Method Article

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

DOI:

10.3791/52459

⸱

March 23rd, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona, Verona, Italy, 2Department of Internal Medicine, University of Perugia, Perugia, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki esaslı sistemler, yüksek kaliteli, biyolojik olarak aktif ürünler, esnek ve düşük maliyetli bir üretim için bunların iyi belgelenmiş potansiyel bir sonucu olarak, rekombinant proteinlerin üretimi için değerli bir platform olarak kabul edilir.

Bu çalışmada, geçici ve stabil olarak bitki bazlı ekspresyon sistemleri, geleneksel fermentasyon cihazı dayalı hücre kültürlerinde (bakteriyel ve böcek) ve hedef insan yeniden birleştirici proteinin ifadesini karşılaştırıldı.

Her platformda için, biz set-up, optimizasyon ve üretim sürecinin uzunluğu, nihai ürün kalitesi ve verimi açıklanan ve bizim seçtiğimiz hedef rekombinant protein için özel geçici üretim maliyetlerini, değerlendirildi.

Genel olarak, sonuçlar bakteri bağlı erimez içerik korları dahilinde birikmesi, hedef proteinin üretimi için uygun olduğunu göstermektedir. Öte yandan, bitki bazlı sistemler, çok yönlü platformlar t'ninşapka Bakulovirüs / böcek hücre sistemine daha düşük maliyetlerle seçilen proteinin üretimine izin verir. Özellikle, istikrarlı transgenik hatları nihai ürünün en yüksek verim ve geçici ifade bitkiler hızlı süreç geliştirme görüntülenen. Ancak, tüm rekombinant proteinleri bitki-temelli sistemlerde yararlanabilirler, ancak burada anlatıldığı gibi iyi üretim platformu, bir vaka-by-case yaklaşımı ile ampirik olarak tespit edilmelidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant proteinler, gelişmekte olan biyoteknoloji araçlarının yardımıyla heterolog ekspresyon sistemlerinde ticari olarak seri üretilir. Heterolog ekspresyon sistemini seçerken göz önünde bulundurulması gereken temel faktörler şunları içerir: protein kalitesi, işlevsellik, işlem hızı, verim ve maliyet.

Rekombinant protein alanında, farmasötik pazarı hızla genişlemektedir ve sonuç olarak günümüzde üretilen çoğu biyofarmasötik rekombinanttır. Proteinler, bakteri, maya, küf, memeli, bitki ve böceklerin hücre kültürlerinde ve ayrıca bitki sistemlerinde (kararlı veya geçici dönüşüm yoluyla) ve transgenik hayvanlarda ifade edilebilir; Her eks....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İfade Vektörler 1. İnşaatı

  1. Ticari rekombinasyon klonlama sistemi:
    1. Daha önce tarif edildiği gibi 2 uygun primerler genin 5 'ucunda bir OAKK kelepçe eklenmesini sağlayan hedef gen (hGAD65mut) tam uzunlukta dizisi yükseltin.
    2. 1 mol oranı ekleme: vektör ve 1 ul bir 1.5 kullanarak, 6 ul bir toplam hacim içinde reaksiyonu monte edilerek giriş vektörü (topoizomeraz bağlı) 'de, yönlü klonlama kiti özelliklerine göre, jelle saflaştırıldı amplifikasyon ürünü Clone tuz çözeltisi (0.01 MgCl2 0.2 M NaCI ve benzeri). Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) inkübe edilir.
    3. Kimyasal yetkili E. içine tüm reak....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklı üretim sistemlerinde bir yeniden birleştirici hedef proteinin heterolog ekspresyonu için bir deney tasarımı burada tarif edilmektedir. ilk odak Her sistemde hedef proteinin ekspresyonu için uygun koşullar kurarak farklı düzlemlerin kurulum oldu.

Hedef protein, hGAD65mut ekspresyonu, üçlü E. indüklenmiştir E. coli kültürleri. 37 ° C'de ifade 3 saat sonra, bakteri hücreleri santrifüjleme ile toplandı ve sonikasyon ile parçalanır. Bir santrifüjleme kademesinden sonra, ç.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel hücreler, Bakulovirüs / böcek hücreleri ve bitkiler: Bu çalışmada üç farklı ortam, bir rekombinant insan proteininin sentezlenmesi için karşılaştırıldı. (- MagnICON ve pK7WG2 tabanlı - ve istikrarlı, yani geçici) bitki bazlı bir platform daha üç yaygın olarak kullanılan ifade teknolojilerini istismar tarafından araştırılmıştır. Bu deneyde, hGAD65mut için seçilen hedef protein önceden farklı sistemlerde 13 olarak ifade edildi ve üretim ve işlevselliği kolayca saptanabilir ve 14 ö.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalenin yayınlanmasıyla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, 'Moleküler pharming: Yüksek değerli proteinler için bir üretim platformu olarak bitkiler' FA0804 COST eylemi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, araştırma amaçlı MagnICON vektörlerini sağladıkları için Dr. Anatoli Giritch ve Prof. Yuri Gleba'ya teşekkür eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Maya özüSigmaY1333
TriptonFormediumTRP03
Agar Bakteriyolojik SınıfAplikasyonA0949
Sf-900 II SFM ortaGibco10902-088
Grace ' s Böcek Ortamı, takviyesizGibco11595-030
Cellfectin II ReaktifiInvitrogen10362-100
MS ortamı vitaminleri içerenDuchefa BiochemieM0222
SükrozDuchefa BiochemieS0809
Bitki agarDuchefa BiochemieP1001
Ampisilin sodyumDuchefa BiochemieA0104Toksik
Gentamisin sülfatDuchefa BiyokimyaG0124Toksik
GansiklovirİnvitrojenI2562-023
Karbenikilin disodyumDuchefa BiyokimyaC0109Toksik
Kanamisin sülfatSigmaK4000Toksik
RifampisinDuchefa BiyokimyaR0146Toksik ve ndash; DMSO
Streptomisin sülfatDuchefa BiochemieS0148Toksik
Spektinomisin dihidroklorürDuchefa BiochemieS0188
IPTG (izopropil -β -D-1-tiogalattopiranosid)SigmaI5502Toksik
MES hidratSigmaM8250
MgCl < sub > 2 < / sub >Biyokimyasal436994U
AsetosiringonSigmaD134406Toksik – 0.1 M stok
(1 ml)Terumo
MgSO4Fluka63136
BAP (6-Benzilaminopurin)SigmaB3408Toksik
NAA (Naftalen asetik asit)Duchefa BiochemieN0903Tahriş Edici
SefotaksimMylan Jenerikler
Trizma bazSigmaT1503Tris-HCl tamponu HCl yapmak için pH'ı 1 N HCl ile ayarlayın
SigmaH1758Aşındırıcı
NaClSigmaS30141 M stok
KClSigmaP9541
Na2< / sub>HPO4< / sub>SigmaS7907
KH2PO4SigmaP9791
PMSF (Fenilmetansülfonilflorür)SigmaP7626Aşındırıcı, toksik
ÜreSigmaU5378
ve beta;-merkaptoetanolSigmaM3148Toksik
Ara-20SigmaP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Dithiothreitol)SigmaD0632Toksik – 1 M stok, -20 °C'de saklayın; C
CHAPSDuchefa BiochemieC1374Toksik
Bitki proteaz inhibitörü kokteyliSigmaP9599Çok fazla donmayın/çözmeyin
SDS (Sodyum dodesil sülfat)SigmaL3771Yanıcı, toksik, aşındırıcı ve% 10 stok
GliserolSigmaG5516
Parlak Mavi R-250SigmaB7920
İzopropanolSigma24137Yanıcı
Asetik asitSigma27221Korozif
Anti-Glutamik asit dekarboksilaz 65/67SigmaG5163Çok fazla dondurmayın / çözmeyin
Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge anti-tavşan antikoruSigmaA6154fazla dondurmayın / çözmeyin
Sf9 Hücreleri Ömrü Teknolojiler11496
BL21 Yetkili E. coliNew England BiolabsC2530H
Protein A SefarozSigmaP2545
Hücre kültürü plakalarıSigmaCLS3516
Radyo İmmüno-Test kitiTekno Genetik12650805Radyoaktif malzeme
DMSO Şırıngada , : Çok ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinant Protein ExpressionBacterial SystemsInsect Cell SystemsPlant Based SystemsTransient ExpressionStable Transgenic LinesProtein Yield AnalysisProduction Cost EvaluationInclusion Body FormationBiofactory Comparison

Related Articles