Bu protokol, genetik olarak değiştirilmiş, enjekte edilebilir sferoidler kullanan bir hücre nakli sistemini tanımlar. Hücre sferoidleri, mikro desenli kültür plakaları üzerinde kültürlenir ve polipleks nanomiseller kullanılarak gen girişinden sonra geri kazanılır. Bu sistem, hücrelerin doğuştan gelen işlevini korurken, konakçı hayvanlarda nakledilen hücrelerden uzun süreli transgen ekspresyonunu kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Genetik olarak tadil edilmiş hücre transplantasyonu için Micropatterned kültür plakalarında Sferoid hücrelere karşı gene
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre nakli terapötik etkinliğini artırmak için, genetik olarak tadil edilmiş, enjekte küremsi bir transplantasyon sistemi geliştirilmiştir. Hücre sferoidler bir ısıya duyarlı bir polimer ile kaplanmış micropatterned plakalar üzerinde bir kültür sistemi içinde hazırlanır. Sferoidlerin bir dizi, bir polietilen glikol (PEG) matris ile kaplanır yapıştırıcı olmayan bölgeler tarafından sarılmış düzenli olarak iki boyutlu bir şekilde dizilmiş olan 100 um çaplı hücre yapışma alanları, tekabül eden plakalar üzerinde oluşturulur. sferoidler kolay plakaların sıcaklığın düşürülmesiyle, bir sıvı süspansiyon olarak elde edilebilir, ve bunların yapısı iyi (27 g fazla) yeteri kadar büyük bir kalibreye sahip enjeksiyon iğneleri içinden geçirilerek muhafaza edilmektedir. Genetik modifikasyonlar küremsi yapıyı bozmadan hücrelerine gen dahil etme yeteneğine sahip olan, orijinal viral olmayan gen taşıyıcı, Polyplex nanomicelle, kullanılarak gen transfeksiyonu ile elde edilir. Prim içinalbümin ekspresyonu ile gösterildiği gibi, bir lusiferaz sentezleyen bir gen ile transfekte ary hepatosit sferoidler, lusiferaz sürdürülebilir, korunmuş hepatosit işlevi ile birlikte, nakledilen hayvanlarda elde edilir. Bu sistem, mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere hücre tiplerinin çeşitli uygulanabilir.
Giriş
Hücre nakli tedavisi çeşitli inatçı hastalıkların tedavisi için yaygın ilgi gördü. nakledilen hücreler tarafından salgılanan aktivite ve biyolojik olarak aktif faktörlerin yarı-ömrü, bir hücre transplantasyonu sisteminin geliştirilmiş bir terapötik etkinliği için önemlidir. Transplantasyon öncesinde hücrelerin genetik modifikasyon düzenleyen ve biyolojik olarak aktif faktörlerin salgılanması da dahil olmak üzere hücresel fonksiyonları, işlemek için faydalı bir tekniktir. Bu hücre ölümünü ya da hücre aktivite kaybını önlemek için bir hücre için uygun bir mikro-ortam sağlamak için de önemlidir. Hücre-hücre etkileşimleri iyi korunmuş olan üç boyutlu (3D) küremsi hücre k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan çalışmaları, Tokyo Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, Tokyo, Japonya onayı ile yürütülmüştür.
1. Hücre Hazırlanması
- Birincil hepatosit için, bir tadil edilmiş, iki basamaklı bir kollajenaz digestiyonu işlemi 13,14 sıçan hepatosit izolasyonu için protokol takip edin.
- Izofluran ile inhalasyon anestezi altında Sprague Dawley (SD) sıçanları (erkek, 5 haftalık) anestezisi. Bölmesi için izofluran sağlamak için bir anestezi makinesine bağlı bir odasında bir sıçan yerleştirin. Uykuya dalmakta sonra sıçan dışarı atın ve bir maske kullanarak havalandırma ile ameliyat masasında ayarlayın. Sıça....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gaussia lusiferaz sentezleyen pDNA gene Polyplex nanomicelles veya kontrol lipit bazlı transfeksiyon reaktifi 12'yi kullanarak hepatositlere ya da MSC tarafından oluşturulan sferoidler uygulandı. kontrol reaktif anlamlı transfeksiyon (Şekil 3) bir gün sonra bir yapı kesintiye ise nanomicelles micropatterned tabakalarına transfekte-olmayan sferoidler kıyasla küremsi yapısı hemen hemen herhangi bir değişiklik neden olmuştur. Nanomicelles tutarlı albümini sekresyonu ve transgen (Gaussia lusi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, gen girişi ve küremsi iyileşme aşamaları sırasında sferoitlerin 3 boyutlu yapısını muhafaza etmek önemlidir. Hücreler, hücre ölümünü ya da hücre aktivitesi kaybını önlemek için bir uygun mikroçevrelerde korumak için esastır. Geleneksel tek katmanlı kültürdeki hepatositler, hızla 12 tohumlamadan sonra, bir kaç gün kendi salgılama kapasitesini kaybeder Örneğin, albümin salgılama, hepatositlerin temsili bir doğuştan gelen işlevi, iyi, hepatosit sferoidler korunur. MKH için, sferoidler anlamlı adipog.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Biz derin termosensitif micropatterned kültür plakaları yanı sıra bilimsel danışmanlık sağlamak için Toyo Gosei, Tokyo, Japonya'da Dr Takeshi Ikeya ve teknik personel için teşekkür ederiz. Biz de hayvan deneyleri ile teknik yardım için Sayın Satomi Ogura, Bayan Sae Suzuki, Bayan Asuka Miyoshi ve Bayan Katsue Morii teşekkür ederiz. Bu eser mali JSPS KAKENHI Grant-Aid Bilimsel Araştırma tarafından kısmen desteklenen, İnovasyon (ÇÇ) Programı Merkezi ve Japonya Bilim ve Teknoloji Kurumu (JST) den S yenilik programı ve JSPS core için Çekirdekli Programı, A. İleri Araştırma Ağları.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kalem-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Deksametazon | Wako Saf Kimya Endüstrileri | 041-18861 | |
| Nikotinamid | Wako Saf Kimya Endüstrileri | 141-01202 | |
| Hank ' s tamponlu tuz ve L-askorbik asit 2-fosfat (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| İnsan epidermal büyüme faktörü (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Hücreli çok kuyulu plakalar | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Isıya duyarlı hücre kültürü plakaları (Upcell) | CellSeed Inc | Mikro desenli mimari, ısıya duyarlı plakalar üzerine inşa edilmiştir (Toyo Gosei tarafından özel olarak üretilmiştir) | |
| Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Lusiferaz Test Sistemi | Promega | E2810 | |
| pGL4 Lusiferaz Raportör Vektörü | Promega | E6651 | |
| pDNA eksprese eden Gaussia lusiferaz | New England BioLabs | N8082S | |
| Fare ertropoietin eksprese eden vektör | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Pluripotent Hücre Çalışmaları Laboratuvarı, Gelişimsel Biyoloji Merkezi, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5 ve alfa; yetkili hücreler | tarafından sağlanmıştır Takara | 9057 | |
| Endotoksin içermeyen plazmit DNA saflaştırma sistemi | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Kollajenaz | Wako Saf Kimya Endüstrileri | 639-00951 | |
| Tripsin inhibitörü | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometre | Promega | GloMax ve ticaret; 96 Mikroplaka Luminometre | |
| IVIS Görüntüleme Sistemi | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spektrumu in vivo görüntüleme sistemi | |
| Kan örneği analizörü | Sysmex | pocH-100i Otomatik Hematoloji Analizörü |
Kaynaklar
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
