Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

20.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52397

⸱

16 Şubat 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

Bu makalede

Özet

Kemoterapi ve radyasyon bakım standardının lenfodepletiktif ve immünomodülatör etkileri, T hücresi immünoterapisinin antitümör etkinliğini artırmak için kullanılabilir. EGFRvIII'e özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin üretilmesi ve bunların glioblastoma bakım standardı bağlamında uygulanması için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz.

Özet

Evlat edinen T hücre immünoterapisi, malign gliomları spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için umut verici bir strateji sunar. T hücreleri, glioma antijenlerine (CAR T hücreleri) özgü kimerik antijen reseptörlerini eksprese etmek için ex vivo olarak tasarlanabilir. Evlat edinerek transfer edilen CAR T hücrelerinin genişlemesi ve işlevi, standart bakım kemoterapisi ve radyoterapinin lenfodepletive ve tümörisidal etkileri ile güçlendirilebilir. Glioma spesifik bir antijen olan EGFRvIII'ü hedefleyen CAR T hücreleri üretmek ve glioblastoma bakım standardının bir murin modeli ile birleştirildiğinde etkinliklerini değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. T hücreleri, anti-EGFRvIII CAR genini içeren retroviral bir vektör ile transdüksiyon yoluyla tasarlanır. Tümör taşıyan hayvanlar, klinik bakım standardını modellemek için tasarlanmış doz rejimlerinde bir temozolomid ve tüm beyin ışınlaması ile konakçı koşullandırmaya tabi tutulur. CAR T hücreleri daha sonra intravenöz olarak hazırlanmış konakçılara verilir. Bu yöntem, bakım standardı bağlamında CAR T hücrelerinin antitümör etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Glioblastoma (GBM) en sık görülen habis beyin tümörü ve daima ölümcüldür. Bakım kemoterapi ve radyoterapi non-spesifik standart ile birleştiğinde cerrahi rezeksiyon tamamen bu hastalığı 1 olan hastalarda en az 15 ay kasvetli prognoz sonuçlanan malign hücreleri ortadan kaldırmak için başarısız olur. Bunun aksine, immüno spesifik olarak tümör hücrelerini hedef alan için kesin bir yaklaşım sunmaktadır ve bu nedenle yan toksisite 2-4 riskinin azalması ile, yüksek ölçüde etkili bir tedavi platformu olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. T hücreleri kimerik antijen reseptörleri (arabaların) tümör immünoterapi için çok yönlü bir strateji sunmak ifade ex vivo mühendislik. Arabaların kompleks, tam uzunlukta, başlıca doku uyumu yerine, bir ya da daha fazla hücre içi T hücresi sinyal molekül (ler) ile bir antikorun hücre dışı değişken bölgesini füzyon tarafından üretilen (MHC) bir T hücresi reseptörü 5 -restricted. Antikor benzeri antijen Tanıma ve ödüller Bu modreaktif antijen spesifik T hücreleri tanımak ve MHC olmadığı halde tümör antijenlerine yanıt ve hemen hemen sonsuz bir antijen repertuar için uyarlanabilir edilmesi için, izin verir.

Tümör antijenlerinin çeşitli karşı tasarlanmış ARAÇ T hücreleri klinikte 6-9 preklinik etkinliğini ve üstün söz göstermiştir. Özellikle, GBM kapsamında, bir ARAÇ T hücresi platformu hedefleme epidermal büyüme faktörü reseptörü varyantı III (EGFRvIII), tümöre özel bir mutasyon hücre yüzeyi 10 üzerinde eksprese, gliom taşıyan farelere 11 ömrünü uzattığı gösterilmiştir. Çeşitlilikleri rağmen, ARAÇ adoptif tedavi klinik yarar tamamen bağlı tümör bağlantılı bağışıklık bastırma ve bağışıklık kaçırma 12-16 olarak oluşturulması ve in vivo olarak antijen-spesifik T hücrelerinin korunmasında zorluklar kısmen fark edilmemiştir. Immünoterapi ile bakım (SOC) standardını yararlanan potansiyel bu l birkaç üstesinden gelebilirtaklidi, hem klinik öncesi ve klinik ortamda gelişmiş etkinlik ile sonuçlanmaktadır.

Sonrası rezeksiyon GBM için SOC yüksek doz temozolomide (TMZ), bir DNA alkilleyici ajan 17, ve tüm beyin ışınlaması (TBI) oluşur 1. Bu tedaviler, tümör MHC ekspresyonunun 18-20 yukarı regülasyonu ve ölü tümör hücreleri 17,19,21,22 ile antijen dökülme ile tümör aşıları ile sinerji olduğu kabul edilir. Nitekim, klinik öncesi ortamda bağışıklık temelli tedaviler geliştirilmiş antitümör etkinliğine TMZ 20,23 veya 18,24 WBI potansiyel eklenmesi. Ayrıca, birçok non-spesifik sitotoksik kemoterapötik gibi, TMZ evlatlık tedavi platformları 27-29 host-klima aracı olarak kaldıraçlı olabilir sistemik lenfopeni 25,26, neden olduğu bilinmektedir. TMZ aracılı lymphodepletion bir ADOP artan etkinliğine yol açan antijen-spesifik T hücrelerinin frekansı ve fonksiyonunu artırmak için gösterilmiştirintrakranial tümörlere karşı 30 tif tedavi platformu. ARAÇ tedavisi bağlamında, lymphodepletion hem böylece anti-tümör aktivitesi 11,34 artırılması, endojen bastırıcı T hücreleri 31 sayısını azaltır ve sitokinlerin 33 için daha az rekabet ettirilerek homeostatik proliferasyonu 32 uyararak konakçı klima bir araç olarak hizmet eder. SOC bağlamında yeni evlat edinen tedaviler ve aşı platformları değerlendirilmesi etkinliğine ilişkin anlamlı sonuçlar çizim için kritik GBM SOC ve immünoterapi platformlar arasında sinerjik bir ilişki göz önüne alındığında.

Bu protokol, EGFRvIII pozitif tutan tümörler (tedavi zaman çizelgesi için bakınız Şekil 1) taşıyan farelerde TMZ ve WBI birlikte sıçangil EGFRvIII özgü ARAÇ T hücrelerinin üretimi ve damar içine uygulama için bir yöntem özetlemektedir. Kısaca, ARAÇ T hücreleri retroviral transdüksiyon tarafından ex vivo yapılır. İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T Hücreler daha sonra hasat edilmiş ve paralel olarak kültürlenir aktif sıçangil splenositlerin nakletmek için kullanılan virüs üretmek için (ARAÇ vektör ve PCL-Çevre plazmidleri içeren) bir DNA / lipid kompleksi kullanılarak transfekte edilir. ARAÇ üretimi sırasında, EGFRvIII pozitif intrakraniyal tümörleri taşıyan sıçangil ana klinik SOC kıyaslanabilir dozlarda parçalanmış tüm beyin X-ışını radyasyon ve sistemik TMZ tedavisi uygulanır. ARAÇ T hücreleri daha sonra lymphodepleted bilgisayarlar intravenöz teslim edilir.

Aşağıdaki prosedür, yedi ayrı haldeki evreler içinde tarif edilmektedir: Tümör taşıyan, Tümör taşıyan fareler (2) tüm beyin ışınlama, fareler (3) Transfeksiyonu için temozolomid (1) Uygulama (4) splenektomi ve T hücre hazırlanması, (5 Tümör taşıyan fareler için (6) CAR T hücre Kültür ve Hasat ve (7) CAR T hücre yönetimi) İletimi. Bu aşamalar 6-7 güne yayılan ve aynı anda yapılmaktadır birkaç adım oluşmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol 10 fareler 10 7 ARAÇ T hücreleri, her ile tedavi edilir bir deneysel tasarım dayanmaktadır. Bu durum, 10 8 ARAÇ T hücreleri gerektiği anlamına gelir; verim canlılığı kaybı hesabına 5 x 10 7 -1 x 10 8 tarafından abartılmıştır edilmelidir. Aşağıdaki protokol yaklaşık 200 x 10 6 hücre oluşturmak için ölçeklenir. Hücreler daha sonra, mevcut KR158B astrositom veya B 16 melanoma hücre hatları geliştirilen, 9 gün kurulmuş singeneik EGFRvIII pozitif kafatası içi tümörlerine sahip dişi C57BL / 6 farelerine damar içinden tatbik edilir. Buna paralel ARAÇ T hücresi üretimi ile, tümör taşıyan farelerin lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) ve WBI (16.5 Gy) klinik açıdan anlamlı dozlarda tatbik edilmektedir.

Fareler muhafaza ve Duke Üniversitesi Tıp Merkezi (DUMC) ile patojensiz şartlar altında yetiştirildi. Tüm hayvan deneyleri Duke Üniversitesi Kurumu tarafından onaylanan protokollere göre yapıldıEl Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC).

Tümör taşıyan fareler için temozolomidin 1. İdare

Gün ile 4 0:

  1. Farelerin sayısı enjekte edilecek hesaplayın ve yayılma (16.5 mi TMZ hesaba (örneğin, 30 farenin x 0,5 ml = 15 mi TMZ) ihtiyaç TMZ çözeltisi miktarını belirlemek ve bu birime 1.5 mi eklemek için 0.5 ile çarpın ).
  2. 3 mg bu toplam hacmi çarpın / ml gerekli liyofilize TMZ ağırlığını belirlemek için (örneğin, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). 50 ml'lik konik içine bu tartılır.
    DİKKAT: TMZ inhalasyon, sindirim ve gözlerle, cilt ile temasında ve mukozal membranlar tarafından toksiktir. Maruz kalma riskini azaltmaya yönelik öneriler için kurumun iş güvenliği ve / veya çevre sağlığı ve sağlıklı yaşam departmanı danışın.
  3. Dimetil sülfoksit hacmini belirlemek için 0.15 ile toplam hacmi çarpın (DMSO) (örn, 16.5 x gerekli0.15 = 2,475 mi DMSO). Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron filtre içinden DMSO Bu hacim (artı yayılma için hesap ilave 2 ml) içinde sterilize edilir. TMZ toz, steril DMSO 2,475 mL ekleyin.
  4. 10-15 dakika süre ile 65 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde, su içinde bir çanak içinde TMZ / DMSO çözeltisi yerleştirin. TMZ tamamen çözüldükten sonra çözelti, renk soluk sarı bir olmalıdır; Çözelti pembe olursa, o zaman TMZ parçalanır ve yeni bir solüsyon TMZ taze bir çok hazırlanmalıdır.
  5. Toplam hacmi (0.85 x 16.5 ml = 14,025 ml serum fizyolojik) tarafından 0.85 çarpılarak gerekli steril serum fizyolojik uygun hacmini hesaplayın. 50 ml'lik bir konik steril tuzlu su içinde 15 ml ilave edilir. TMZ DMSO, 65 ° C ısı tuzlu su içinde eritilmesi iken.
  6. Girdap TMZ / DMSO çözeltisi TMZ tozu tamamen çözündürüldü ve yavaş yavaş TMZ / DMSO çözeltisi ısıtılmış tuzlu su eklemek olduğundan emin olmak için.
  7. Hemen hazırlandıktan sonra, tam 15 x 1 ml tüberkülin syring yük4 gün yerleşik tümör taşıyan farelere tatbikat için TMZ çözeltisi ile es.
  8. Beş TMZ idarelerinin toplam 4 arasındaki günlerde 1 bu işlemi tekrarlayın.

Tümör taşıyan fareler 2. Tüm Beyin Işınlama

Gün 2 ile 4:

  1. X-ışını irradiator Güç ve ısınma tam gerilime izin verir. Uygun filtre yeri ve giriş doğru voltaj ve akım ayarları (Şekil 2A) olduğundan emin olun.
    NOT: irradiator ve dozimetre gerilim ayarları ve ızgara düzeni (Şekil 2A, B) Uygun belirlemek için önceden tesis edilmelidir.
  2. 5.5 Gy X-ışınlarıyla neden gerekli süreyi hesaplayın. X-ışınları 2 Gy / dk'lık bir hızda verilmektedir, örneğin, daha sonra 2.75 dakika 5.5 Gy toplam sağlamak için gereklidir. Giriş uygun zaman süresi.
    Not: Tablo 2 fare WBI bir ölçerleri sağlarİnsanlarda ND klinik benzerleri. Yüksek dereceli gliomlarda bağlamında, 60 Gy TBI (6 hafta boyunca 2 Gy fraksiyonları, 5 gün / hafta) parçalandı bakım klinik standart ve burada kullanılan kemirgen eşdeğer 16.5 Gy (Gy x 3 5.5) 'dir.
  3. 2 mi ketamin ve nihai çözelti, 10 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin olduğu şekilde, 1 ml ksilazin mi 17 tuzlu su ekleyerek sistemik anestezi için, ketamin / ksilazin taze bir çözelti hazırlayın.
  4. Fareler tartılır ve hayvanlar 100 mg / kg ve 10 mg / kg ksilazin ile ketamin dozu almış gibi vücut ağırlığının gramı başına karın içinden ketamin / ksilazin 10 ul yönetmek. Fareler tamamen uyuşturulmuş ve gözle görülür ketamin / ksilizin yönetiminin 2 dakika içinde nefes olmalıdır.
  5. Sedasyon hayvanlarda göz nemi korumak için, yavaşça her göz yapay gözyaşı merhem küçük bir miktar sürün.
  6. Kafaları en yüksek X-ray aldığı alanda konumlandırılmış şekilde ızgara üzerinde sedasyon fareler yerleştirintensit (Şekil 2B, C). Aşağı uygun olan boyundan kalkan organları sistemik X-ışını teslim (Şekil 2B) engellemek için kurşun boru büyüklüğünde.
  7. Izgara düzeni X-ışını demetinin odak noktasını gösteren lazer koordinat (0,0) olacak şekilde X-ışını altında konumlandırılmış fareler yerleştirin. X-ışını teslim başlayın.
  8. X-ışını teslim tamamlandığında, sıcak ısıtma yastığı irradyatör ve yerden hayvanları kaldırın. Hayvanlar sternum recumbence korumak için yeterli bilinci yerine kadar bilinçli hayvanlar ile sedasyon hayvanları ev etmeyin. Hayvanlar, sternum recumbence korumak geri uygun kafeslerinde bilinçli hayvanları yerleştirebilirsiniz kez.
  9. Radyasyon üç bölünmüş dozlarda olmak üzere toplam gün 3 ve 4 bu prosedürü yineleyin.

3. Transfeksiyon

Gün -1:

  1. Dulbecco M, 500 ml, 50 ml cenin sığır serumu (FBS) ilave edilerek D10 ortamı hazırlamakdeğişmemiş Eagle Ortamı (DMEM).
  2. 500 ml RPMI-1640 ortamı için 5,5 ml L-glutamin, 5.5 ml sodyum piruvat, 5.5 mi temel olmayan amino asitler ve 5,5 ml penisilin / streptomisin (pen / strep) ilave edilerek, T hücre ortamı (TCM) hazırlayın. Daha sonra, 2-merkaptoetanol ve 550 ul gentamisin 550 ul ilave edin. Son olarak, 50 mi FBS ekleyin.
  3. Hasat, in vitro kültürlenmiş HEK293T hücreleri ve D10 ortam içinde 7.5 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona getirin.
  4. Levha 10 mi D10 ortamı ve 16 x 10 cm, poli-D-lisin (PDL) kaplı plakalar her HEK293T hücre süspansiyonu 1 ml.
  5. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edin.

Gün 0:

  1. Hücreleri transfecting önce 10 ml taze D10 en az 30 dakika Ortamı değiştirin.
  2. + 1 (= 17 + 16 1) 14.1 ng plakalar toplam sayısı ile çarpılarak transfeksiyon için gerekli olan vektör plazmidinin miktarı, PCL-Çevre vektörü ve lipozomal transfeksiyon reaktifi belirlemekvektör plazmid (14.1 x 17 = 239,7 mikrogram), 9.9 ug PCL-Eko vektörü (9.9 x 17 = 168,3 mikrogram) ve 60 ul lipozomal transfeksiyon reaktif (60 x 17 = 1.020 ul). Tüm reaktifler çözeltilerin hazırlanması önce oda sıcaklığında olmalıdır.
  3. Tüp A içinde iki boruyu, A ve B Etiket 239,7 ug vektör plazmidi ile (1.5 x 17) ile 168.3 mg PCL-Çevre vektörü eklemek indirgenmiş serum kartal ortamı (RS-MEM) modifiye ml olmuştur. Tüp B'de, (1.5 x 17) ml'lik RS-MEM 1020 ul lipozomal transfeksiyon reaktif ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ayrı ayrı A ve B inkübe edin.
  5. (1-2 saniye boyunca girdap ya da birkaç kez ters çevirin) hafifçe bir arada A ve B karıştırın ve lipid / DNA kompleksi oluşturmak üzere oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
  6. 10 cm'lik bir tabakta HEK293T hücrelere damla Lipid / DNA kompleksi damla ekleyin.
  7. 6-8 saat için 37 ° C'de inkübe veya gece (24 saat aşmayın).
  8. 6-8 saat kuluçkadan sonra viral üretim için taze TCM 12 ml orta yerine. Bu medya kaplamaT hücre transdüksiyonu için viral süpernatan olarak 2 gün kullanılacaktır.

4. splenektomi ve T-hücresinin hazırlanması

Gün 0:

  1. Dalak toplama süre ile buz üzerinde 50 ml konik ve yerine TCM 10 ml dökün.
  2. CO2 asfiksiyasyonu ve ikincil başları kesilerek hayvanların uygun sayıda Kurban: Talep hayvanlar Amerikan Veteriner Tıp Derneği kılavuzlar (en fazla 5 hayvan olabilir başına% 10-30 kafes hacim / dakikalık bir akış hızında CO2 alan bir kafeste solunum sonlandığı kadar ve bundan sonra iki dakika için) aynı anda kurban. CO 2 odasından hayvanları kaldırın ve başını kesmek.
    Not: Yaklaşık 4.5-5 x 10 7 splenositlerin verecek bir 6-12 haftalık dişi C57BL / 6 fare dalak biri. Burada, 4 dalakları yaklaşık 200 x 10 6 hücre hasat edilir.
  3. Sağ tarafı yukarı bakacak şekilde fareyi Lay, ve% 70 etanol ile sprey. Forseps ile, sol göğüs kafesi altında derinin ince bir kat kapmak ve makas ile hafif bir kesi kesti. Peel geri cilt, dikkatle forseps ile periton ince bir kat kapmak ve bir küçük boşluğu kesti.
  4. dalak düzleştirilmiş fasulye benzer bir küçük, ince uzun, koyu kırmızı bir organdır; ince çevreleyen bağ dokusu uzak keserek forseps ve tüketim ile dalak kapmak. Buz üzerinde TCM 10 ml içeren konik içine eksize dalak yerleştirin.
  5. 70 mikron gözenekli bir hücre süzgecinden fazla dalak dökün ve tek bir hücre süspansiyonu üretmek için 5 ml'lik bir şırınga içinde bir kör ucu olan ezme ile ayrıştırılacaktır. İki dalak maksimum örgü süzgeç başına tasnif edilmiş olmalıdır.
  6. Dikkatle kalan splenositlerin toplamak için parçalanmalanna aşağıdaki süzgeç yıkamak için TCM küçük bir hacim kullanın. Bir tek hücre süspansiyonu halinde tüm ayrıştırılmış dalak havuzda toplayın. Bir yıkama bir TCM'nin ile 50 ml nihai hacim getirin10 dakika için 300 xg'de dönmeye d.
  7. 5 mi 10x lisis tamponu ile 45 ml steril suyun eklenmesiyle 1x lisis tamponu içinde bir çözeltisi hazırlandı. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırma, kırmızı kan hücreleri, 50 ml'lik konik dalak başına 1x lizis tamponu 5 ml tekrar süspansiyon pelet, ortadan kaldırmak için. 5 dalak aşan Eğer, bir 250 ml santrifüj tüp kullanın. 5 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde konik ya da santrifüj tüpü yerleştirin.
  8. Su banyosu parçalama reaksiyonu çıkarın ve 1 at TCM ekleyin: reaksiyonu nötralize etmek lizis tamponu ile 1 oranında. 10 dakika için 300 xg'de iplik yıkayın.
  9. Yukarı ve aşağı pipetleme TCM aspire süpernatant ve tamamen tekrar süspansiyon pelet (2 ml / dalak, 4 dalak için 8 ml toplam).
  10. 190 ul tripan mavisi (01:20 seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul ekleyerek hücreleri saymak. Toplam hücre sayısını elde etmek için 20 x 10 x 4, toplam hacmi (8 ml) dört kareli meydanlarından birinde elde edilen numarayı çarpın (örneğin, 125 hücre x 20 x 10 4 x 8 ml = 200 x 10 6 splenositleri).
  11. 2 ug / ml konkanavalin A (Con A) ve 50 lU / ml rekombinant insan interlökin-2 (rhlL-2) ile desteklenmiş TCM, 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda, hücrelere seyreltin. Bu durumda, 200 x 10 6 splenosit, 8 mi hücreleri, 200 ug ConA ve 5000 IU rhlL-2 92 ml ortamı eklenir.
  12. 4 x 10 6 hücre de her olmak için, 24-çukurlu doku kültürü tedavi levhaların her çukuruna 2 ml hücre ekleme (örneğin, hücre 100 mi, yaklaşık 4 plakayı gerektirir).
  13. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edin.

5. İletimi

1. Gün:

  1. Olmayan doku kültürü sayısı 2 ile hasat dalak numarası (8 plaka 4 dalak için gerekli olan) çarpılması suretiyle transdüksiyonu için gerekli olan, 24 oyuklu plakalar tedavi hesaplar.
  2. Daha sonra, yeniden birleştirici insan fibronektin parçası (RHFF) çözeltisi gerekli hacmi hesaplamakçarpılarak kat plakalarına gerekli (kuyuların toplam sayısı + 3) 0.5 ml x (8 tabak x 24 kuyu = 192 + 3 = 195) 0.5 ml = 97.5 ml x.
  3. 25 ug (97.5 x 25 = 2437,5 ug) ile toplam hacmi çarpılarak 25 ug / ml'lik bir konsantrasyonda RHFF içeren 97.5 ml fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) hazırlayın. 97.5 ml PBS RHFF bu miktar ekleyin.
  4. Kat olmayan doku kültürü başına 0.5 ml PBS / RHFF çözeltisi ilave edilerek, 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi.
  5. 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.

Gün 2:

  1. Olmayan doku kültüründen, PBS / RHFF çözeltisi dökümü 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi.
  2. PBS içinde 1 ml / göz,% 2 sığır serum albümini (BSA) ilave edilir ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Sıkıca plaka upending tarafından BSA çıkarın. 2 ml PBS eklenerek yıkanır.
  4. 250 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, her HEK293T PDL plaka ortamı transfer ederek viral süpernatan toplamak ve 500 x g'de 10 dakika dönerler.
  5. Dikkatle viral SU aktarmakemin oluşmuş olabilecek hücre pelletini rahatsız etmemek için, tatlı bir 250 ml'lik santrifüj tüpüne pernatant.
  6. Nihai hacim RHFF kaplı oyuklara için gereken miktardan daha 3 mi daha gibi viral süpernatan taze TCM ekleyin. Örneğin, 192 RHFF kaplı oyuklara için, 192 + 3 ml = 195 mi, viral süpernatanın hacmi getirmek.
  7. 3 kez her iyi - hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 2 ile kuvöz ve tekrar süspansiyon kültüründe splenositlerin çıkarın. 250 ml'lik konik transfer. Bu adımı hızlandırmak yardımcı olacak transfer edilmeden önce bir steril hazne ile bir çok kanallı pipet kullanarak edin. Daha önce, 10 dakika boyunca 300 x g de tarif edilen ve sıkma sayısı.
  8. RhlL-2 ekleyin, viral süpernatanın 50 IU / ml'lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir. Örneğin, ekleme 50 x 195 = 9,750 IU viral süpernatant 195 ml-2 rhIL.
  9. 1 x 10 6 hücre / ml'de, viral süpernatan içinde yeniden süspanse splenositlerin
  10. RHFF kaplı 24 oyuklu plakalara / oyuk splenosit süspansiyonu 1 ml ilave edilir.
  11. Aşağıdaki ayarlara göre 90 dakika Spin: 770 xg, hızlanma = 4, fren / yavaşlama = 0, 32 ° C.
  12. 50 lU / ml rhIL-2 ile bir TCM çözelti hazırlayın. Örneğin, 10.000 IU rhlL-2 eklenerek 200 TCM solüsyon hazırlanır. Santrifüj işleminden sonra her bir oyuğa rhlL-2 / TCM 1 ml ilave edilir.
  13. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca kültür.

6. CAR T hücresi Kültür ve Hasat

Gün 3 ve 4:

  1. T hücreleri>% 80 izdiham elde ederse, hücreler (bu genellikle günde 3 ya da 4 gün gerçekleşir) bölünmüş olabilir. Hücreleri ayırmak için, hafifçe yukarı pipetleme ve her bir çukura 2-3 kez aşağı ve bir taze 24-yuvalı doku kültürü tedavi plakanın yeni kuyu içine her bir 1 ml hareket eder. Daha sonra, son hacmi, tüm kaynaklarda 2 mi olduğunu, her bir oyuğa bu 50 lU / ml IL-2 ile taze TCM 1 ml.
  2. Hücreler>% 80 izdiham ulaşmak yoksa, yavaş yavaş her üst medyanın 1 ml kapalı pipetle iyi bir buçuk medya değişikliği gerçekleştirmek. D kaçınınmedya çıkarırken alt yerleşmiş hücreler isturbing. RhIL-2 ml 50 IU / içeren taze TCM 1 ml ekleyin.

5. Gün:

  1. 250 ml'lik santrifüj tüpüne süspanse CAR T hafifçe yukarı pipetleme hücreleri ve her bir aşağı 3 kere transfer. 10 dakika için 300 xg'de hücreleri Spin.
  2. Pelet bozmadan Tamamen aspire süpernatant. İkinci bir zaman daha önce tarif edildiği gibi hücre sayımı ve PBS ile yıkayın, bir kez PBS ile yıkayın. Tipik bir ARAÇ T hücre verimi kuyu başına yaklaşık 1 x 10 6 hücre (8 plakaları x 24 kuyu = 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri) 'dir.
  3. 200 ug hacim içinde 1 x 10 7 bir enjeksiyon için 5 x 10 7 / ml'lik bir konsantrasyonda, PBS içinde yeniden süspanse hücreler (örneğin, 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri için, tekrar süspansiyon 3.84 ml PBS pelet yıkanmış).

Tümör taşıyan fareler 7. CAR T hücre İdaresi

5. Gün:

  1. Transpodamardan enjeksiyon için hayvan tesisine buz üzerinde oda sıcaklığı hücreleri. Yük 27 ile insülin şırınga içine 500-1000 ul - tüm kabarcıklar sınırdışı olmasını sağlamak 31 G iğne.
  2. Kuyruk dibinde bir fare tut ve tüp süzgeç olarak yerleştirin.
  3. Ven yukarı bakacak şekilde gergin kuyruk çekin, ve kuyruk ven paralel takarak damara iğne deri altında yaklaşık 1-2 mm kayma. Yavaş yavaş damara 200 ul sınırdışı. İğne doğru damar içine takılırsa, hacim kolayca akacak; Aksi takdirde orada direniş olacak ve iğne kuyruk kaldırılacak ve doğru-takılı yeniden gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ARAÇ T hücreleri EGFRvIII ARAÇ retroviral vektör 11 transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu vektör, MSGV1, murin stem hücre virüsü (MSCV) uzun terminal tekrarı, genişletilmiş öğürme bölgesi ve zarf ekleme sahası içeren SFGtcLuc_ITE4 vektörü 35, geliştirilmiş (bağlayıcı verici, SD, ve alıcı ekleme sa) ve viral edildi paketleme sinyali (ψ). Sıçangil CD8TM ile birlikte insan anti-EGFRvIII tek zincirli değişken fragmanı (scFv) 139 ihtiva eden EGFRvIII ARAÇ CD28, 4-1BB ve CD3ζ hücre içi bölgeleri, alt-retro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada anlatılan tedavi çizelgesi bakım, klinik standart modeli ve ARAÇ evlat edinen tedavisi için etkisini kaldıraç için tasarlanmıştır. ARAÇ T hücresi doz TMZ rejimleri ve radyoterapi uygulama vivo T hücre aktivitesi, lymphodepletion ve tümör öldürülmesi geliştirmek için modifiye edilebilir. TMZ rejimleri ana miyeloablasyon ile adoptif transfer hücreler 30 artmış genişleme elde etmek için arttırılabilir. Böylece SOC tümörisidal özelliklerini engellemeyi, - (6 Gy 4) Tek fraksiyonu total vüc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, CAR retroviral yapısını sağladıkları için Dr. Laura Johnson ve Dr. Richard Morgan'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Giao Ngyuen'e tüm beyin ışınlaması için dozimetri konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma, bir NIH NCI hibesi 1R01CA177476-01 ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pCL-Eco Retrovirüs Paketleme VektörüImgenex10045PCAR retrovirüsü oluşturmak için yardımcı vektör
Concanavalin ASigma AldrichC2010T hücresi proliferasyonunu ve viral transdüksiyonu indüklemek için spesifik olmayan mitojen
RetronectinClonTech/TakaraT100BT hücrelerinin retroviral transdüksiyonunu kolaylaştırır
Lipofektamin 2000Yaşam Teknolojileri11668-019Transfeksiyon reaktifi
DMEM, yüksek glikoz, piruvatYaşam teknolojileri11995-065HEK293 kültür ortamı
RPMI 1640Yaşam Teknolojileri11875-093T hücre kültürü ortamı
Opti-MEM I İndirgenmiş Serum OrtamıYaşam teknolojileri11058-021Transfeksiyon ortamı
200 mM L-GlutaminYaşam teknolojileri25030-081T hücre kültürü ortamı takviyesi
100 mM Sodyum PirüvatYaşam teknolojileri11360-070T hücre kültürü ortamı takviyesi
100X MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi Yaşamteknolojileri11140-050T hücre kültürü ortamı takviyesi
55 mM 2-MerkaptoetanolYaşam teknolojileri21985-023Serbest radikalleri uzaklaştırmak için indirgeyici ajan
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)Yaşam teknolojileri15140-122T hücre kültürü ortamı takviyesi
Gentamisin (50 mg/ml)Yaşam teknolojileri15750-060T hücre kültürü ortamı takviyesi
GemCell U.S. Origin Fetal Sığır Serumuİkizler Biyo Ürünler100-500in vitro hücre büyümesi için büyüme faktörleri ve besinler sağlar
. Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V– Standart SınıfGemini Bio Products700-100PRetrovirüsün retronektin kaplı plakalara spesifik olmayan bağlanmasını engeller
Pharm Lyse (10x konsantre)BD Biosciences555899Splenosit işleme sırasında kırmızı kan hücrelerini parçalar
70 & mu; m Steril Hücre SüzgeçleriCorning352350Splenosit işleme sırasında büyük doku parçacıklarını filtreler
100 mm Poly-D-Lizin Corning 356469 İçeren BioCoat Kültür KaplarıTransfeksiyondan sonra proliferasyonu en üst düzeye çıkarmak için HEK293 hücre yapışmasını destekler
[header]Temozolomide En İyi Pharmatech N/A Uygulama gününde hazırlanan liyofilize toz
Dimetil SülfoksitSigma Yaşam BilimleriD2650Temozolomid
SalinHospiraIM 0132'nin tamamen çözünmesi için gerekli (5/04)Temozolomid ve ketamin/ksilazin için çözücü
Ketathesia HClHenry Schein Hayvan Sağlığı11695-0701-1Ketamin çözeltisi
AnaSedLloyd IncN/AKsilazin steril çözeltisi 100 mg/ml

Kaynaklar

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Glioblastoma Standart BakımıTemozolomid IşınlamasıRetroviral Vektör TransdüksiyonuMurin T Hücresi MühendisliğiEGFRvIII Antijen HedeflemeTüm Beyin IşınlamasıKonak Koşullandırma ProtokolüAkış Sitometrisi AnaliziAdaptif T Hücresi Tedavisi
Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.