Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Mitokondri hücrenin birincil enerji üretim alanları ve yaşlanma önemli roller yanı sıra, kalp damar hastalıkları, Alzheimer hastalığı, diyabet, kanser ve aşırı şişmanlık gibi çeşitli yaş ile ilişkili bozukluklar vardır. İzole mitokondri Respirometrik profil elektron taşıma zinciri (OGS) fonksiyonu doğrudan analiz sağlar ve mitokondriyal biyoloji anlayışımız ve sağlık ve hastalık rolüne önemli katkılarda bulunmuştur. İzole mitokondri Bu yazıda anlatılan metodoloji insan denekler elde edilen iskelet kas dokusu biyopsi izole mitokondri Respirometrik analiz izin için optimize edilmiştir vb substrat ulaşım, ATP sentaz aktivitesi, proton sızıntısı, gibi biyoenerjitiklerin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılır. Bu yazıda anlatılan biyopsi protokol son 12 yıldır bizim personel tarafından kullanılmıştır. Grubumuz, çeşitli yaş yetişkin 700'den fazla prosedürleri yürüttü90 yaşına kadar, ve herhangi bir olumsuz güvenlik sorunları olmaksızın çeşitli kronik hastalık koşulları ile. Bu protokolün önemli bir yönü, özellikle böylece klinik araştırmalarda kullanımını kolaylaştıran, doku az miktarda kullanmak için tasarlanmış olmasıdır.

Çeşitli protokoller mitokondri izole edilmesi için geliştirilmiştir. Fernandez-Vizarra ve ^{ark., 1,2} çeşitli fare dokuları gibi kültürlenmiş hücrelerden mitokondri izole etmek için bir yöntem açıklamıştır. Garcia-Cazarin ve ark. ^3, sıçan ve fare iskelet kaslarının mitokondri izole etmek için bir yöntem bildirmiştir. Fare beyninden alınan mitokondri izole edilmesine yönelik bir yöntem olup, aynı zamanda Iglesias-Gonzales ve ark. ⁴ Gross tarafından rapor edilmiştir, ve ark. ⁵ barocycler ve / veya PCT parçalayıcı kullanarak mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor etmiştir. Son zamanlarda, Franco ve ark. ⁶ anti kullanarak zenginleştirilmiş mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor-TOM22 Manyetik boncukları.

Bu protokoller mükemmel sonuçlar elde ederken, doku boyut gereksinimleri Bu yazıda anlatılan yönteme kıyasla yüksek. Örneğin, Gross vd. ⁵ gastrokinemius kası 1.5-1.8 g ve böbrek dokusu yaklaşık 2 g kullanılır. Benzer şekilde, Franco ve ark. ⁶ 500 mg fare karaciğer dokusu kullanılır. Bizim deneyim, tipik verimleri iskelet kası (vastus lateralis) perkütan iğne biyopsisi beklenen 100-200 mg arasında değişir. Burada anlatılan protokol kullanılarak kas dokusunun 20-50 mg mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için yeteneği, diğer moleküler biyoloji deneylerinde gelecekteki kullanım için biyopsi başına ve mağaza örnekleri birden değerlendirmeler yapmalarına izin verir. Bu klinik araştırma ve örneklerin çalışkan kullanımını gerektiren diğer çalışmalarda kritik bir özelliktir. Daha önce dondurulmuş mitokondri oute bağlanmış solunum nedeniyle çalışmak için iyi olmadığını belirtmek gerekirmitokondriyal membran hasarına ve Sitokrom C aktivitesi kaybının r. Bizim yöntemi adapte Chappell ve Perry ⁷ tarafından yayınlanan yöntemle modifiye edilmiştir.

Bu yazıda anlatılan yöntemleri kullanarak, son zamanlarda insan vastus izole mitokondri Respirometrik profil doğrudan yürüyüş hızı ⁸ olarak ölçülen fiziksel yeteneği ile ilişkilidir lateralis olduğunu bildirmiştir.

NOT: Tıp Wake Forest Okulu Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır açıklanan protokol. Aydınlatılmış onam yazılı elde edilmiştir. Tüm katılımcılar 23-35 arasında değişen BYES ile, her iki cinsiyette sağlıklı yaşlı yetişkinler (65-79 yaş) idi.

1. İskelet Kası Biyopsi

1. Daha önce açıklandığı gibi, ⁹ bir O / N hızlı sonra sabahın erken saatlerinde tüm biyopsi. Biyopsi öncesi hafta kanama, trombosit, ya da morarma etkileyebilir aspirin, reçete ve over-the-counter non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar, ya da diğer bileşikleri almaktan kaçınmaları konular isteyin. Ayrıca biyopsi öncesinde en az 36 saat süreyle herhangi bir yorucu hareketlerden kaçınmalısınız isteyin.
   NOT: Kas% 1 lidokain ile lokal anestezi altında perkütan iğne ile perkütan iğne biyopsisi tekniği kullanılarak lateralis vastus elde edilir. Hiçbir tıbbi komplikasyon ya da other prosedürden advers olaylar klinik araştırma biriminde meydana gelmiş bildirildi.
2. NOT: tarif biyopsi işlemi Bergstrom ¹⁰ o uyarlanmıştır.
   1. Kısaca, yerel kas sızmak için% 1 lidokain alma bakım yönetmek. Yeterli uyuşturma izin için 10 dakika bekleyin dönemi ile bu izleyin.
   2. Subfasiyal ve myotendonous alanları kaçınarak kas (ekleme ve menşe arasındaki kasın orta bölge) karnından biyopsi al.
      1. Perkütan iğne (pencere ve iç kesim silindiri kesme bir tarafı ile bir emme destekli yeniden cihaz) kullanın ve bir rehber olarak fasya bir fasiyal "pop" veya direnç izleyin.
      2. , Anestezi iğnesi ile derinliğini tahmin sonra tekrar dar neşter bıçağı ile hissediyorum ve fasya ile 4-5 mm kesi yapmak. O kas içine sokulur kadar kesikten iğne Advance.
      3. Toplamakpencere birden çok numune farklı yönlerde dönmektedir. Ilerleyen ve farklı yönlere perkütan iğne içine 2-4 kez kas örnekleri geri çekilirken bir 60 cc şırınga kullanarak sürekli emme uygulayın. Emiş durdurun ve iğneyi çıkartın.
         NOT: Her geçiş (ekleme ve iğne çıkarılması) bir dakikadan az sürer.
      4. 5 dk hemostaz kurmak için bir asistan sitesine delinmeye firma baskı uygulayın var. Emme boru iğne ayırın ve dikkatle pencere ve varil kas örnekleri çıkarın.
   3. Daha fazla kas Yukarıdaki prosedürü tekrarlayarak gerekirse ikinci bir geçiş yapın.
   4. , Forseps kullanarak kas örneğinden herhangi bir görünür kan pıhtıları çıkarın örneği tartmak ve hemen buz gibi soğuk DPBS içeren bir tüp yerleştirmek.
      NOT: Bu yöntemi kullanarak ortalama verim 150 ± 20 mg.

2. Mitokondriyal İzolasyon

3. Yıkama Mitokondri

1. 10 ° C Yukarıdaki adımda elde edilen süpernatant santrifüj,000 xg, 10 dakika, 4 ° C. 10000 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C 'de CP II tamponu ve daha fazla santrifüj 4 ml pelet süspanse edin.
   NOT: Nadir durumlarda, kan ince bir pelet mitokondriyal pelet altında oluşur. Bu durumda, CPII tamponu ile yavaşça çekilerek mitokondriyal pelet çıkarın. Bu adım adım iyice 2 kanı yıkayarak önlenebilir.
2. CP Ben tampon 2 ml elde pelet Askıya. Bu aşamada, protein kestirimi için bu süspansiyondan küçük bir kısım kullanın. Ben yukarıdaki gibi tampon ve santrifüj CP kalan örnek süspanse. Mitokondriyal Deney Çözeltisi (MAS) ve çok az miktarda (200 ul) son pelet süspanse edin.
   NOT: CP I tampon BSA yok çünkü protein örnekleri daha sonra o BSA var askıya alınacak olan MAS ise, bu aşamada tahlil edilir.

4. tahmin bir BCA Protein Deney kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçme ile mitokondriyal İçerik

Şekil 1, tüm protokol ayrıntılı akış şemasını göstermektedir.

COX IV / GAPDH (Şekil 2), Western blot profilleri mitokondriyal protein COX IV olmayan mitokondriyal marker, GAPDH ekspresyonu tasvir etmektedir. COX IV ve GAPDH hem ifadesi, tüm kas hücresi içerisinde belirgindir. Mitokondri, bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak izole sonra GAPDH aynı pozlama de yokken, COX IV bantları hala belirgindir. Uzun poz bir soluk GAPDH bandı ortaya çıkarabilir. Bu lekeler izole mitokondri az olmayan mitokondriyal kontaminasyonu sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, izole edilmiş bir mitokondri COX IV ekspresyonu örnekler arasında tutarlıdır.

Şekil 3 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak kompleks II (süksinat ve rotenone) tarafından tahrik tipik Respirometrik profillerini göstermektedir. Beklendiği gibi, genel olarak, OCR ağırlık arttırılıri mitokondri yüksek miktarlarda. Bu deney için hesaplanan solunum kontrol oranı (RCR) mitokondriyal hazırlık kaliteli olduğunu belirten, 7.95. Ayrıca, devlet 3u OCR mitokondriyal kalitesini onaylayan, devletin 3 biraz daha yüksektir.

Mitokondri farklı miktarlarda profil oluşturma sırasında sonuç tutarlılığı karşılaştırma amacıyla, ANOVA (Varyans Analizi) oluşturulmuş ve kullanılarak varyans gerçek değerleri olarak kareler (SS) toplamı hesaplanır 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug başına yüklenmiştir iyi (Şekil 4). SS devlet 2, devlet 3, devlet 3U, Antimisin ve RCR sunulmuştur. Devlet 2 ve devlet 3 ölçümler için, tek yönlü ANOVA (sırasıyla, p <0.01 ve p <0.05) istatistiksel olarak anlamlı idi. Benzer şekilde, tek yönlü ANOVA antimycin ve RCR (p <0.01 ve p <0.0001 istatistiksel olarak anlamlı idi, sırasıyla. Anlamlı fark gruplar arasında devlet 3U görüldü. These sonuçlar kuyu başına mitokondri 5,0 mikrogram diğer konsantrasyonlara göre düşük SS verdi ve katılımcıların bizim nüfusa sahip XF 24 sistemde kullanılacak optimum miktarda olduğunu göstermektedir.

Şekil 5 çok mitokondriyal protein ilk kas örneklem büyüklüğü dayalı beklenebilir nasıl göstermek için bir rehber olarak hizmet vermektedir. Beklendiği gibi işlenmiş kas (mg) miktarı ve son numune toplam mitokondriyal protein içeriği (mg) arasında güçlü bir ilişki vardır.

Tablo 1. Çözüm ve tampon tarifleri.

Tablo 2. Mix, ölçmek ve respirometredeki için çevrim ayarını karıştırın.

Şekil tüm protokol 1. Akış Şeması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
Şekil 2. bütün iskelet kası dokusu hem de izole mitokondri için temsili bir Western blot. Tüm doku ekstraktı olarak izole mitokondri olmayan mitokondriyal kontrol mitokondriyal işareti ve GAPDH antikor gibi COX IV antikoru ile bağışık edilmiştir. Hiçbir GAPDH bandı olmayan mitokondriyal kaynaklardan az veya hiç bulaşmayı gösteren izole mitokondri gözlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

İnsan Vastus izole mitokondri Şekil 3. Temsilcisi Respirometrik profil lateralis. Izole mitokondri üç konsantrasyonları, 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug biz Bu tahlilde kullanılan re. Liman enjeksiyondan sonra bileşiklerin Final konsantrasyonları 2 mM ADP (port A) idi; 2 mcM oligomycin (B portu); 6 mcM FCCP (port C); ve 2 mcM A (port D) antimycin. Bu çalışma için hesaplanan RCR 7.95 oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug mitokondri kullanarak farklı mitokondriyal solunum devletler ve RCR için kareler Şekil 4. karelerinin toplamı. Toplamı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ig5highres.jpg "/>
. Şekil 5. Bu ilk kas numune ağırlığı Regresyon analizine dayalı beklenebilir mitokondriyal protein miktarını tahmin etmek için bir rehber olarak kullanılabilir: kas (mg) ve toplam mitokondriyal protein verimi (mg) miktarı. Beklendiği gibi, kas miktarı ve elde edilen toplam mitokondriyal protein arasında doğrudan bir korelasyon vardır.

Yazar George Rogers, bu makalede kullanılan enstrümanı üreten Seahorse Bioscience'ın bir çalışanıdır. Açık Erişim ücretleri Seahorse Biosciences tarafından desteklendi.