Yöntem makalesi

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

DOI:

10.3791/52423

⸱

19 Şubat 2015

 , 
1Centre for Vascular Research, University of New South Wales, 2School of Medical Sciences, University of New South Wales

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hücre-substrat empedansı ve canlı hücre görüntüleme analizleri ile hücre adezyonu ve adezyonu giderme süreçlerini invaziv olmayan bir şekilde yüksek zamansal çözünürlükle sürekli olarak ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımlar, matris modifikasyonu tarafından tetiklenen hücre adezyon/adezyonu kaldırma süreçlerinin dinamiklerini ve bunların adezyona bağlı sinyalleşme olaylarıyla zamansal ilişkisini ortaya koymaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre-matris yapışma hücre morfolojisini kontrol ve sinyalizasyon önemli bir rol oynar. Hücre-matris yapışma (örneğin, miyeloperoksidaz ve diğer matris düzenleyici oksidanlar / iltihap sırasında ortaya çıkan enzimler) bozan etmenler de hastalıkların bir dizi hücresel fonksiyonu, fenotip ve canlılığı patolojik değişiklikleri tetikleyerek söz konusu olmaktadır. Burada, (a patofizyolojik matris düzenleyici uyarıcı olarak endotel hücreleri ve myeloperoksidaz ile), hücre-alt-tabaka empedans ve canlı hücre görüntüleme teknikleri kolayca doğru hücre yapışmasının ve matris modifikasyonu ile indüklenen de yapışma gerçek zamanlı değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir açıklanmıştır Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip ve non-invaziv bir şekilde. XCELLigence hücre alt-tabaka empedans sistemi sürekli altın mikroelektrot diziler üzerinde yetiştirilen hücreler, hücre-alt-tabaka ara yüzeyinde elektrik empedansı ölçmek suretiyle hücre-matris yapışma alanını ifade etmektedir. Resim analizi zaman atlamalı ayırıcısıcaklık üzerindeki girişim zıtlık filmler hücre-matris temas alanında değişiklikleri temsil eden zaman içinde, tek tek hücrelerin öngörülen alan değişiklikleri ifade etmektedir. Her iki teknik doğru hücresel yapışma ve de-yapışma süreçlerine hızlı değişiklikler ölçmek. Mikroelektrot biyosensör dizileri Hücre-substrat empedans sağlam, yüksek hacimli ölçümler için bir platform sağlar. Canlı hücre görüntüleme hücre-substrat empedans ölçümleri ile sayısal morfolojik değişikliklerin doğası ve dinamikleri ile ilgili ek detay sağlamak analizleri. Bu tamamlayıcı yaklaşımlar hücre içi hücre dışı matris bileşenleri miyeloperoksidaz-katalize oksidatif modifikasyonu hızlı hücre yapışması, morfolojisi değişiklikler ve endotel hücreleri sinyal tetikler nasıl değerli yeni anlayışlar sağlar. Bu yaklaşımlar, diğer matris-modifiye uyarılara ve ilgili diğer yapışıcı hücreler (örneğin, epitelyal hücreleri) yanıt olarak hücre yapışma dinamiğini çalışmak için de geçerlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler ve kendi çevre hücre dışı matris arasındaki kararlı yapışkan temas doku homeostazının muhafaza için gereklidir. Örneğin, kan damarlarında endotel altı matris endotelyal hücre yapışma endotelyal tabakanın bütünlüğünü ve düzenleme, yarı geçirgen bir bariyer vasküler 1 olarak homeostatik fonksiyonunu korumada bir rol oynar. aktin hücre iskeleti mekanik merkezi yönlendirilmiş aktomizin çekme güçlerine karşı hücre zarı konumunu belirlemede önemli bir rol oynadığı hücre-matris arayüz de hücre-matris yapışma ve yapışkan temas bölgelerinde matris moleküllerini yapışkan ile birleştirilir. Mutlaka hücre-matriks arayüzünde güçler dengesini, hızla bir olay alter hücre-matriks yapışmasını değiştiren Ekstrasellüler uyaranlara "dış-iç sinyal" transdüksiyonunda sonuçlanan, mekano duyarlı sinyal proteinleri tarafından 'algılanan'. Bu çapraz-konuşma bahisrinde hücreleri ve kendi çevre hücre dışı matris hücre şekli, motilite, işlev proliferasyonu ve hayatta kalma 2 kontrol edilmesinde anahtar bir rol oynar.

Çeşitli pato-fizyolojik süreçler (embriyonik gelişme, iltihaplanma, yara iyileşmesi, kanser metastazı) matris derecelendirme oksidanlar ve / veya enzimler 3,4 yapışkan matris maddeleri dinamik yeniden ile karakterize edilir. Örneğin, kan damarlarında endotel altı matris proteinleri yapışkan (örneğin, fibronektin) bağlı reaktif oksidanlar lokal üretimi için insan iltihaplı hastalıklarda değiştirilmesi veya bozulması için önemli bir hedef olarak implike edilmiştir (örneğin, hipokloröz asit, HOCl) lökositten türetilmiş bir enzimle inflamatuar damar hastalığı (Şekil 1) 5-9 esnasında subendotelyuma içinde birikir miyeloperoksidaz (MPO),. MPO türetilmiş oksidanlar ve diğer matris-modifiye, uyarıcıya tepki olarak hücre-matris yapışma değişiklikler lik olanda endotel fonksiyonu ve bariyer bütünlüğünü bozarak endotel hücre sinyal, morfolojisi ve canlılığı, değiştirerek, örneğin; ely patolojik süreçlerin çeşitli sırasında vasküler homeostazı değiştirerek önemli roller oynamaya. Ancak, hücre dışı matriks değişiklikler yapışık hücrelerin morfolojik ve hücre sinyal tepkiler sadece anlaşılmaya başlıyor.

Matris değişiklikler hücre yapışması dinamikleri ve yapışma-bağımlı hücre sinyal yolları değişiklikleri sürücü anlamak için, teknikler doğru yüksek zamansal çözünürlüğe sahip, gerçek zamanlı hücre-matriks yapışma değişiklikleri ölçmek olduğunu gereklidir. Burada, biz tamamlayıcı hücre-substrat empedansını ve bu kriterleri yerine getirmek ve non-invaziv bir şekilde hücre yapışmasını ve de-yapışma süreçleri ölçmek için bir platform sağlamak canlı hücre görüntüleme teknikleri tarif.

Biz göstermek nasıl bu hücre-substrat empedans ve canlı hücre görüntüleme beğenmeağrıları hali hazırda hücre eki dinamiklerini izlemek ve doğal ve modifiye matris substratlar üzerine (örneğin, de novo hücre yapışması) yayılma ve (ii) (örneğin, de-yapışma hücre-matris ayrılma dinamiklerini ölçmek için (i) için kullanılabilir ) matris-modifiye uyaranlara maruz yapışık hücreler tarafından. XCELLigence hücre alt-tabaka empedans biyosensör sistemi 96 oyuklu altın mikroelektrot dizileri yüzeyinde elektrik empedansı ölçmek suretiyle hücre-matris temas alanının bir sürekli ölçme, "hücre dizini ', boyutsuz bir değerdir ve bu elektrik empedans ölçümleri ifade eden Ayrıca (yalıtım) hücre zarı ve elektrot yüzeyi 11 arasındaki ortalama mesafe değişikliklere duyarlı varlık iken, hücre-substrat teması 10 (Şekil 2) alanına büyük ölçüde orantılıdır. Hücre indeksi değerleri bakımından bir başka artış da sıkı hücre-hücre temas tha oluşması ile elde edilirt, bu çalışmada açıklanan deneyler içinde geçerli değil 11 koşullarını paraselüler akım akar kısıtlamak. Hızlandırılmış diferansiyel girişim kontrast resim analizi ile, zaman içinde hücre çıkıntı yapan alanının ölçümü (DIC), filmler hücre alt-tabaka temas alanında değişiklik tamamlayıcı ölçümünü sağlar ve kesin yapısı ve dinamikleri ile ilgili ek bilgiler sağlar Hücre-substrat empedans yaklaşımı ile ölçülebilir morfolojik değişimler.

Özellikle, (örneğin, fibronektin): (i) yapıştırıcı, alt endotelial matris proteinlerinin oksidasyon MPO aracılı nasıl kullanıldığını izlemek arıtıldı fibronektin ve (ii) tetikler hücre-matris de üzerine süspansiyon endotel hücreleri de novo yapışmasını azaltır, bu yaklaşımların bir uygulama tarif fibronektin kurulan yapışması ile endotel hücreleri -yapışma. Paralel hücre sinyal gerçekleştiren ilgili Biochem kullanarak zamanla analizleri ilenik deneyler (örneğin, Western blot), yapışma bağımlı hücre sinyal olayları adezyon / de-yapışma süreçleri ve ilgili değişiklikleri arasındaki zamansal ve nedensel ilişki belirlenebilir.

Bu yaklaşımlar en son MPO subendotelyal yatakları ile katalize hücre dışı matris oksidasyon önceden var olan aktomizin kasılma güçleri 9 tarafından tahrik edilen endotel hücrelerinin hücre-matris yapışma hızlı kayıp tetikler olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Önemlisi, hem hücre yapışması değişiklikler ve tespit edilecek sinyal yapışma bağımlı hücre arasındaki zamansal ilişki sağlayarak, bu yaklaşımlar MPO kaynaklı matris modifikasyonu ve hücresel de-yapışma Src kinaz gibi önemli yapışma-bağımlı hücre sinyal yolları değişiklikleri tetikler olduğu tespit bağımlı paxillin fosforilasyon ve miyosin hafif zincir II fosforilleme (Şekil 1) 9. Redoks-bağımlı sinyal, inv Bu modhücre-matris yapışmasını bozan hücre dışı oksidatif reaksiyonları ile hücre içi sinyal olaylarının aktivasyonu SORUN hücrenin yeni bir şekli "dışarıdan içeriye redoks sinyal" (Şekil 1) olarak adlandırılan sinyalizasyon temsil 9.

Genel olarak, bu tamamlayıcı hücre alt-tabaka empedans biyosensör ve canlı hücre görüntüleme teknikleri matris düzenleyici uyarı ya da maddeler, hücre yapışması dinamiği, morfoloji değişiklikleri sürücü kadar farklı ifşa ve çeşitli tabi olan farklı yapışık hücre türleri içinde sinyalizasyon değerli olmalıdır Deneysel ayarları.

Aşağıdaki protokol de novo endotel hücre yapışması (Deney 1) ve endotel hücre de-yapışma (Deney 2) süreçleri üzerinde MPO-aracılı matris oksidasyon etkisini ölçmek açıklamaktadır. MPO fibronektin ve diğer yapıştırıcı subendotelyal hücre dışı matriks proteinleri ve bize heyecanla bağlanıres (H2O 2) klorid iyonu (Cı -) dönüştürmek için hidrojen peroksit, bu matris proteinleri ile lokal olarak reaksiyona girer ve hücre yapışma özelliklerini (Şekil 1) 8,9 bozan yüksek reaktif bir klorlama oksitleyici hipokloröz asit (HOCI) 'e, 12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Genel Endotel Hücre Kültürü

  1. EGM-2 ortamında (% 5 fetal sığır serumu, büyüme faktörleri ve hidrokortizon hariç üretici tarafından sağlanan tüm takviyeleri içeren EGM-2 mermi kiti ile) jelatin kaplı doku kültürü şişelerinde (doku kültürü yüzeyini 15 dakika boyunca RT'de PBS'de% 0.1 w / v jelatin ile kaplayın) sığır aort endotel hücrelerinin (pasaj 4-9)
    2. kültürü.
  2. Hücreler birleşime yakın olduğunda (1: 4 bölünmeden sonra tohumlamadan yaklaşık 3 gün sonra), hücreleri 37 ° C'de PBS'de% 0.05 w / v tripsin ve/% 0.02 w / v EDTA ile muamele ederek hasat edin. Hücrelerin çoğu ayrıldıktan sonra, tripsini söndürmek için tam EGM-2 ortamı ekleyin ve ardından santrifüjleyin (100 x g, 5 dakika).
  3. Endotel hücrelerinin fibronektine de novo yapışması (Deney 1: Bölüm 2) ve daha sonra bu substrat üzerinde yerleşik yapışma ile endotel hücrelerinin adezyonun kaldırılması (Deney 2: Bölüm 3) ile ilgili çalışmalar için hücreleri hazırlayın.
    1. Hasat edilen hücreleri bir kez% 1 w / v sığır serum albümini (BSA) ve yeniden santrifüj (100 x g, 5 dakika) içeren serumsuz Medium 199 ile yıkayın.
    2. 2.5 x 105 hücre / ml (hücre-substrat empedans ölçümleri) veya 5 x 105 hücre / ml'de (canlı hücre görüntüleme analizleri) %1 w/v BSA içeren serumsuz Ortam 199'daki hücreleri yeniden askıya alın ve kullanmadan önce 37 ° C'de koruyun.
      NOT: Hücrelerin yapışma tepkileri sıcaklık farklılıklarına karşı oldukça hassastır (örneğin, konveksiyon etkilerinden dolayı), bu nedenle aşağıdaki protokoller sırasında hücreleri işlemek ve tedavi etmek için kullanılan tüm ekipman ve solüsyonlar 37 °C'lik sabit bir sıcaklıkta tutulmalıdır.

2. Deney 1: Doğal ve MPO-Oksitlenmiş Fibronektin Üzerinde De Novo Endotel Hücre Adezyonunun Ölçülmesi (Hücre-substrat Empedansı)

NOT: Deney 1, fibronektinin MPO aracılı oksidasyonunun, askıya alınmış endotel hücrelerinin de novo yapışmasını destekleme yeteneğini ne derece bozduğunu inceler.

  1. Fibronektini 96 oyuklu altın hücre-substrat empedans mikroelektrot dizileri üzerine kaplayın. PBS'ye 5 μg / ml'de 80 μl / kuyu saflaştırılmış sığır fibronektini ekleyin, 37 ° C'de 2 saat inkübe edin ve çözeltiyi çıkarın.
  2. MPO'nun yüzeye bağlı fibronektine bağlanmasına izin vermek için fibronektin kaplı yüzeyleri MPO ile inkübe edin. Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) 20 nM'de 80 μl / kuyu saflaştırılmış insan nötrofil MPO ekleyin ve 37 ° C'de 0,5 saat inkübe edin.
  3. Bağlanmamış MPO'yu çıkarmak için yüzeyleri HBSS ile iki kez yıkayın.
  4. MPO katalizli, HOCl'ye bağlı fibronektin oksidasyonunu başlatmak için 80 μl / kuyucuk HBSS içeren mikroelektrot dizi plakasının kuyucuklarına H2O2 (0-10 μM nihai konsantrasyon) ekleyin ve 37 ° C'de 0,5 saat daha inkübe edin.
  5. MPO katalizli reaksiyonların ilgili inhibitörlerinin veya modülatörlerinin etkisini incelemek için (örneğin, alternatif MPO enzim substratları, enzim inhibitörleri veya antioksidanlar; ayrıntılar için9'a bakınız), bunlarıH2O2ilavesinden hemen önce HBSS'ye ekleyin.
  6. 0,5 saat sonra, artık yüzeye bağlı oksitleyici türleri söndürmek için yüzeylere metiyonin uygulayın; yani, kafa karıştırıcı hücresel aktiviteler uygulayabilen reaktif proteine bağlı kloraminler. Oyuk başına 80 μl HBSS'de 10 mM metiyonin ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  7. BSA ile yüzeyleri engelleyin. PBS'de %0,2 w/v oranında 80 μl/kuyu BSA ekleyin, 37 ° C'de 2 saat inkübe edin ve çözeltiyi çıkarın.
    NOT: Artık kaplanmamış yüzey bölgeleri, hücre yapışmasını destekleyecektir ve bunların yapışkan olmayan bir protein (yani BSA) ile bloke edilmesi, hücresel yapışma tepkilerinin kesinlikle kullanılan saflaştırılmış hücre yapışkan matrisine, bu durumda fibronektine bağlı olmasını sağlar.
  8. Yüzeyleri HBSS.
    ile iki kez yıkayın NOT: Yukarıdaki yüzey işlemlerinden hiçbiri hücre-substrat okumalarını önemli ölçüde etkilemez.
  9. Tohum süspanse endotel hücreleri (yaklaşık 2.5 x 105 hücre / ml'de 200 μl / kuyu ekleyin,% 1 BSA içeren serumsuz Ortam 199'da hazırlanır; bkz. 1.3) doğal veya MPO ile oksitlenmiş fibronektin kaplı yüzeyler üzerine.
  10. Hücreleri tohumladıktan hemen sonra (yani, herhangi bir hücre bağlanması ve yayılmasından önce), mikroelektrot dizi plakasını inkübatör portuna monte edin (% 5 CO2 varlığında 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirilmiştir).
    1. Cihaz yazılımını kullanarak, sonraki hücre-substrat empedansı ('hücre indeksi') değerlerini, hücre yapışmasının yokluğunda elde edilen ilk arka plan değerlerine normalleştirmek için hemen 'boş' bir okuma yapın.
    2. Sürekli hücre indeksi verilerinin alımını başlatın (en az bir hücre indeksi okuması/dak).
  11. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2'de 2 saat boyunca inkübe edin, bu süre zarfında maksimum hücre bağlanması ve yayılmasının sağlandığı bir süre; bu, hücre indeksi değerlerinin platosu ile yansıtılır (bkz. Şekil 3A).
    NOT: Önceki deney (Deney 1), fibronektinin ilk MPO aracılı oksidasyonunun, endotel hücrelerinin bu substrat üzerinde hücre yapışması oluşturma yeteneğini nasıl sınırladığını inceler. Aşağıdaki deney (Deney 2), MPO aracılı fibronektin oksidasyonunun, bu substrat üzerine yerleşik yapışma ile endotel hücrelerinde hücre matrisi yapışmasında (yani yapışmanın kesilmesi) azalmayı nasıl desteklediğini incelemektedir. Bu iki deneydeki tedaviler, MPO aracılı fibronektin oksidasyonunun zamanlaması dışında (yani, hücre yapışmasından önce - Deney 1; hücre yapışmasından sonra - Deney 2) temelde aynıdır.

3. Deney 2: MPO Aracılı Fibronektin Oksidasyonuna Yanıt Olarak Fibronektinden Endotel Hücre Deadezyonunun Ölçülmesi (Hücre-substrat Empedansı ve Canlı Hücre Görüntüleme)

  1. Hücre-substrat empedans ölçümleri için fibronektini 96 oyuklu altın mikroelektrot dizileri üzerine kaplayın (PBS'de 5 μg/ml'de 80 μl/kuyu fibronektin ekleyin ve 37 °C'de 2 saat inkübe edin) veya canlı hücre görüntüleme analizleri için 35 mm cam tabanlı hücre kültürü kapları (PBS'de 5 μg/ml'de 2 ml/tabak fibronektin ekleyin ve 37 °C'de 2 saat inkübe edin).
  2. BSA ile yüzeyleri engelleyin. 3.1'de belirtilen hacimlerde PBS'de ağırlıkça %0.2 BSA ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  3. MPO'nun fibronektine bağlanmasına izin vermek için yüzeyleri MPO ile inkübe edin. 3.1'de belirtilen hacimlerde HBSS'ye 20 nM saflaştırılmış insan MPO'su ekleyin ve 37 ° C'de 0.5 saat inkübe edin.
  4. Bağlanmamış MPO'yu çıkarmak için yüzeyleri HBSS ile iki kez yıkayın.
  5. Tohum süspanse endotel hücreleri (serumsuz Ortam 199'da hazırlanır, % 1 w / v BSA içerir; bkz. 1.3) doğal veya MPO içeren fibronektin kaplı yüzeylere.
    1. 96 kuyulu hücre-substrat empedans mikroelektrot dizisine 2.5 x 105 hücre / ml'de 200 μl / kuyu ekleyin.
    2. 35 mm cam tabanlı hücre kültürü kaplarına 5 x 105 hücre/ml'de 2 ml / tabak ekleyin.
  6. Hücreleri tohumladıktan hemen sonra (yani, herhangi bir hücre bağlanması ve yayılmasından önce):
    1. 96 kuyulu mikroelektrot dizi plakasını hücre-substrat empedans inkübatör portuna (% 5 CO2 varlığında 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirilmiştir) monte edin ve hücre indeksi verilerinin sürekli alımını başlatmak için 'boş' okumalar yapın (bkz. Bölüm 2.10).
    2. 35 mm cam tabanlı hücre kültürü kaplarını %5 CO2 varlığında 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın.
  7. Maksimum hücre bağlanmasına ve yayılmasına izin vermek için hücreleri 37 °C'de 2 saat inkübe edin (bkz. Bölüm 2.11).
  8. 96 kuyulu mikroelektrot dizi plakasını (bu noktada hücre indeksi okumalarını duraklatın) veya 35 mm cam tabanlı hücre kültürü kabını 37 °C inkübatörden kısaca çıkarın, hücre süpernatantını çıkarın ve ısıtılmış (37 °C) HBSS ekleyin (adım 3.1'e göre hacimler).
    NOT: HBSS, tam kültür ortamı yerine MPO katalizli oksidatif reaksiyonlar incelenirken kullanılır, çünkü ikincisi oksidasyon reaksiyonlarına müdahale eden oksitlenebilir türler içerir.
  9. MPO katalizli reaksiyonların (alternatif enzim substratları, enzim inhibitörleri veya antioksidanlar) veya hücre sinyal inhibitörlerinin (örneğin, aktomiyosin kasılmasını inhibe etmek için 40 μM blebbistatin) inhibitörlerinin / modülatörlerinin etkisini incelemek için bunları şimdi ekleyin.
  10. Mikroelektrot dizi plakasını hemen 37 °C inkübatör portuna (bu noktada hücre indeksi okumalarını yeniden başlatın) veya 35 mm cam tabanlı hücre kültürü kabını 37 °C inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin HBSS'de 0,5 saat
    NOT: HBSS'de 0,5 saatlik dengelemeden sonra, hücre indeksi değerleri biraz daha düşük değerlerde stabilize olur; Hücreleri enzim substratları, enzim ve hücre sinyal inhibitörleri veya antioksidanlarla önceden inkübe ederken, önce bunların dengelemeden sonra elde edilen değerleri önemli ölçüde etkilemediğinden emin olun.
  11. MPO katalizli, HOCl'ye bağımlı fibronektin oksidasyonunu ve yapışmayı giderin.
    1. 96 kuyulu mikroelektrot dizi plakası kullanan hücre empedansı çalışmaları için:
      1. Mikroelektrot dizi plakasını inkübatörden çıkarın ve hücre indeksi ölçümlerini duraklatın.
      2. HBSS'ye H2O2(son konsantrasyon 0-10 μM) ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile hafifçe karıştırın.
      3. Hemen, mikroelektrot dizisini 37 °C inkübatör portuna yeniden monte edin ve hücre indeksi okumalarının alımını yeniden başlatın.
    2. 35 mm cam tabanlı hücre kültürü kabı kullanılarak yapılan canlı hücre görüntüleme çalışmaları için:
      1. Kültür kabını inkübatörden çıkarın ve canlı hücre filmlerini kaydetmek için uygun DIC optiklere sahip 63X su objektif lensi ile donatılmış ters konfokal bir mikroskobun 37 °C ısıtılmış bir aşamasına monte edin.
      2. Hücrelere odaklanın ve DIC optiklerini optimize edin (Köhler aydınlatması, önyargı geciktirme ve kamera ofseti/kazancı; ayrıntılar için bkz.13).
      3. DIC filmini başlatın ve 1 dakika boyunca tedavi edilmemiş hücrelerin temel okumalarını kaydedin.
      4. H2O2(son konsantrasyon 0-10 μM) ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile hafifçe karıştırın. Mikroskobu yeniden odaklayın (gerekirse) ve istenen süre boyunca tedavi edilen hücrelerin DIC filmlerini kaydetmeye devam edin.

4. Veri Analizi ve Sunumu

  1. Hücre-substrat empedans verileri
    1. Ham verileri (zamana karşı hücre dizini) bir elektronik tabloya aktarın.
    2. Hücre yapışma giderme çalışmaları için (Deney 2: Bölüm 3), MPO aracılı fibronektin oksidasyonunun başlamasından hemen önce kaydedilen değerleri 1 değerinde ayarlayarak verileri normalleştirin (yani, 3.11.1.1'de H2O2 ilavesinden hemen önce).
      NOT: Bu, MPO aracılı fibronektin oksidasyonu ile ortaya çıkan hücre indeksi değerlerindeki nispi değişikliklerin, kuyucuklar arasındaki mutlak hücre indeksi değerlerindeki küçük başlangıç farkları tarafından maskelenmemesini sağlar.
      1. Verileri normalleştirilmiş hücre indeksi (y ekseni) ve zamana (x ekseni) karşı grafikleri olarak sunun.
  2. Canlı hücre görüntüleme verileri (Deney 2: Bölüm 3'teki hücre yapışma giderme çalışmaları)
    1. Standart bir görüntü analiz programında (örneğin, ImageJ yazılımı) MPO aracılı fibronektin oksidasyonunun başlamasından hemen önce ve sonra kaydedilen DIC canlı hücre görüntüleme filmlerini açın.
    2. En az iki ayrı DIC filminde, rastgele birden fazla hücre seçin ve yansıtılan alanlarını, zar kenarlarını manuel olarak izleyerek ve kapalı piksellerin sayısını ölçerek sıralı kareler halinde (örneğin, 1 dakikalık aralıklarla) ölçün.
    3. Ham verileri (zamana karşı öngörülen hücre alanı) bir Excel elektronik tablosuna aktarın ve MPO aracılı fibronektin oksidasyonunun başlamasından hemen önce kaydedilen değerleri 1 değerinde ayarlayarak hücre alanı verilerini normalleştirin (yani, 3.11.2.3'te H2O2 eklenmesinden hemen önce).
    4. Verileri, normalleştirilmiş hücre alanı (y ekseni) ve zamana (x ekseni) karşı bir grafiği olarak sunun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MPO aracılı fibronektin oksidasyonuna yanıt olarak fibronektinden endotel hücre adezyonun deadezasyonunun gerçek zamanlı miktar tayini (Deney 2). Endotel hücre süspansiyonlarının doğal (MPO içermeyen) fibronektin veya MPO içeren fibronektin üzerine tohumlanması, hücre substrat empedans ölçümlerinde hücre indeksi değerlerinin platolaşması ile değerlendirildiği gibi, 2 saat içinde maksimum hücre bağlanması ve yayılması ile sonuçlanır (Şekil 3A). Hücre bağlanmasının ve yayılmasının bu ilk a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre-matris yapışma ve yapışma giderme işlemleri, hücre-substrat empedansı ve canlı hücre görüntüleme analizleri kullanılarak yüksek zamansal çözünürlükle gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde ölçülebilir. Bu gerçek zamanlı yaklaşımlar, zayıf zamansal çözünürlük sağlayan hücre yapışmasının uç nokta analizlerine göre büyük bir avantaj sağlar. Bu analizler, yüksek zamansal çözünürlükle hızlı adezyon giderme tepkilerini doğru bir şekilde ölçerek, matris modifikasyonlarına verilen morfolojik tepkilerin nasıl düzenlendiğin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların yapacak herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Proje Hibe 568721 (SRT) ve kısmen UNSW Tıp Fakültesi Araştırma Bursu (MDR) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 kuyulu altın hücre-substrat empedans mikroelektrot dizisiACEA Biosciences / RocheE-Plate 96tek kullanımlık plaka, xCELLigence sistemi
blebbistatinSigmaB0560kas dışı miyozin-II
Sığır Aort Endotel Hücrelerinin seçici inhibitörü, kriyoprezervasyonlu LonzaBW-6001
Sığır serum albüminiSigma05470
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162endotel hücre büyüme ortamı kiti
Fibronektin, sığır plazmasından liyofilize tozSigmaF-4759
Florodish 35 mm cam tabanlı hücre kültürü kabıHassas AletlerFD35-100Sığır
derisinden elde edilen jelatiniSigmaG9391hücre kültürü substratı
Hank'in Dengeli Tuz ÇözeltisiYaşam Teknolojileri14025076
Hidrojen peroksitMerck107298
Medium-199Life Technologies11150-059serumsuz hücre ortamı
MetiyoninSigmaM9500miyeloperoksidaz tarafından üretilen klorlu oksidanları söndürür Miyeloperoksidaz
, İnsan Polimorfonükleer LökositleriMillipore475911
RTCA MP Enstrümanı / xCELLigence hücre substratı empedans sistemi ACEABiosciences / Roche, RTCA analizörü, RTCA (Çoklu Plaka) MP istasyonu ve RTCA kontrol ünitesinden oluşur
Tripsin-EDTA (%0,5)Gibco15400-054 
Dünya görüntülemek için optik kalitede cam tabanlı hücre kaplama kabı ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  3. Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
  4. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
  5. Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
  6. Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
  7. Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
  8. Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
  9. Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
  10. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
  11. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
  12. Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
  13. Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
  14. Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
  15. Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
  16. Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endotel H creleriMiyeloperoksidazFibronektin KaplamaZaman At ml G r nt lemeDiferansiyel nterferans KontrastH cre ndeksi l mleri

İlgili makaleler