Burkholderia sartisoli RP037-mChe ile bir bütün hücre bioreporter deney, bir su doymamış model sisteminde hava dolu gözenekler köprü misel aktif taşıma sonra bakteriyel indirgenmesi için uygun bir organik kirlilik (örneğin, floren) fraksiyonları tespit etmek için geliştirilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için
Bu makalede
Özet
Özet
Kirleticilerin biyoyararlanımı, toprakta etkili biyolojik bozunmaları için bir ön koşuldur. Bununla birlikte, bir kirleticinin ortalama yığın konsantrasyonu, mevcudiyeti için uygun bir ölçü değildir; Biyoyararlanım daha ziyade, bir bileşiğin bir mikrobiyal hücreye potansiyel kütle transferinin (akı) dinamik etkileşimine ve ikincisinin bileşiği parçalama kapasitesine bağlıdır. Toprağın suya doymamış kısımlarında, misellerin, organik bileşikleri santimetre aralığında aktif olarak taşıyarak ve harekete geçirerek biyoyararlanım sınırlamalarının üstesinden geldiği gösterilmiştir. Misel bazlı taşınmanın kapsamı kimyasal yollarla kolayca ölçülebilirken, bakteri hücrelerine kirletici biyoyararlanımın doğrulanması biyolojik bir yöntem gerektirir. Bu kısıtlamayı ele alarak, model bileşik olarak PAH florenini (FLU) seçtik ve uzamsal olarak ayrılmış bir FLU nokta kaynağı ile FLU parçalayıcı biyomuhabir bakteri Burkholderia sartisoli RP037-mChe'yi bir misel Pythium ultimum ağı ile birbirine bağlayan bir su doymamış model mikrokozmos geliştirdik. Biyomuhabir, hücreye PAH akısına yanıt olarak eGFP'yi eksprese ettiğinden, bakteriyel FLU maruziyeti ve bozunması, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yoluyla doğrudan mikrokozmoslarda izlenebilir. CLSM ve görüntü analizleri, misel veya FLU içermeyen kontrollere kıyasla P. ultimum varlığında eGFP ekspresyonunda önemli bir artış olduğunu ortaya koydu, bu nedenle misel aracılı taşımadan sonra bakterilere FLU biyoyararlanımını gösterdi. CLSM sonuçları, aynı mikrokozmoslarda yapılan kimyasal analizlerle desteklenmiştir. Geliştirilen mikrokozmos, kirletici biyoyararlanımını araştırmak ve aynı zamanda ilgili bakteri-misel etkileşimlerini görselleştirmek için uygun olduğunu kanıtladı.
Giriş
Toprak yoğun bakteri gibi mikroorganizmalar 1,2 geniş bir yelpazede ile doldurulur. Ancak, bu yaşam koşulları, özellikle su durumu 3 açısından, zorlu. Bakteriler kalıcı heterojen ortamlarda 4 optimal koşulları aramak gerekir, ancak sürekli su filmlerin olmaması özgürce yaymak için onları engelleyen kısıtlı hareket 5 sonuçlanıyor. Ayrıca, çözünenlerin difüzyon hızları (örneğin, besinler) doymamış koşullarda 6 altında indirilir. Böylece, bakteri ve besin genellikle fiziksel ayrılır ve besin erişilebilirlik 3 sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, sürekli bir su-fazı gerektirmez kimyasal bileşikler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Yemekleri, Slaytlar ve Kuluçka Odaları 1. Hazırlık
- Her mikrokozmos için aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: bir büyük plastik Petri kabı alt (d = 10 cm), modifiye edilmiş bir (adım 1.2) kapaklı küçük plastik Petri kabı alt (d = 5 sm) ve üç oyuğa sahip bir sayım bölmesi slayt.
- Petri kabı alt parça istenilen sayıda (d = 5 sm) alın. Tam bir slayt (26 mm kenar uzunluğu) uygun bir testere ile ağzına kısmını çıkarın. Sistemi sterilize etmek için,% 70 etanol O / N Petri dipleri ve kapaklarını ıslatın ve UV-ışığı altında bir akış dolabında en az 2 saat onları kurutun. Ayrıca, 2 saat boyunca UV ışığına maruz kalan, sıkıca kapatılmış bir plastik kap içinde P....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan sonuçlar daha önceki 15 yayınlanmıştır. Ayrıntılı mekanik ve çevresel tartışma maddeye bakınız.
CLSM üzerinden görüntü kaydı sonra, maksimum yoğunluk projeksiyon numunenin ilk görsel izlenim ve kontrolleri (Şekil 2) kazanmak için, ilgili mikroskop yazılımı veya ImageJ kullanılarak yapılabilir. Daha sonra, veri setleri belirli görselleştirme yazılımı tarafından anlamlı özelliklerini göstermek için farklı tahmin edilebilir. Pozitif kontrol (CO.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
sunulan evren kurulum misel tarafından alımı ve ulaşım sonra organizmaların aşağılayıcı mekansal ayrılmış kimyasalların biyolojik çalışma uygun kanıtladı. Kısmen uçucu bileşiklerin potansiyel gaz-faz taşıma önlenir ve bakteriyel bioreporter hücrelerinin hassas sistemin minimum rahatsızlık ile böylece ayrıntılı numune hazırlama olmadan görsel ve edilebilmektedir. Aynı zamanda, numunenin kimyasal analizi, kolay bir elde edilen sonuçların iyi kontrolü için, toplam taşıma ölçümü için izin yapılabilir. Ancak, bazı noktalar d.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Alman Çevre Vakfı (DBU) tarafından sağlanan finansman kabul edilmektedir. Yazarlar, CLSM analizinde teknik yardım için Ute Kuhlicke'ye ve yetenekli deneysel yardım için Birgit Würz, Rita Remer ve Jana Reichenbach'a teşekkür eder. Yazarlar, verimli tartışmalar ve biyomuhabir türünü sağladıkları için Prof. Jan Roelof van der Meer ve Dr. Robin Tecon'a özellikle teşekkür etmek isterler. Helmholtz Derneği'nin 'Çevredeki Kimyasallar' (CITE) araştırma programına katkıda bulunur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Solution 2Solution 3
td colspan="4">td colspan="4"> (pH 6.0)
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Konfokal Mikroskop | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Sürüm 2.6.1; veya eşdeğeri CLSM | |
| GC HP 7890 Serisi GC ve Agilent 5975C MSD | Agilent | , eşdeğer bir GC / MS kullanılabilir | |
| GC kılcal kolon J& G 121-5522 | Agilent | ||
| Mantar delici | Fisher Scientific | 12863952 | veya başka herhangi bir |
| Kapak fişi | Marienfeld | 107222 | Yüksek performans, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS şişeleri 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Vidalı kapaklı şişeler için kapaklar / septa | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| GC / MS şişeleri için kapaklar | WICOM | WIC 43948 / B | |
| Objektif Slaytlar | Menzel | sıradan | |
| PDMS kaplı cam elyaflar | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 &artımn; 0.02 &mikro; l m-1 | |
| Petri Tabakları küçük / büyük | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Vidalı kapaklı şişeler 40 ml | DIONEX | 48783 | diğer cam şişeler kullanılabilir |
| Vidalı kapaklı şişeler 60 ml | DIONEX | 48784 | diğer cam şişeler kullanılabilir |
| Asenaftilen d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Aseton | Carl Roth | 9372.2 | |
| Aktif karbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agaroz | Carl Roth | 2267.4 | |
| Floren | Fluka | 46880 | |
| Kanamisin sülfat | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Metanol | Carl Roth | P7171 | |
| < Güçlü > Minimal Orta: < / güçlü> 100 ml Çözelti 1< / güçlü> + 25 ml Çözelti 2< / güçlü> + 5 ml Çözüm 3< / güçlü> ad. 1.000 ml Aqua Dest | |||
| Solution 1 | |||
| Amonyum sülfat | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| >Magnezyum klorür x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Kalsiyum nitrat x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0,5 g L-1< |
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotasyum fosfat | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1< |
| Disodyum EDTA | MERCK | 1084180250 | 0,8 g L-1 |
| Demir(II) klorür x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0,3 g L-1 |
| Kobalt (II) klorür x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganez(II) klorür x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Bakır(II) sülfat | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodyum molibdat x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Çinko klorür | MERCK 1088160250 | 2 mg L-1 | |
| Lityum klorür | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| >Kalay(II) klorür x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Borik asit | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potasyum bromür | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potasyum iyodür | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Baryum klorür | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal orta + agaroz % | ||
| 0.2Fenantren d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Patates Dekstroz Agar: 24 g L-1 et suyu + bacto-agar% 1.5; pH 6.8 | |||
| Patates Dekstroz suyu | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodyum asetat x 3 hidr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodyum sülfat | MERCK | 1066495000 | |
| Toluen | MERCK | 1083252500 | |
| mTY orta: 3 g L-1 maya özütü, 5 g L<>sup-1 bacto tripton ve 50 mM NaCl | |||
| Maya özütü | Merck | 1037530500 | |
| Tripton | Serva | 4864702 | |
| Sodyum klorür | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ, logi araç eklentisi | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ve http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| ilePythium ultimum suşu 67-1 | Dr. Christoph Keel'in laboratuvarından elde edilmiştir; Lozan Üniversitesi, Temel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İsviçre | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Prof. Jan Roelof van der Meer'in laboratuvarından elde edilen; Lozan Üniversitesi, Temel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İsviçre |
Kaynaklar
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
