Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için

10.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52334

⸱

24 Aralık 2014

 ,  ,  , 
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ, 2Department of River Ecology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Bu makalede

Özet

Burkholderia sartisoli RP037-mChe ile bir bütün hücre bioreporter deney, bir su doymamış model sisteminde hava dolu gözenekler köprü misel aktif taşıma sonra bakteriyel indirgenmesi için uygun bir organik kirlilik (örneğin, floren) fraksiyonları tespit etmek için geliştirilmiştir.

Özet

Kirleticilerin biyoyararlanımı, toprakta etkili biyolojik bozunmaları için bir ön koşuldur. Bununla birlikte, bir kirleticinin ortalama yığın konsantrasyonu, mevcudiyeti için uygun bir ölçü değildir; Biyoyararlanım daha ziyade, bir bileşiğin bir mikrobiyal hücreye potansiyel kütle transferinin (akı) dinamik etkileşimine ve ikincisinin bileşiği parçalama kapasitesine bağlıdır. Toprağın suya doymamış kısımlarında, misellerin, organik bileşikleri santimetre aralığında aktif olarak taşıyarak ve harekete geçirerek biyoyararlanım sınırlamalarının üstesinden geldiği gösterilmiştir. Misel bazlı taşınmanın kapsamı kimyasal yollarla kolayca ölçülebilirken, bakteri hücrelerine kirletici biyoyararlanımın doğrulanması biyolojik bir yöntem gerektirir. Bu kısıtlamayı ele alarak, model bileşik olarak PAH florenini (FLU) seçtik ve uzamsal olarak ayrılmış bir FLU nokta kaynağı ile FLU parçalayıcı biyomuhabir bakteri Burkholderia sartisoli RP037-mChe'yi bir misel Pythium ultimum ağı ile birbirine bağlayan bir su doymamış model mikrokozmos geliştirdik. Biyomuhabir, hücreye PAH akısına yanıt olarak eGFP'yi eksprese ettiğinden, bakteriyel FLU maruziyeti ve bozunması, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yoluyla doğrudan mikrokozmoslarda izlenebilir. CLSM ve görüntü analizleri, misel veya FLU içermeyen kontrollere kıyasla P. ultimum varlığında eGFP ekspresyonunda önemli bir artış olduğunu ortaya koydu, bu nedenle misel aracılı taşımadan sonra bakterilere FLU biyoyararlanımını gösterdi. CLSM sonuçları, aynı mikrokozmoslarda yapılan kimyasal analizlerle desteklenmiştir. Geliştirilen mikrokozmos, kirletici biyoyararlanımını araştırmak ve aynı zamanda ilgili bakteri-misel etkileşimlerini görselleştirmek için uygun olduğunu kanıtladı.

Giriş

Toprak yoğun bakteri gibi mikroorganizmalar 1,2 geniş bir yelpazede ile doldurulur. Ancak, bu yaşam koşulları, özellikle su durumu 3 açısından, zorlu. Bakteriler kalıcı heterojen ortamlarda 4 optimal koşulları aramak gerekir, ancak sürekli su filmlerin olmaması özgürce yaymak için onları engelleyen kısıtlı hareket 5 sonuçlanıyor. Ayrıca, çözünenlerin difüzyon hızları (örneğin, besinler) doymamış koşullarda 6 altında indirilir. Böylece, bakteri ve besin genellikle fiziksel ayrılır ve besin erişilebilirlik 3 sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, sürekli bir su-fazı gerektirmez kimyasal bileşikler için bir taşıma vektörü, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Aslında, bu tür mantar ve Oomycetes kadar mikroorganizmalar bu şekilde ulaşmak ve mobi hava dolu gözenekli boşluklar sayesinde büyümesini sağlayarak lifli bir büyüme formu geliştirdiklizing fiziksel uzun mesafelerde besin 7 ve 8 karbonlu maddeler ayrılır. Hatta bakteri 9 şekerler ve diğer enerji kaynakları sağlar biyolojik taşıma vektörü olarak hareket edebilir. Alım ve mantar organizmalarda taşıma aynı zamanda, Pythium ultimum 10 veya arbusküler mikoriza mantar 11 polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH), hidrofobik organik kirletici maddeler için gösterilmiştir. PAH her yerde ve suda az çözünen kirleticiler toprakta 12 olduğundan, Miseller-aracılı taşıma potansiyeli bakteriyel degraders için kirletici biyo artırmaya yardımcı olabilir. Kirletici taşıma miktarı kimyasal doğrudan ölçülebilir Oysa aşağılayıcı bakteri ve diğer organizmalar için misel tarafından taşınan kirleticilerin biyolojik kolaylıkla değerlendirilebilir edilemez, 10 anlamına gelir.

Aşağıdaki protokol myce etkisini değerlendirmek için bir yöntem sunardoğrudan bir şekilde bakteri degraders için kirletici biyo üzerinde lia; mikrobiyal ekosistemler üzerindeki kirleticilerin zamanmekansal etkisi hakkında bilgi toplama sağlar. Biz nasıl misel ulaşım vektörler aracılığıyla PAH-aşağılayıcı bioreporter bakteri ile bir fiziksel ayrılmış PAH noktası kaynağını bağlayarak toprakta hava-su arabirimleri taklit ayrıntılı bir doymamış evren sistemini kurmak açıklar. Havadaki ulaşım hariç Çünkü, bakteriler için PAH biyoyararlanım üzerine misel-temelli ulaşım etkisi izole bir şekilde ele alınabilir. Daha ayrıntılı olarak, üç halka PAH fluoren, misel organizma Pythium ultimum ve bioreporter bakteri Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 tarif evren kurulumları uygulanmıştır. bakteri B. sartisoli RP037-mChe başlangıçta hücre 14'e fenantren akıları çalışma yapılmıştır ve PAH akımının bir sonucu olarak, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş ifade ederMCherry kurucu olarak ifade edilen kırmızı flüoresan oluşturan ise hücre. Muhabir inşaat ile ilgili detaylı bilgiler Tecon et al., Ön testlerde 13 ile verilir, bakteri yok yüzme ve sadece çok yavaş kaynaşma yeteneği ortaya çıkardı. Bu hif üzerine yoğun bir süspansiyon halinde tatbik edildiği zaman Phytium ultimum hif yavaş yavaş göç edebildi. Bakteriler aşağıdaki protokol agaroz gömülü olduğundan, hif üzerinde göç meydana gelmedi.

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, bioreporter bakteri mikrokosmlarından doğrudan görülebilir ve eGFP sentezlenmesi yazılım ImageJ yardımıyla (MCherry sinyale orantılı), hücrelerin miktarı ile ilgili olarak tayin edilebilir. Bu farklı senaryolarda niteliksel biyo karşılaştırarak izin verir (yani, daha yüksek veya daha düşük). GRİP P. misel nakliyeden sonra bio-yararlı olduğu bulunmuştur ultimum'a (yani, onu), negatif kontrol olarak daha yüksektir. Ayrıca, protokol kimyasal yollarla Miseller-aracılı taşıma miktarını ölçmek için ve aynı mikrokosmlarından silikon kaplı cam elyaf (SPME lifler) ile kirletici biyo doğrulamak açıklamaktadır. Bu evren kurulumu kullanarak sonuçları yayınlandı ve P. kombinasyonu için tartışılmıştır ultimum, fluoren ve B sartisoli RP037-mChe 15. Burada, odak potansiyeli daha uygulamalar için bu bilgiyi sağlamak için detaylı bir yöntem açıklama ve protokol potansiyel tuzaklar belirlenmesi yatıyor. Diğer uygulamalar (kontamine sitelerden örneğin,) çeşitli mantar, bakteri türlerini içerir ve diğer kirleticiler (örn, böcek ilaçları) veya kirletici kaynağı (örneğin, yaşlı topraklar) olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yemekleri, Slaytlar ve Kuluçka Odaları 1. Hazırlık

  1. Her mikrokozmos için aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: bir büyük plastik Petri kabı alt (d = 10 cm), modifiye edilmiş bir (adım 1.2) kapaklı küçük plastik Petri kabı alt (d = 5 sm) ve üç oyuğa sahip bir sayım bölmesi slayt.
  2. Petri kabı alt parça istenilen sayıda (d = 5 sm) alın. Tam bir slayt (26 mm kenar uzunluğu) uygun bir testere ile ağzına kısmını çıkarın. Sistemi sterilize etmek için,% 70 etanol O / N Petri dipleri ve kapaklarını ıslatın ve UV-ışığı altında bir akış dolabında en az 2 saat onları kurutun. Ayrıca, 2 saat boyunca UV ışığına maruz kalan, sıkıca kapatılmış bir plastik kap içinde Petri kapları saklayın.
  3. % 70 etanol ile slaytlar istenilen sayıda silin onları havaya kurutun. Alüminyum folyo slaytlar sarın ve olası kirlilikler kaldırmak için 450 ° C'de 5 saat boyunca bir mufl ocağında koydu.
  4. Kapaklı cam kuluçka odaları hazırlayın. % 70 etanol ile temizleyin ve bir akış kabininde en az 2 saat UV ışığı açık odaları maruz.
    Not: kapaklı büyük Desiccators (30 cm çap) bu amaç için kullanılabilir; Her kurutucu on microcosm kurulumları kadar ev olabilir.

Medya ve Kültürler 2. Hazırlık

  1. Değiştirilmiş tripton-maya ortamı (mty) 14, 21C minimal ortam 16 (MM), yaklaşık 150 mi, minimal ortam ağar 5 ml, 100 ml elde etmek, 20 paralel bir evrendir çalıştırmak için, üç (MMA,% 0.5 w / v) Patates dekstroz agar plakaları (PDA,% 1.5, ağ / hac), P. ultimum, dört boş levhalar, 2 mg L -1 sikloheksimid, dört agaroz plakaları içeren bir PDA plaka (3,% ağırlık / hacim) 0.3 g mi -1 aktif karbon ve 2 mg bölümler halinde FLU, 40 mg.
  2. MTY kanamisin 50 mg L -1 içeren hazırlayın (kanamisin requir olduğunuedilen bakteryel ekimi için, 10 mM asetat içeren eGFP raportör plazmid) ve MM korumak için. Mikrokosmlarından bakteri immobilizasyonu için% 0.5 MMA hazırlamak için asetat olmadan MM kullanın ve Pythium ultimum ve evren kurulumları ekimi için% 1.5 PDA plakaları (her biri 20 mi) dökün.
  3. P. bir hifaları inoküle Üç taze PDA plâkalarında ultimum'a ila yaklaşık 72 saat boyunca 25 ° C'de karanlıkta inkübe edilir. Sonra plakalar, taze ve kabarık misel tamamen büyümüş olduğundan emin olun.
  4. B. iki kültür Başlangıç bir gliserol stokundan mty 50 ml sartisoli RP037-mChe. 230 rpm'de döner şişe hareket O / N oranı ile 30 ° C'de inkübe edilir.
  5. Ölçü kültür optik yoğunluk (OD) 578 nm 'de ve santrifüj 10 dakika için 1000 x g'de (B. sartisoli RP037-mChe için beklenen OD 578 yaklaşık 1.0 olan ve hücreler, logaritmik faz olarak ifade edilmiştir). Süpernatantı atın ve hücreleri yeniden askıyaMM uygun bir miktarda bir OD 0.4 578 ulaşmak için. 50 mg L -1 yeniden süspanse hücrelerin 400 ul kanamisin içeren MM 20 ml aşılamak. 230 rpm'de döner şişe hareket O / N oranı ile 30 ° C'de inkübe edilir.
  6. MM kültür OD 578 ölçün (B. sartisoli RP037-mChe için, beklenen OD 578 yaklaşık 0.2 ve hücreleri erken üstel fazda vardır). Santrifüj kültür 10 dakika boyunca 2000 x g'de 0.4 OD ulaşmak için MM uygun miktarda hücrelerin yeniden askıya. Kullanıma kadar 50 ° C'de hücre 2 ml tüpler sıcak sıvı MMA 500 ul süspansiyon ve mağaza 50 ul karıştırın. Her mikrokozmos MMA hücre 150 ul kullanın.
  7. Aktive edilmiş karbon ihtiva eden agaroz jeli plakaları dökün. Agaroz eritin (% 3 ağ / hac) iki kere damıtılmış su içinde. (G mi -1 0.3), aktif karbon ile iyice karıştırın ve plastik Petri içine dökün(D = 10 cm) aktarılır.

Montaj 3. Microcosm

NOT:. Komple evren kurulumu Şekil 1'de şematik olarak tasvir edilmiştir aşağıdaki bireysel adımlar için Şekil 1'e bakınız. Aşağıdaki adımlar misel taşıma vektörleri ve üç farklı kontrol kurulumları (CON AIR, CON NEG, CON POS) ile bir numunenin (SAM) hazırlanmasını açıklayan. Farklı düzeneklerinin bir özeti, Tablo 1 'de bulunabilir.

  1. Petri kapları ve slaytlar istenen sayıda alın ve 30 dakika için bir akış kabinin altındaki UV ışığına maruz bırakmaktadır.
  2. Büyük bir içindeki küçük Petri kabı yerleştirin ve küçük Petri kabı boşluğu ile slayt uyacak. MMA sıcak hücre süspansiyonu bir örnek alın ve bir slayt orta boşluğuna 150 ul ekleyin. Tüm slaytların orta boşluklar kadar bu adımı tekrarlayınMMA ile dolu. MMA katılaşması için 5 dakika bekleyin.
  3. Boş PDA plağından dairesel yamalar yumruk 1 cm mantar delici kullanın. Küçük Petri kabı içine MMA sonraki 2 mm mesafede bir yama yerleştirin. (Şekil 1 PDA 3) kurulumunda misel gelişimini teşvik etmek bu ekleyin.
  4. Mekanik bariyerler gibi kavisli PDA yamaları kesin. Temiz ve steril küçük Petri kabı alt kısmını kullanın ve PDA plaka içine bastırın. PDA-ring ile sonuçlanır agar içine 0.5 cm'lik bir mesafeden daha küçük bir halka kesmek için bir spatula kullanın.
    1. Tam evren kurulumunda küçük Petri kabı boşluğa uyan bir parça, kesin ve slayt üstüne boşluk içine yerleştirin. MMA ve dairesel PDA bariyer arasındaki mesafe yaklaşık 2 mm olduğundan emin olun. Yavaşça PDA bariyer içine bastırarak küçük Petri kabı kapağını kapatın.
    2. Tekrar 2 gr L içeren bir PDA plaka 3.4 ve 3.4.1 adımları -1bir sikloheksimid.
      NOT: Mycelialar sikloheksimid tarafından inhibe edilir ve MMA sarmak yok çünkü bu, bioreporter hücrelerine karşı havadan taşıma (CON AIR) için kontrol kurulum.
  5. Boş bir PDA plaka dairesel yamalar yumruk 1 cm mantar delici kullanın. İlk yama ortasında kesip başka 0,5 cm mantar delici kullanın. PDA engeli (Şekil 1 'de PDA 1) yanında, 1 mm bir mesafede elde edilen küçük PDA halka yerleştirin.
  6. PDA 1. Kullanım delik P. ile büyümüş PDA plakaları dairesel yamalar kesip 1 cm mantar delici içine FLU 2 mg ekle ultimum'a ve misel mat GRİBİ kristalleri bakacak şekilde PDA halkası üzerine aşağı alt (Şekil 1 PDA 2) bir yama yerleştirin.
    1. GRİP kristalleri eklemeden önceki adımı tekrarlayın.
      NOT: Bu arka plan belirlemek için negatif kontrol kurulumu (CON NEG) 'dirbioreporter hücrelerin floresans.
  7. Aktif karbon içeren agar dairesel yamalar yumruk 1 cm mantar delici kullanın. Ayrıca gaz GRİBİ konsantrasyonunu (Şekil 1) azaltmak için her evren kurulum dört yamaları yerleştirin.
  8. Bir pozitif kontrol (CON POS) hazırlayın. MMA hücre süspansiyonu 200 ul bazı GRİP kristalleri ekleyin ve boş bir slayt bir kavite koydu.
  9. Odasındaki gaz GRİP konsantrasyonunun asgariye düşürülmesi için enkübasyon odasının altındaki aktif karbon bir toz ile bir Petri kabı (d = 10 cm) yerleştirin. Aynı zamanda, bölme yüksek nemi kalıcı kılmak için alt steril su ile 4:56, 50 ml beher yerleştirin.
    1. Kuluçka odalarına evren kurulumları aktarın ve 96 saat süre ile 25 ° C'de inkübe edin. Rastgele farklı büyüme odaları yerleştirin örnekleri konum etkilerini dışlamak için.
      NOT: Bu inkübasyon süresi apoomiset P. katlarının ultimum'a. Diğer organizmalar için farklı olabilir.

4. Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi

  1. İdeal dik mikroskop ile CLSM kurulumu kullanın.
    NOT: Bu geleneksel lazerler sunan örneğin, uyarma veya bir ayarlanabilir beyaz lazer kaynağı ile 488, 561 ve 633 nm hatları ile donatılmış olabilir.
  2. Tahrik: görüntülerin toplanması için aşağıdaki ayarları kullanın 490 nm (eGFP) ve uygun lazer yoğunluğu (eşzamanlı uyarma) 585 nm (mCherry); emisyon aralıkları: 500 550 nm (eGFP) ve 605-650 nm (mCherry); objektif: (nedeniyle uzun çalışma mesafesi) 63X NA 0.9 su dalgıç; 0.5 mikron z-yığınları için adım boyutu.
  3. Açık evren kurulum ve PDA 1, 2, 3 ve PDA bariyer kaldırmak için bir neşter kullanabilirsiniz. MMA üstüne bir cam kapak kayma koyun ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe bastırın. Mikroskop sahnede Dağı slayt. Th üzerine bir su damlasının eklemee kapak kayma ve numunedeki bioreporter hücreleri bulmak için MCherry ayarlarını kullanın.
  4. Numunenin hızlı bir bakış alın ve bir parıltı-over-under arama tablosu kırmızı için (mCherry) ve yeşil (eGFP) kanalını kullanarak sinyal gürültü oranı optimize. Bioreporter floresan analiz için numune üzerine rastgele bir pozisyon seçin.
    NOT: hifler bioreporter emisyon (örneğin, yeşil otofloresans) 17 aralığında otofloresans gösterebilir. Bu durumda ise hif olmadan alanlarını seçmek için emin olun.
  5. Define ve yeşil (eGFP) ve kırmızı (mCherry) kanal her pozisyon için z-yığınları kaydedin. Epifloresans ışığın yada lazer ışığın uzun süre maruz kalma, numunenin ağartma kaçının.
    1. On rastgele dağılmış pozisyonları için önceki adımı yineleyin.
  6. Test pisti (SAM), CON AIR, CON NEG ve CON POS tüm örnekler için aynı ayarları kullanarak tüm adımları tekrarlayın.

5. Görüntü Analizi

NOT: Diğer seçenekler arasında özgür yazılım ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) olabilir, kaydedilen z-yığınlar halinde kırmızı (mCherry) ve yeşil (eGFP) floresan analiz etmek kullanılır.

  1. Logi_tool eklentisi (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/) yüklemek için emin olun.
  2. ImageJ açık dosya. "Bölünmüş kanalları" ve yakın yeşil kanalı seçin. Z-yığını kırmızı floresan alanını ölçmek için ek kod dosyası olarak sağlanan makro 'MCherry alan' kullanın. Makro tercih ayarlarını yapın (kalın gösterilir).
    1. Çıktı z yığını ölçülen piksel eşiğinin üzerinde (ve tanımlanan minimum boyutu üzerinde) ile bir tablodur.
      NOT: Tüm değerlerin toplamı yığını kırmızı piksel (bölge) toplam sayısıdır.
  3. ImageJ açık dosya. "Bölünmüş kanalları" ve yakın kırmızı kanalı seçin. Makro kullanın 216; ek kod dosyası olarak verilen eGFP int 'z yığını yeşil floresan yoğunluğunu ölçmek için. Makro tercih ayarlarını yapın (kalın gösterilir).
    1. Çıktı z-yığını tüm yeşil nesnelerin eşiğin üstünde (ve tanımlanan minimum boyutu üzerinde) ortalama yoğunlukları ve alanı ile bir tablodur. Yığını yeşil toplam piksel yoğunluğunu hesaplamak için, her gelen bölgelere göre ortalama yoğunluğu çarpın.
  4. Göreceli eGFP indüksiyon (eGFP rel) hesaplayın:
    figure-protocol-1 (1)
    Not: MCherry yapıcı bir şekilde ifade edildiği için, EGFP rel çıkan değer hücrelerinin belli bir miktar ile ifade edilen eGFP miktarı için göreli bir ölçümdür. Ayrıca eGFP rel hesaplanmasına ilişkin daha fazla bilgi için Tablo 3'e bakınız.
tle "> 6. Kimyasal Kantifikasyon

Not: Microcosm kurulumları ayrıca veya abiyotik kirletici plakasız transloke GRİP miktarda kimyasal ölçümü gerçekleştirmek için kullanılabilir.

  1. Alüminyum folyo ile 15 ml'lik cam şişeler, 1 ml GC / MS şişeleri ve ekler sarın. Na 2 SO 4 yemekleri buharlaşan doldurun; mümkün olan kirlilikler çıkarmak için 450 ° C'de 5 saat süre ile mufl ocağında tüm yerleştirin. Aktive edilmiş bir desikatör Na 2 SO 4 iç saklayın.
  2. 0.5 cm uzunluğunda içine PDMS kaplı cam elyaf kesin. Taze metanol içinde dört kez 2 saat sallayarak lifleri yıkayın. Tekrar yıkama ağzı kapalı bir cam şişe içinde ultra saf su içinde ultra saf su ve mağaza temiz lifleri ile diğer dört kez yineleyin.
  3. (: 1, h / h 3) ihtiva eden 10 ug L-1 fenantren-D 10, tolüen / aseton içinde 1.5 L hazırlayın.
  4. Adım 1, 2 ve protokol 3 yapın. Bior olmadan bir evrendir hazırlayınGRİP bozulmasını doğrulamak ve bioreporter hücreleri (SAM) ile () - (-) ve CON AIR SAM () eporter hücreleri GRİP taşıma çalışma.
    1. (Bioreporter hücreleri olmadan) Opsiyonel: SAM MMA içinde yapay ve ölçülebilir kirletici lavabo gibi (genellikle SPME deneyleri için kullanılan) cam elyaf kaplı Yeri üç PDMS (-) ince forseps kullanarak.
    2. Ince pensler kullanılarak bir cam elyafı çıkarın ve yerleştirilmiş bir GC / MS şişe içine her biri aktarın.
    3. Toluen 200 ul ekleyin ve dikey O / N sallamak ve GC / MS yoluyla analiz. Tablo 2'de verilen ayarları kullanın.
  5. 15 ml cam şişe içine orta boşluğundan MMA aktarın ve SO 4 Na 2 üç spatula hakkında ekleyin. İyice bir spatula kullanılarak karıştırılır ve çözücünün 10 ml ilave ediniz. Vortex karışımı ve karanlıkta yatay O / N sallayın.
    1. Transferi 1001, insert ile GC / MS şişe içine örnek l. Asenaftilen-d 08 (10 mg L-1) 10 ul ekle ve 6.4.3 tarif edildiği gibi aynı program kullanılarak GC / MS ile analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunulan sonuçlar daha önceki 15 yayınlanmıştır. Ayrıntılı mekanik ve çevresel tartışma maddeye bakınız.

CLSM üzerinden görüntü kaydı sonra, maksimum yoğunluk projeksiyon numunenin ilk görsel izlenim ve kontrolleri (Şekil 2) kazanmak için, ilgili mikroskop yazılımı veya ImageJ kullanılarak yapılabilir. Daha sonra, veri setleri belirli görselleştirme yazılımı tarafından anlamlı özelliklerini göstermek için farklı tahmin edilebilir. Pozitif kontrol (CO...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

sunulan evren kurulum misel tarafından alımı ve ulaşım sonra organizmaların aşağılayıcı mekansal ayrılmış kimyasalların biyolojik çalışma uygun kanıtladı. Kısmen uçucu bileşiklerin potansiyel gaz-faz taşıma önlenir ve bakteriyel bioreporter hücrelerinin hassas sistemin minimum rahatsızlık ile böylece ayrıntılı numune hazırlama olmadan görsel ve edilebilmektedir. Aynı zamanda, numunenin kimyasal analizi, kolay bir elde edilen sonuçların iyi kontrolü için, toplam taşıma ölçümü için izin yapılabilir. Ancak, bazı noktalar d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Alman Çevre Vakfı (DBU) tarafından sağlanan finansman kabul edilmektedir. Yazarlar, CLSM analizinde teknik yardım için Ute Kuhlicke'ye ve yetenekli deneysel yardım için Birgit Würz, Rita Remer ve Jana Reichenbach'a teşekkür eder. Yazarlar, verimli tartışmalar ve biyomuhabir türünü sağladıkları için Prof. Jan Roelof van der Meer ve Dr. Robin Tecon'a özellikle teşekkür etmek isterler. Helmholtz Derneği'nin 'Çevredeki Kimyasallar' (CITE) araştırma programına katkıda bulunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Solution 2Solution 3
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Konfokal MikroskopLeicaTCS SP5X, LAS AF - Sürüm 2.6.1; veya eşdeğeri CLSM
GC HP 7890 Serisi GC ve Agilent 5975C MSDAgilent, eşdeğer bir GC / MS kullanılabilir
GC kılcal kolon J& G 121-5522                         Agilent
Mantar deliciFisher Scientific12863952veya başka herhangi bir
Kapak fişiMarienfeld107222Yüksek performans, No.1.5H
GC/MS instertsWICOMWIC 47080
GC/MS şişeleri 2 mlWICOMWIC 41150
Vidalı kapaklı şişeler için kapaklar / septaDIONEX49463 / 049464 
GC / MS şişeleri için kapaklarWICOMWIC 43948 / B
Objektif SlaytlarMenzelsıradan
PDMS kaplı cam elyaflarPolymicro Technologies, Inc.V (PDMS) = 13.55  &artımn;   0.02  &mikro; l  m-1
Petri Tabakları küçük / büyükGreiner633-102 / 628-102
Vidalı kapaklı şişeler 40 mlDIONEX48783diğer cam şişeler kullanılabilir
Vidalı kapaklı şişeler 60 mlDIONEX48784diğer cam şişeler kullanılabilir
Asenaftilen d08Dr. EhrenstorferC 20510100
AsetonCarl Roth9372.2
Aktif karbonSigma-Aldrich242276-1kg
AgarozCarl Roth2267.4
FlorenFluka46880
Kanamisin sülfatCarl RothT832.250 mg L-1
MetanolCarl RothP7171
< Güçlü > Minimal Orta: < / güçlü> 100 ml Çözelti 1< / güçlü> + 25 ml Çözelti 2< / güçlü> + 5 ml Çözüm 3< / güçlü> ad. 1.000 ml Aqua Dest
Solution 1
Amonyum sülfatCarl Roth3746.15 g L-1 
>Magnezyum klorür x 6  H2OCarl Roth2189.11 g L-1
Kalsiyum nitrat x 4  H2OCarl RothP740.10,5 g L-1<
Disodium phosphateCarl RothP030.155.83 g L-1
Monopotasyum fosfatCarl Roth3904.120 g L-1<
Disodyum EDTAMERCK10841802500,8 g L-1
Demir(II) klorür x 4  H2OMERCK10386102500,3 g L-1
Kobalt (II) klorür x 6  H2OCarl RothT889.34 mg L-1
Manganez(II) klorür x 1  H2OCarl Roth4320.210 mg L-1
Bakır(II) sülfatCarl RothP023.11 mg L-1
Sodyum molibdat x 2  H2OCarl Roth0274.13 mg L-1
Çinko klorürMERCK 10881602502 mg L-1
Lityum klorürCarl RothP007.10.5 mg L-1
>Kalay(II) klorür x 2  H2OCarl Roth4473.10.5 mg L-1
Borik asitRiedel-de-Haen                         116061 mg L-1
Potasyum bromürCarl RothA137.12 mg L-1
Potasyum iyodürCarl Roth6750.12 mg L-1
Baryum klorürCarl Roth4453.10.5 mg L-1
MMAMinimal orta + agaroz %
0.2Fenantren d10Dr. EhrenstorferC 20920100
Patates Dekstroz Agar: 24 g L-1 et suyu + bacto-agar% 1.5; pH 6.8
Patates Dekstroz suyuDifco/ Beckton Dickinson254920
Bacto-agarDifco/ Beckton Dickinson214040
Sodyum asetat x 3 hidr.Carl Roth6779.1
Sodyum sülfatMERCK1066495000
ToluenMERCK1083252500
mTY orta: 3 g  L-1 maya özütü, 5  g  L<>sup-1 bacto tripton ve 50 mM NaCl
Maya özütüMerck1037530500
TriptonServa4864702
Sodyum klorürCarl Roth3957.1
ImageJ, logi araç eklentisihttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ve http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
ilePythium ultimum suşu 67-1Dr. Christoph Keel'in laboratuvarından elde edilmiştir; Lozan Üniversitesi, Temel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İsviçre
Burkholderia sartisoli RP037-mCheProf. Jan Roelof van der Meer'in laboratuvarından elde edilen; Lozan Üniversitesi, Temel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İsviçre
td colspan="4">td colspan="4"> (pH 6.0)

Kaynaklar

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyoreporter DeneyiKonfokal Lazer Taramalı MikroskopiMiselyal Ağ TaşınımıBurkholderia sartisoliPythium ultimumFlüoren BiyoyararlanımıEGFP Ekspresyon AnaliziKirletici Taşınım DeğerlendirmesiGörüntü Analiz Yazılımı
A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.