını Geliştirme programı kapsamında Walther Kanser Vakfı tarafından ve Pittsburgh Analitik Kimyagerler Derneği'nden (ABH) 2011 Başlangıç Bursu kapsamında desteklenmiştir. Yararlı tartışmalar için Kütle Spektrometresi ve Proteomik Tesisi personeline de teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HCT116 Hücre hattıATCCATCC CCL-247Potansiyel tehlike, dikkatli kullanın
McCoy'un 5A ortamıGibco16600-108
Fetal Sığır serumuHyCloneSH30071.03
%0.25 Tripsin-EDTA çözeltisiGibco25200-056
AgarozSigma-AldrichA9539
Fosfat Tamponlu TuzluGibco10010049
Jelatin, tatlandırılmamışKnoxÇoğu markette tek paketlerde bulunur
ITO kaplı cam slaytlarDelta Technologies, LimitedCG-90IN-S115
&alfa;-Siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA) Sigma-AldrichC8982
Sinapik AsitSigma-Aldrich85429
0.3 mm Yerçekimi Beslemeli Çift Etkili Airbrush Boya Püskürtme Tabancası Kiti SetiRoyalMax Airbrushsitelerde birçok seçenek mevcuttur Amazon.com
gibi

Kaynaklar

  1. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  2. Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).
  3. Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a, Caprioli, R. M. Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).
  4. Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry. Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).
  5. Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).
  6. Guenther, S., et al. Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).
  7. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).
  8. Kunz-Schughart, L. a, Kreutz, M., Knuechel, R. Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology. Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).
  9. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  10. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  13. Fernandes, T. G., Kwon, S. -J., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  14. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  15. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
  16. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  17. Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry. Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).
  18. Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections. Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).
  19. Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PloS one. 6 (5), 18940(2011).
  20. Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. aL. Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology. J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).
  21. He, W., Kuang, Y., et al. Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).
  22. Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).
  23. DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).
  24. Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).
  26. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  27. Gemperline, E., Li, L. MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules. J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).
  28. Deutsch, E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output). Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).
  29. Pedrioli, P. G. a, Eng, J. K., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  30. Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. What is mzXML good for. Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).
  31. Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -J., Binz, P. -A. Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).
  32. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a, Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  33. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction. Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B H cre K lt rMALDI MSIJelatin G mmeKriyostat Kesiti AlmaKolon KarsinomuHCT116 H creleriMatris UygulamasSpektral Analiz
3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.