Method Article

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

DOI:

10.3791/52484

⸱

March 17th, 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pek çok farklı yöntem akış sitometrik (FCM) ile hücre dışı veziküller (EVS) ölçülmesi için vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Ölçüm EVs için iki protokoller bireysel algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için iki protokol burada sundu. rasyonel f yaygın ticari preparatlarda bulunan antikor agregatları bertaraf yardımcı olacaktır Burada tarif edilen yöntemler, artan bir sinyal-gürültü oranı ve ayar kapılarıeşiğe tespitini en aza indirir ashion. İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Aşağıdaki protokoller, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak yapılmıştır. Bütün insan konu örnekleri kurumsal inceleme kurulu (KİK) -onaylı protokol kapsamında ve konuların bilgilendirilmiş rızası ile test edildi.

1. YÖNTEM A: Bireysel Algılama Yöntemi

AGH Kan Örneği / İzolasyon 1.1) İşleme

  1. Aşağıdaki 2 adımlı diferansiyel santrifüj protokolü kullanılarak ACD-Solüsyon A ya da diğer halinde, uygun bir antikoagülan ve proses (30 dakika içinde max), 1.5 ml ihtiva eden iki adet 10 ml'lik cam tüplere verici / hastadan alınan kan alımı.
    NOT: Bu protokol,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, izolasyon ve boncuk esaslı yöntemi veya tek tek tespit metodu kullanarak EV'lerin tespiti için genel işlem şemasını açıklar. FCM büyük AGH analiz için iyi çalışır ama çoğu sitometrelerinde bireysel eksozom gibi parçacıkları kadar küçük tespit yeteneğine sahip değildir kullanarak EVs Bireysel algılama. Bir tane bazlı yaklaşım, Tablo 1 'de belirtildiği gibi küçük EVs, ancak, bu yöntem kullanılarak ilişkili dezavantajları vardır tespit edilmesini sağlar. Genel olarak, (ya da bir s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İzolasyon, tedavi ve EVs analizi için iki farklı protokol tek bir algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur. Kullanmak için en uygun yöntemi seçerek her zaman kolay değildir ve faiz bireysel alt popülasyonlar yanı sıra test edilen numunenin bir anlayış gerektirir. En uygun yöntemi tercih Bundan başka, satın alma için kullanılan sitometresinde duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Çoğu zaman doğrusu yöntemlerin bir kombinasyonu, tek başına herhangi bir yöntem daha bir numune hakkında daha fazla bi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar enstrüman ayarları sitometrede akışı ile yaptığı yardım için kan Sistemler Araştırma Enstitüsü'nden Dale Hirschkorn teşekkür etmek istiyorum. NIH tarafından desteklenen bu çalışma HL095470 ve U01 HL072268 ve DoD sözleşmeleri W81XWH-10-1-0023 ve W81XWH-2-0028 verir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LSR II tezgah üstü akış sitometresiBD Biosciences3 lazerli (20 mW Tutarlı Safir 488 nm mavi, 25 mW Tutarlı Vioflame 405 nm mor ve 17 mW JDS Tek Fazlı HeNe 633 nm kırmızı)
FACS Diva yazılımı BD BiosciencesPC sürüm 6.0
FlowJo yazılımı Treestar USMac sürüm 9.6.1 veya PC sürüm 7.6.5
Sphero Rainbow floresan parçacıklarıBD Biosciences556298floresan yoğunluk tutarlılığını korumak için tüm kanal voltajlarını ayarlamak için kullanılır 
Ultra Gökkuşağı floresan parçacıkları SpherotechURFP-10-5partiden partiye EV geçit tutarlılığını sağlamak için Megamix-Plus SSC boncuklarına ek olarak kullanılır
Megmix-Plus SSC boncuklarıBiocytex7803, FSC ve SSC  voltajlarını ayarlamak  tutarlılığı  sağlamak için kullanılır. Ayrıca, tüm çalıştırmalarda aynı akış hızının kullanılmasını sağlamak için akış hızını izlemek ve akış hızı kadranını ayarlamak için de kullanılabilir
AbC Anti-Mouse Boncuk KitiLife TechnologiesA-10344ve boncuk tabanlı yöntem için kullanılan negatif AbC boncukları
Nonidet P-40 Alternatifi (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz SC-281108, bireysel algılama yönteminde, negatif kontroller olarak kullanılmak üzere yalnızca ilk okumadan sonra numuneleri parçalamak için kullanılır. Stok, PBS'de 1:10 oranında seyreltilebilir ve buzdolabında 1 aya kadar saklanabilir.
BD TruCOUNT TüpleriBD Biosciences340334mutlak EV konsantrasyonlarına ihtiyaç duyulduğunda kullanılır
Ultrafree-MC, GV 0.22 & m Santrifüj Filtre ÜniteleriMillipore UFC30GVNBleke sonrası yıkamak, EV'leri yıkamak ve / veya boyuta göre EV'leri parçalamak için kullanılır
Vacutainer cam tam kan tüpleri ACD-ABD Biosciences364606
Facs tüpleri 12x75 polistrenBD Biosciences352058
50 ml Rezervuarlar ayrı ayrı sarılmış PhoenixRR-50-1s
Green-Pak pipet uçları - 10 & lRaininGP-L10S
Green-Pak pipet uçları -200 ve mikro; l RaininGP-L250S
Green -Pak pipet uçları - 1.000 & mikro; l RaininGP-L1000S
Stabil Yığın L300 uçlar önceden sterilize edilmişRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Kanal LTS  Ayarlanabilir  Ara parçası RaininLA8-300XLS
E & K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Ortamı (Hepes'siz)UCSF Hücre Kültürü TesisiCCFAE001boncuk tabanlı tespit yöntemi için kullanılan ortam
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg içermez, 0.2 ve mikro; m filtreliUCSF Hücre Kültürü TesisiCCFAL003
Ultrasantrifüj Tüpü, İnce Duvar, Ultra ŞeffafBECKMAN COULTER INC
PANELİ I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 & l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 & mikro; l
CD16 V450BD Biosciences5604742 & l
CD28 FITCbiolegend3029062 & l
CD152 APCBD Biyobilimler5558552 & l
CD19 A700Biolegend3022262 ve mikro; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 & l
CD62L APCBiolegend3048102 & mikro; l
CD108 PE BD Biosciences5528302 & mikro; l
CD235a FITCbiolegend3491042 & l
PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 ve mikro; l
CD62p APCBiolegend3049102 & mikro; l
CD66b PE & nbsp;Biolegend3051062 ve mikro; l
CD15 FITCexalphaX1496M5 & l
CD9 PEBiyoefsane555372
CD63 APCBiyoefsane353008
APC-Cy7 Bayan IgG2a, & kappa;Biyolojik efsane400230
, 96 kuyulu doku kültürü plakaları 344058

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesFlow CytometryBead Based DetectionIndividual DetectionPlatelet Poor PlasmaAntibody StainingCytometer SetupFluorescent ParticlesPolystyrene BeadsForward Scatter

Related Articles