Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca ²⁺ Görüntüleme

enterik sinir sistemi (ENS) sindirim yolu ¹ duvarında gömülü iki ganglionated pleksuslar halinde düzenlenmiştir. Bu kas sinir devreleri, myenterik pleksus (MP) ve submukozal pleksus (SMP), nöronlar ve glia enterik (Şekil 1) ² oluşur. MP ve SMP gibi bağırsak motilite ve epitel emilimi ve sekresyon, sırasıyla ³ gastrointestinal (Gİ) fonksiyonlarını düzenler. Enterik glia ganglionlar içinde nöronlar ama enterik glia nüfusa yakın bulunan, aynı zamanda lif yolları ve bağırsak duvarının ^3,4 ekstra-ganglion bölümlerini birbirine içinde var. Enterik glia başlangıçta nöronların sadece besleyici destek sağlamak için inanılırdı. Ancak son çalışmalar kuvvetle ENS ^5,6 fonksiyonları için nöron-glia etkileşimleri önemli olduğunu göstermektedir. Örneğin, veri enterik glia nöronal aktivitenin ⁷ "dinlemek" olduğunu gösteriyorve nöronal devreler ^6,8 modüle oksidatif stres ⁹ enterik nöronların korunması ve yaralanma ^10,11 tepki olarak yeni enterik nöronların üretme yeteneğine sahiptir. Bu teknik inceleme sunulan protokol yerinde hücre içi Ca ^{2 +} görüntüleme kullanarak nöronlar ve glia enterik arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek için basit ve sağlam bir yöntem sağlar.

Ca2 ⁺ uyarılabilir hücrelerde her yerde bulunan bir sinyal molekülü olan ve sinir sistemi ¹² sinaptik sinyal olaylarını önemli bir rol oynar. Nöronlar veya enterik glia Uyarma ya akını ile Ca ^{2 +} geçirgen kanallar veya Ca ile hücre içi kalsiyum depolarından ²⁺ salınımını sitoplazmik Ca ^{2 +} konsantrasyonunda bir yükselme ortaya çıkarmaktadır. Görüntüleme Ca floresan boyalar ile nöron ve glia içinde ²⁺ transientler bir kurulan ve işlevsel organizasyonunu ve dinamiklerini incelemek için yaygın olarak kullanılan tekniktirENS ^13-17. Ca ²⁺ görüntüleme ICC kalp pili ağları ¹⁸ ve bağırsak düz kas ^19,20 ile uyarılma yayılmasını aydınlatmak için sağlam GI doku bölümleri okuyan önemli bir araç olduğu gösterilmiştir. Bu fizyolojik parametrelerin geniş bir yelpazede soruşturma araştırmacıların sağlayan ve onların uzaysal dağılımı ve zamansal dinamikleri hem de hakkında bilgi sağlar. Hücreler verimli zar-geçirgen floresan göstergeler ve optimize boyama protokolleri ²¹ ile minimal invaziv bir şekilde lekeli olabilir. Bu, in vivo ^23, hem de işlevsel olarak korunmuş preparasyonlar ^14-16,22 bir nöron çok sayıda ve enterik glia izlemek için bir fırsat sunmaktadır. Tüm monte doku preparatlar, Ca ^{2 +} bağlandığmda da floresan artar Fluo-4 gibi yüksek afiniteli bir Ca2 ⁺ gösterge boyası yüklendi ağırlığa sahiptir. Floresan değişiklikler bir CCD kamera ve Ana tarafından kaydedilirdijital ⁶ lize. Ca2 ⁺ gelişi çeşitli uyaranlara nöron ve glial hücre etkileşimlerini, yanıt izleme olanağı ve gerçek zamanlı olarak mide-bağırsak işlemlerinde, bu hücre tiplerinin katılımını sağladı.

İn situ Ca ²⁺ görüntüleme enterik nöronların ve glia sinyal mekanizmaları büyük fikir vermiştir ve hücre kültürü modelleri ^6,24 üzerinde birkaç farklı avantajlara sahiptir. İlk olarak, yerinde hazırlıkları nöronlar ve glia yerli matris ortamını korumak ve sağlam dokuyu hedef bağlantılarının toplu bırakın. İkincisi, genetik ve kültürlü enterik glia morfolojisi önemli ölçüde in vivo ^6,24 oranla değişmiş. Üçüncü olarak, birçok heterotipik etkileşimleri birincil hücre kültüründe kaybetti ve hücre-hücre etkileşimleri değerlendiren bu sınırlar vardır. Kültürlü hücreler de temel özelliklerinin incelenmesi, onların usefulne için uygundur rağmenenterik glia ve nöronlar arasındaki karmaşık etkileşimlerin eğitim için ss sınırlıdır. Sinaptik yollar ²⁵ bozulmadan kalır gibi bir yerinde bir yaklaşım kullanarak incelenmesi nöron glia etkileşim daha fizyolojik ilgili olduğunu. Hücre kültürü yaklaşımlar karşılaştırıldığında, in situ yaklaşım bir sistematik nöronlar ve glia enterik arasındaki karmaşık etkileşimlerin anlaşılması için geliştirilmiş koşullar sunmaktadır. Ayrıca, tüm montaj hazırlıkları içinde ganglionated pleksus düzlemsel organizasyonu hücre içi Ca ^{2 +} geçici floresan görüntüleme için idealdir ve bu teknik ENS nöron-glia aktivitesini değerlendirmek için basit bir yaklaşım sağlar.

NOT: Laboratuvar hayvanlarında doku içeren aşağıdaki prosedürler Hayvanlar 2013 Ötenazi için AVMA Rehberi ile tutarlı ve Michigan State Üniversitesi IACUC tarafından önceden kabul edildi.

1. Doku Hazırlanması

1. Oksijen ya da bir fiziksel bariyer izofluran ile doğrudan temas hayvanları engeller sağlanması, bölmenin tabanında bir emici malzemenin üzerine sıvı izofluran 3-5 ml yerleştirerek% 2.5 izofluran içeren bir hücre araştırma hayvan anestezisi. Kapkaççı sıkıştırarak anestezi derinliği için test.
   NOT: arka bacak hiçbir geri çekilme refleksi olduğunda anestezi derinliği uygun görülmüştür. Uygun anestezi sonra, servikal dislokasyon ile fare euthanize
2. Bir yatar pozisyonda hayvan yerleştirin ve% 70 etanol ile karın cildi temizleyin. Orta hatta karın cildi çimdik forseps kullanın ve 6 cm ortamı yapmak için cerrahi makas kullanınlinea alba boyunca l kesi iç sindirim organları ortaya çıkarmak.
3. Bulmak ve periton içine ileum maruz künt forseps kullanın. Makasla İleal / kolon mezentere kesin ve bağırsak çözülüyor başlar.
4. Bağırsak uzunluğu yeterli sökülmüş sonra, bir ileum hazırlanması için çekum mide ve proksimal barsak distalinden kesti. Büyük bir bağırsak hazırlığı için, rektum çekum ve proksimal kolon distaline kesti.
5. Hızlı bir şekilde bağırsak segmenti çıkarın ve 3 uM nikardipin hidroklorür ve 1 uM skopolamin hidroklorür ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamı ile bir çanak içinde yerleştirmek buz üzerinde (bundan sonra "ortam" olarak adlandırılacaktır). Bu inhibitörlerinin eklenmesi bağırsak düz kas felç mikrodiseksiyon ve sonraki görüntüleme kolaylaştırır.
6. Kurulan anatomik belirteçler dayalı faiz Kes segmenti (örneğin, jejunum, ileum, uzak veya yakın kolon). Tipik haliyle utilizDistal ileum veya distal kolonda e dokusu. Ancak, tüm bağırsak bölgelerinde, yük ve görüntü myenterik nöronlar ve glia izole etmek için aynı temel yordamı kullanın.
7. Soğutulmuş medya ile dolu bir Sylgard kaplı petri istenen bağırsak segmenti ve yerin küçük bir bölümünü (4-6 cm) sökün.
8. Proksimal ve böcek pimleri ile barsak segmentinin distal uçlarını Güvenli ve düz yaparak bağırsak tüp açın, uzunlamasına mezenterik sınırı boyunca kesilir.
9. Ince forseps (# 5 ve # en 5/45 çalışma) ve çok ince yaylı makas kullanılarak mukozal tabaka uzak teşrih yukarı ve dikkatle mukoza tarafı ile hafif gerilim altında düz pin dokusu.
   NOT: eğer düzgün yapılmazsa mukoza çıkarılması ENS için oldukça travmatik olabilir. Kaliteli hazırlıkları için, soyulma veya kazıyarak mukozasında ani kaldırılmasını sınırlamak için özen gösterin. En iyi uygulama mukozayı kaldırın ve ince makas ile altında kesmektir.
10. Daha küçük preparat haline doku kesips görüntüleme yemekleri içine (yaklaşık 0.5 cm ²⁾ ve pin taze medya ile buz üzerinde yerleştirilen (dairesel kas tabakası yukarı bakacak şekilde 4 köşe).
11. Dikkatle myenterik pleksusu maruz ince cımbız ile ayrı alay dairesel kas uzak teşrih. Aşırı germe kaçının.
12. Taze medya ile buz ve değişim çözeltisi geri görüntüleme çanak yerleştirin.
13. Tabağı başına enzim karışımı 2 ml hazırlanması [Dispase 1 U / ml (4.48 mg / 8 mi), kollajenaz tip II, 150 U / ml (5.45 mg / 8 mi) ortam içinde].
14. Buz yemekleri çıkarın ve adım 1.13 enzim karışımı ekleyin.
15. % 5 CO _2/95% hava ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yemekler inkübe edin.
16. Medya 3 kez ve yeniden-pin köşeleri ile yıkayın doku preparatları.

2. Yükleme Fluo-4 Boya

NOT: Gösterge boya ile yüklenen floresan boyalar ve doku tutarken sınırlı ışık ile çalışarak photobleaching kaçının.

1. 4 mcM Fluo-4 yükleme çözeltisi hazırlayın.
   1. 4 mM Fluo-4 stokunun 1.5 ul kana 1.5 ml medya ve 250 mM probenesid stokunun 1.2 ul ekleyin. Flu-4, GM 50 ug (% 0.25 kremafor-EL ile takviye edilmiş DMSO içinde% 20), 4 mM Fluo-4 hazır pluronik F-127, 11.4 ul ilave edilerek hazırlanır.
2. 37 ° C de karanlık bir kuluçka makinesi içinde, 45 dakika boyunca Fluo-4 yükleme çözeltisi içinde preparatlarıyla inkübe edin.
3. Inkübatör çıkarın ve medya ile 3 kez hazırlıkları yıkayın.
4. Medya, 200 mcM probenesit içeren ve görüntüleme önce 37 ° C'de 15 dakika inkübe Exchange ortamı.
   Not: Probenesid nöronlarda çoklu ilaç direnci taşıyıcıları önleyen bir ilaçtır. Bu ilaç eklenmesi boyalar ekstrüde etmek nöronların yetisini baskılayan ve nöronal etiketleme artırır. Probenesid yokluğunda Ca ^{2 +} göstergesi boyaların Toplu yükleme ağırlıklı glial hücre yükleme üretir. probenesid eklenmesi nöronal ve glial tepkilerin görselleştirme sağlar.
5. Hazırlayın Kre Modifiyebs tampon.
   1. Yap bileşenlerin (mM olarak) son konsantrasyonlar olarak takip olduğu tadil edilmiş bir Krebs tamponu,: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 _CaCl2, 1.2 _MgCl2, 1.2 NaH ₂ PO _4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO _3, 1 piruvik asit ve (NaOH ile 7.4'e ayarlanmış, pH) 8 glikoz ihtiva eder. Ca sırasında ²⁺ görüntüleme kas kasılmaları inhibe 3 mcM nikardipini ve 1 mcM skopolamin ekleyin ve diseksiyonu tüm montaj.

3. Görüntüleme ve Analiz

NOT: Bir floresan ışık kaynağı, mikroskop, kaliteli bir CCD kamera ve uygun satın alma yazılımı ile en az bir temel görüntüleme teçhizat kullanın. Işık kaynağı ve özel uygulamaya bağlı olarak diğer bileşenlerin ilave edilmesini değişir. Bir filtre tekerleği ve deklanşör geleneksel xenon ark ışık kaynağı ile kullanılması gerekir. Ancak, LED ışık kaynakları ve aydınlatma sistemleri bu bileşenleri gerekmez.

1. Rec yerleştirinmikroskop altında bölmeyi ording ve birden fazla ısıtılmış şırınga rezervuarlı bir yerçekimi akışlı perfüzyon sistemi kullanılarak 37 ° C Krebs tampon 2-3 ml / dak sürekli perfüzyon oranı oluşturmaktadır. Bir vakum tuzak bağlı her iki giriş ve emme hattında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için emin olun.
2. Parlak bir alan aydınlatma altında odak noktası haline istenen pleksusunu getirin. Fotoğraf beyazlatma yol açabilir doku, ışığa maruz kalmaması.
3. Ganglionlar içinde Fluo-4 yükleme inceleyin ve görüntüleme için sağlıklı ganglionlar seçin. Sağlıksız / hasarlı ganglion otofloresan veya noktalı morfolojisi sergiler ve görüntüleme için kullanılmamalıdır.
4. Ganglion seçildikten sonra, kameraya ışık yolu yönlendirmek ve görüntü elde etme yazılımı ile canlı görüntü elde. Bu ganglion odak ve set görüntü alma hızı ve pozlama süreleri olduğundan emin olun.
   NOT: Görüntü elde etme oranları ve süreleri araştırmacılar kaydetmek istediğiniz olaylara bağlı olarak değişecektir. En deneyleri, görüntüler içinglial Ca ²⁺ cevapları Ca nöronlarda ²⁺ transientler gibi hızlı değildir çünkü geleneksel nöronlar için 2-10 Hz glial hücreler için 0.5-1 Hz ve yukarı elde edilir.
5. Denemeyi başlayın ve 30 saniye için temel aktivite kurmak.
6. Örneğin 2-3 ml / dakika bir oranda yerçekimi akışlı perfüzyon sistemi kullanılarak reseptör agonistleri ve antagonistleri olarak yararlı önceden ısıtılmış ilaçlar uygulanır. Normal tampon bir perfüzyon dönerek agonistleri / antagonistleri uygulanmasını takip ve en az 10 dakikalık bir yıkama / iyileşme süresi sağlar.
   NOT: İlaç uygulama süreleri bireysel bileşik ve deneysel tasarım bağlı olarak değişecektir. Genel olarak, agonist bir 20-30 saniye uygulama nöron ve glial hücrelerdeki G-proteinine bağlı reseptörlerin aktive etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, (örneğin, nikotinik asetilkolin reseptörleri gibi) ligand-kapılı iyon kanallarının en fazla 5-10 saniye uygulama süresi gerektirirler. Daha fazla süre maruz kalma ligand kapılı iyon kanalları hızla dese neden olurnsitize. Antagonistler reseptör yollarının tam blokajını sağlamak için yaklaşık 3-15 dakika boyunca uygulanır. Ancak, bu bir brüt genellemedir ve araştırmacılar her zaman kendi özel paradigmada herhangi bir deneysel ilaç optimize edilmelidir.
7. Deney kayıt ve görünümü time-lapse film durdurun. Uygun görüntü analiz yazılımı kullanarak ilgi dikkatlice seçin bölgeleri (ROI).
8. Normalleştirmek ve ilk başlangıç ​​floresan değeri karşı ROI floresan yoğunluğu karşılaştırmak için yazılımı kullanın. Normalize floresanstaki değişimler, [Ca ^{+ 2]} 'de değişiklikler ile doğrudan orantılıdır.
   1. YG - kadar taşınmış / K = (F ₀₎ / K ₀ (F ₁₎ - kullanılarak daha önce ²⁶ tarif edilen bir yöntemin değiştirilmesine kullanarak ((F ₁ - K ₀₎ / F ₀₎ F1 floresan herhangi bir olan arka plan noktası ve F0 değerlendirme doğruluğunu geliştirmek için, temel floresan olduğunu. Bu değişiklik, yardımcı maddelermyenterik pleksusu yatan kas tabakasının hareketi sergileyen doku hazırlıkları floresan değişiklikleri gürültü azaltılmasında.

Bu tekniğin doğru kullanımı doku hazırlıklarını-montaj, tüm araştırmacılar doğru hücre içi Ca 2+ [Ca 2 +] i enterik nöronların transienti ve glia ölçmek için sağlar. Fare kolon bir myenterik ganglion glia hücresi içinde, bir agonist ile uyandırılmış Ca2 + tepkilerinin bir temsili bir örneği, Video 1 'de gösterilmiştir. Aşağıdaki sonuçlar, bu yöntem kullanılarak elde edilen bazı temsili sonuçlar anlatmak içindir. İlk olarak, Şekil 2, enterik glial ölçen bir deney sonuçlarını göstermektedir [Ca2 +] i kobay kolon uzunlamasına miyenterik pleksus kas (LMMP) preparasyonlar içinde ATP tarafından uyarılmaya yanıt olarak değişir. Özellikle, bu rakam analiz myenterik ganglion ve enterik nöronların yerini gösteren yıldız anahat dahil olmak üzere yukarıda sıralanan deney protokolünde uygun analiz yöntemini gösterir. Ayrıca bu sonuçlar i[Ca 2 +] i kobay olarak myenterik glia seferberlik yüz mikromolar ATP optimal doz llustrate. Bu yanıt enterik glial uyarımı kalibre ve uyaranlara test yanıtları normalleştirmek için kullanılabilir. Sonraki, Şekil 3 düzgün ilgi (ROI) glial hücreler çevredeki bölgeleri seçmek için nasıl elucidates, sarı daireler ülkelerle birlikte gösterilir. Bu sonuçlar aynı zamanda bazal koşullar altında ve farmakolojik uyarıcıya tepki olarak istenen floresan değişimini göstermektedir. Son olarak, Şekil 4, tüm montaj preparasyonlarda [Ca2 +] i yanıtlar için enterik glia ve nöronlar seçmek için uzamsal hususlar gösterilmiştir.

ENS Şekil 1. Organizasyon. ENS iki büyük ganglionated plexuslar içerir. miyenterik pleksus l arasında yer almaktadırongitudinal ve dairesel kas katmanları. submukozal pleksus mukoza ve dairesel kas tabakası arasında yer almaktadır. ENS sadece nöronlar ve glia enterik oluşur. Sinir lifi yolları ganglionlar bağlamak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kobay kolon myenterik pleksus cevap Şekil 2. Enterik glia yerinde ATP. (A) myenterik ganglion Fluo-4 floresan bazal koşullar altında (kesikli çizgi ile belirtilen). Oklar 100 mmol / L ATP, glial hücreler ile stimülasyon üzerine (B). Kalın interganglionic lif yollarının işaret, ancak nöronlar, hızla artış Fluo-4 [Ca 2+] bir artış gösteren floresan (C) Enterik glia 1 mg / L maksimum yanıtları 24 eliciting ile doza bağımlı bir şekilde ATP cevap. Bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu.

Yerinde ATP kolon myenterik pleksus cevap Şekil 3. Murin S-100-GFP + hücreler. (A) S-100-GFP + fare kolon myenterik ganglion glial hücreler (yeşil) (kesikli çizgi ile belirtilen). Çevrede (ROI) ganglionlar içinde glial hücreler çevredeki Altı bölgeleri sarı daireler olarak gösterilmiştir. Oklar ganglion giden kalın lif yolları gösterir. Yıldızlarla d2 enterik nöronların eNote konumu. (B), bazal koşullar altında Rhod-2 floresans aynı gangliyon. (C), 100 umol / L ATP ile stimülasyondan sonra, gliyal hücreler, [Ca2 +] i artmış Rhod- gösterildiği artış ile cevap 2 floresan. (D) A-C'de gösterilen her ROI karşılık gelen izler. (E) D 24 de gösterilen 6 İB'nin yanıtı (SEM ortalama ±) Ortalamalı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Enterik nöron-to-glia iletişim yerinde görüntülemede Şekil 4.. Ca 2 + görüntüleme deney (A) Temsilcisi görüntüleri (yalancı) nerede tüm montajmyenterik pleksus hazırlanması nöronal P2X7 reseptör agonisti BzATP (100 uM, 30 sn) ile meydan. Nöronal agonisti çevreleyen enterik glial hücreler (A ") önce nöron, (A ')' de Fluo4 floresansta bir artışa neden olduğunu not edin. (B) glia (mavi) ve nöronların zaman boyunca flöresandaki değişim analizi (kırmızı ) normal tampon (katı çizgiler BzATP nöronal agonist BzATP. (C), nöronal veya glial tepkilerinin uygulamasından sonra) ve tampon içinde nöronal P2X7 reseptörleri 13 güçlendirmek için düşük Ca + 2 ve Mg + 2 (kesikli çizgiler) ihtiva etmektedir. edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Enterik glia Video 1. Agonist-uyarılmış Ca 2+ yanıtıYerinde. Bu video Ca 2+ gösterge boya, Flu-4 ile yüklü fare distal kolonda bir myenterik ganglion gösterir. belirtildiği zaman glial hücre agonisti, ADP, banyoya ilave edilir. ADP Fluo-4 floresan geçici yükselme ile gözlemlediği gibi enterik glia hücre içi Ca artışı 2+ ortaya çıkarır. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.