Kemoterapi ve radyasyon bakım standardının lenfodepletiktif ve immünomodülatör etkileri, T hücresi immünoterapisinin antitümör etkinliğini artırmak için kullanılabilir. EGFRvIII'e özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin üretilmesi ve bunların glioblastoma bakım standardı bağlamında uygulanması için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Evlat edinen T hücre immünoterapisi, malign gliomları spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için umut verici bir strateji sunar. T hücreleri, glioma antijenlerine (CAR T hücreleri) özgü kimerik antijen reseptörlerini eksprese etmek için ex vivo olarak tasarlanabilir. Evlat edinerek transfer edilen CAR T hücrelerinin genişlemesi ve işlevi, standart bakım kemoterapisi ve radyoterapinin lenfodepletive ve tümörisidal etkileri ile güçlendirilebilir. Glioma spesifik bir antijen olan EGFRvIII'ü hedefleyen CAR T hücreleri üretmek ve glioblastoma bakım standardının bir murin modeli ile birleştirildiğinde etkinliklerini değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. T hücreleri, anti-EGFRvIII CAR genini içeren retroviral bir vektör ile transdüksiyon yoluyla tasarlanır. Tümör taşıyan hayvanlar, klinik bakım standardını modellemek için tasarlanmış doz rejimlerinde bir temozolomid ve tüm beyin ışınlaması ile konakçı koşullandırmaya tabi tutulur. CAR T hücreleri daha sonra intravenöz olarak hazırlanmış konakçılara verilir. Bu yöntem, bakım standardı bağlamında CAR T hücrelerinin antitümör etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Giriş
Glioblastoma (GBM) en sık görülen habis beyin tümörü ve daima ölümcüldür. Bakım kemoterapi ve radyoterapi non-spesifik standart ile birleştiğinde cerrahi rezeksiyon tamamen bu hastalığı 1 olan hastalarda en az 15 ay kasvetli prognoz sonuçlanan malign hücreleri ortadan kaldırmak için başarısız olur. Bunun aksine, immüno spesifik olarak tümör hücrelerini hedef alan için kesin bir yaklaşım sunmaktadır ve bu nedenle yan toksisite 2-4 riskinin azalması ile, yüksek ölçüde etkili bir tedavi platformu olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. T hücreleri kimerik antijen reseptörleri (arabaların) tümör immünoterapi için çok yönlü bir strateji sunmak ifa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol 10 fareler 10 7 ARAÇ T hücreleri, her ile tedavi edilir bir deneysel tasarım dayanmaktadır. Bu durum, 10 8 ARAÇ T hücreleri gerektiği anlamına gelir; verim canlılığı kaybı hesabına 5 x 10 7 -1 x 10 8 tarafından abartılmıştır edilmelidir. Aşağıdaki protokol yaklaşık 200 x 10 6 hücre oluşturmak için ölçeklenir. Hücreler daha sonra, mevcut KR158B astrositom veya B 16 melanoma hücre hatları geliştirilen, 9 gün kurulmuş singeneik EGFRvIII pozitif kafatası içi tümörlerine sahip dişi C57BL / 6 farelerine damar içinden tatbik edilir. Buna paralel ARAÇ T hücresi üretimi ile, tümör taşıyan farelerin lymphodeple....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
ARAÇ T hücreleri EGFRvIII ARAÇ retroviral vektör 11 transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu vektör, MSGV1, murin stem hücre virüsü (MSCV) uzun terminal tekrarı, genişletilmiş öğürme bölgesi ve zarf ekleme sahası içeren SFGtcLuc_ITE4 vektörü 35, geliştirilmiş (bağlayıcı verici, SD, ve alıcı ekleme sa) ve viral edildi paketleme sinyali (ψ). Sıçangil CD8TM ile birlikte insan anti-EGFRvIII tek zincirli değişken fragmanı (scFv) 139 ihtiva eden EGFRvIII ARAÇ CD28, 4-1BB ve CD3ζ hücre içi bölgeleri, alt-retro.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada anlatılan tedavi çizelgesi bakım, klinik standart modeli ve ARAÇ evlat edinen tedavisi için etkisini kaldıraç için tasarlanmıştır. ARAÇ T hücresi doz TMZ rejimleri ve radyoterapi uygulama vivo T hücre aktivitesi, lymphodepletion ve tümör öldürülmesi geliştirmek için modifiye edilebilir. TMZ rejimleri ana miyeloablasyon ile adoptif transfer hücreler 30 artmış genişleme elde etmek için arttırılabilir. Böylece SOC tümörisidal özelliklerini engellemeyi, - (6 Gy 4) Tek fraksiyonu total vüc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, CAR retroviral yapısını sağladıkları için Dr. Laura Johnson ve Dr. Richard Morgan'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Giao Ngyuen'e tüm beyin ışınlaması için dozimetri konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma, bir NIH NCI hibesi 1R01CA177476-01 ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pCL-Eco Retrovirüs Paketleme Vektörü | Imgenex | 10045P | CAR retrovirüsü oluşturmak için yardımcı vektör |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | T hücresi proliferasyonunu ve viral transdüksiyonu indüklemek için spesifik olmayan mitojen |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | T hücrelerinin retroviral transdüksiyonunu kolaylaştırır |
| Lipofektamin 2000 | Yaşam Teknolojileri | 11668-019 | Transfeksiyon reaktifi |
| DMEM, yüksek glikoz, piruvat | Yaşam teknolojileri | 11995-065 | HEK293 kültür ortamı |
| RPMI 1640 | Yaşam Teknolojileri | 11875-093 | T hücre kültürü ortamı |
| Opti-MEM I İndirgenmiş Serum Ortamı | Yaşam teknolojileri | 11058-021 | Transfeksiyon ortamı |
| 200 mM L-Glutamin | Yaşam teknolojileri | 25030-081 | T hücre kültürü ortamı takviyesi |
| 100 mM Sodyum Pirüvat | Yaşam teknolojileri | 11360-070 | T hücre kültürü ortamı takviyesi |
| 100X MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi Yaşam | teknolojileri | 11140-050 | T hücre kültürü ortamı takviyesi |
| 55 mM 2-Merkaptoetanol | Yaşam teknolojileri | 21985-023 | Serbest radikalleri uzaklaştırmak için indirgeyici ajan |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml) | Yaşam teknolojileri | 15140-122 | T hücre kültürü ortamı takviyesi |
| Gentamisin (50 mg/ml) | Yaşam teknolojileri | 15750-060 | T hücre kültürü ortamı takviyesi |
| GemCell U.S. Origin Fetal Sığır Serumu | İkizler Biyo Ürünler | 100-500 | in vitro hücre büyümesi için büyüme faktörleri ve besinler sağlar |
| . Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V– Standart Sınıf | Gemini Bio Products | 700-100P | Retrovirüsün retronektin kaplı plakalara spesifik olmayan bağlanmasını engeller |
| Pharm Lyse (10x konsantre) | BD Biosciences | 555899 | Splenosit işleme sırasında kırmızı kan hücrelerini parçalar |
| 70 & mu; m Steril Hücre Süzgeçleri | Corning | 352350 | Splenosit işleme sırasında büyük doku parçacıklarını filtreler |
| 100 mm Poly-D-Lizin Corning 356469 İçeren BioCoat Kültür Kapları | Transfeksiyondan sonra proliferasyonu en üst düzeye çıkarmak için HEK293 hücre yapışmasını destekler | ||
| [header]Temozolomide En İyi Pharmatech N/A Uygulama gününde hazırlanan liyofilize toz | |||
| Dimetil Sülfoksit | Sigma Yaşam Bilimleri | D2650 | Temozolomid |
| Salin | Hospira | IM 0132'nin tamamen çözünmesi için gerekli (5/04) | Temozolomid ve ketamin/ksilazin için çözücü |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Hayvan Sağlığı | 11695-0701-1 | Ketamin çözeltisi |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Ksilazin steril çözeltisi 100 mg/ml |
Kaynaklar
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
