Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Özet

Burada, Ca²⁺ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP₃ aracılı Ca²⁺ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Özet

Sitosolik Ca ^{+ 2} iyonları, gen transkripsiyonu, elektriksel uyanlabilirliği ve hücre çoğalması gibi çok kapsamlı işlemlerin kontrol, hemen hemen tüm hücre tiplerinde hücresel aktivitesi sayısız yönlerini düzenleyen. Ca ^{2 +} sinyalizasyon çeşitliliği ve özgünlüğü yerel geçici Ca ^{2 +} microdomains dakika süre boyunca meydana gelen hücre çapında titreşimler ve dalgalar arasında değişen Ca ^{2 +} sinyalleri farklı zaman ve mekansal ölçekler üzerinde hareket oluşturulur hangi mekanizmalar, türemiştir (Ca ²⁺ ponponları) kalıcı milisaniye. Elektron son gelişmeler CCD (EMCCD) kameralar artık> 500 kare saniye ^-1 (fps) oranlarında 128 x 128 piksel mekansal çözünürlüğe sahip yerel Ca ^{2 +} sinyalleri görüntüleme için izin çarpılır. Bu yaklaşım son derece paralel ve tek bir deneyde kanallar veya puf sitelerin yüzlerce eşzamanlı izlenmesini sağlar. Ancak, verilerin büyük miktarlarda üretilen (yaklaşık 1 Gb per dk) ²⁺ olayları uygulanamaz yerel Ca görsel kimlik ve analiz kılıyor. Burada tarif ve satın alma, algılama için prosedürleri göstermek ve geniş alan epi-floresan (WF) ve toplam iç yansıma ikisini de kullanarak Ca ^{2 +} göstergeleri ile yüklenen sağlam memeli hücrelerinde Ca ²⁺ sinyalleri aracılı ₃ yerel IP analizi floresan (TIRF) mikroskopi. Ayrıca, bu yerel Ca ^{2 +} sinyallerin belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak yazılım ortamı Python içinde geliştirilen bir algoritma tarif. algoritma alt piksel çözünürlüğe sahip Ca ²⁺ sürümü siteleri lokalize; veri kullanıcı gözden sağlar; ve bir Excel uyumlu tabloda genlik ve kinetik verileri ile birlikte floresan oranı sinyallerinin zaman dizilerini çıktılar.

Giriş

Kalsiyum iyonları (Ca ²⁺⁾ yayg gen ifadesi, sekresyon ve sinaptik plastisite ¹ uzun ömürlü değişiklikler dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin, çeşitli bir yelpazede düzenler. Ca ^{2 +} Böyle farklı bir şekilde hareket hangi aracılığıyla bir yolu Ca ²⁺ farklı mekansal ve zamansal desenleri ile bir hücre oluşturabilir sinyalleri. Sitozolik örnek küresel yükselme düz kas dokusu ² ise daha küçük [Ca ^2+] tetik daralma, lokalize geçici yükselmeler (yerel Ca ^{2 +} mikro bölgeler) için öğrenme ve bellek ³ için gerekli gen ifadesini teşvik.

Ücretsiz sitozolik [Ca ^{2 +]} ~ 100 nM dinlenme tutulur, fakat hızla Ca ile sitozolüne Ca ²⁺ akını aşağıdaki birkaç mikro-molar plazma zarı ve yanında bulunan ^{2 +} -geçirgen iyon kanallarını çıkabilir hücre içi s Ca ²⁺ kurtuluştores. Bizim laboratuvar endoplazmik retikulum (ER) zarında bulunan Ca ^{2 +} bırakma kanalı oluşturan inositol 1,4,5-trifosfat alıcısı (IP ₃ R), odaklanır. Reseptör siteleri aktive sitozolik hem IP ₃ ve Ca ²⁺ bağlanması üzerine, IP ₃ R kanalı Ca ^{2 +} ER lümeninde tecrit kurtarmak açılır. Ca ²⁺ salınımı uzamsal (Ca ^{2 +} puf ^{4) 2+} Ca yerel sitozolik mikro oluşturmak için IP ₃ Rs küçük bir küme sınırlı kalabilir veya IP ₃ Rs komşu kümelerinin yakınlığı bağlı olabilir Ca ²⁺ indüklediği Ca ^{2 +} -salınımı (YÜÇAM) ^5,6 süreciyle birden puf siteleri işe bir hücre boyunca yaymak.

Gelişmiş mikroskobu IMAGI ile birleştiğinde Tsien ⁷ Roger tarafından geliştirilen floresan küçük moleküllü Ca ²⁺ gösterge boyaların tanıtımı,teknikleri ng, Ca ²⁺ sinyalizasyon anlayışımızı büyük katkı sağlamaktadır. Mikroskopi için kullanılan kameralar son gelişmeler şimdi böyle görülmemiş mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip ponponları gibi geçici yerel Ca ^{2 +} olayları görüntüleme için izin verir. Şu anda mevcut EMCCD kameralar> 500 kare saniye ^-1 (fps) ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken yeni nesil 128 x 128 piksel ile görüntüleme sağlayan (CMOS) kameralar biraz daha yüksek pahasına yüksek piksel çözünürlük, ve hatta daha hızlı sağlamak gürültü seviyeleri. Toplam iç yansıma (TIRF) mikroskopi ile birlikte bu görüntüye artık tek Ca ^{2 +} kanal olayları ^8,9 mümkündür. Impracticable manuel işleme, görsel kimlik ve analiz hale ve otomatik algoritmalarının geliştirilmesi yapma yükümlülüğü büyük veri setleri (min başına yaklaşık 1Gb) oluştururken Bu yaklaşım, aynı zamanda kanal / olayların yüzlerce görüntüleme için izin verir.

Burada, biz floresan Ca ^{2 +} göstergeleri kullanarak sağlam memeli hücrelerinde yerel Ca ^{2 +} sinyalleri görüntüleme prosedürlerini ve protokolleri sunuyoruz. Biz daha TIRF ve geleneksel geniş alan epi-floresan (WF) mikroskopi hem görüntülü yerel Ca ^{2 +} olayların belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak kodlu ortam Python geliştirilen bir algoritma göstermek. Biz IP Ca ^{2 +} sinyalleri -generated ₃ bağlamında bu yaklaşımları açıklamak rağmen, [Ca ^{2 +]} Ca çeşitli ya yüzeye bulunan ²⁺ -geçirgen iyon kanallarını yayılan sitozolik yerel değişiklikleri incelemek için kolayca mükellef olan Membran ya da hücre içi organellerin ^8-10.

Protokol

Biz insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde yerel Ca ^{2 +} olayları görüntüleme ayrıntılı prosedürler sunuyoruz. Bu prosedürler, çoğu hücre tipinde ^8-10 görüntü hücre içi Ca ^{+ 2} sinyallere uyarlanabilir.

Hücreler 1. Hazırlık

1. Kültür hücreleri tedarikçinin Web sitesinde listelenen talimatlara göre yansıması için.
2. Görüntü vermeden önce birkaç gün, hasat hücreleri, 1 ml 0.25% tripsin / EDTA (2-3 dakika) kullanılarak bir doku kültürü şişesi içinde büyütülür. Dekolmanı ardından, tripsin inaktive kültür ortamı eşit hacimde ekleyin.
3. Tabağı başına 3-7 x 10 ⁴ hücre yoğunluğunda cam alt görüntüleme kapları içine bir hemasitometre ve tohum hücreleri kullanılarak bir hücre sayımı yapın. Görüntüleme deneyleri için hücreleri seçin onlar% 60 izdiham (2-3 gün) ulaştığınızda.

Çözümler ve Reaktifler 2. Hazırlık

1. Tamponlu Ca ²⁺ çözülebilmekle HEPES hazırlayın(mM) oluşan tuz çözeltisi (Ca ^{2 +} -HBSS): 135 NaCl, _CaCI2, 1 _MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz 5.4 KCI, 2; pH = 7.4 NaOH ile oda sıcaklığında (RT). 4 ° C 'de glikoz ve mağaza eklenmeden Ca ^{2 +} -HBSS hazırlanması; kullanımdan hemen önce solüsyona glikoz ekleyin.
2. Floresan Ca2 ⁺ göstergesi Cal-520 (1 mM) zara nüfuz edici formları çözünür, Cı-IP ₃ (200 uM) ve EGTA% 20 Pluronic F-127 içeren bir dimetil sülfoksit (100 mM), (DMSO). -20 ° C de, nem ve ışıktan korunan Eppendorf tüpleri ve mağaza içine, bu reaktif maddeleri bir kısım.

3. Yükleme Hücreler Membran-geçirgen, Cal-520 ci-IP ₃ ve EGTA

1. Ca ^{+ 2} -HBSS sırasıyla 5 uM ve 1 uM nihai bir konsantrasyona kadar zara nüfuz edici Cal-520 ve CI-IP ₃ stok çözelti seyreltilerek "yükleme tamponu" hazırlayın.
2. Aspire culture medya ve Ca ²⁺ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın.
3. Ca2 ⁺ çıkarın -HBSS ve karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika süre ile yükleme tampon maddesi içinde hücrelerin inkübe edin.
4. Yükleme tamponu çıkarın ve Ca ²⁺ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın.
   1. Arzu edildiği takdirde, bu aşamada, daha sonra yük Ca ^{2 +} -HBSS 5 mM'lik bir son konsantrasyona kadar stok çözelti seyreltilerek EGTA / AM ile hücreler ve karanlıkta, oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca kuluçkalayın. Bu inkübasyonun ardından, 3.5 adıma devam etmeden önce, hücreler Ca ^{+ 2} -HBSS ile üç kez yıkayın.
5. Yüklenen reaktifler de-esterifikasyonu için izin vermek için 30 dakika süre ile Ca ^{+ 2} -HBSS hücreleri inkübe edin.
6. Görüntüleme hemen önce, son inkübasyon sırasında banyoya sızan olabilecek boya kaldırmak için "taze" Ca ^{2 +} -HBSS Ca ²⁺ -HBSS değiştirin.

4. Ca ²⁺ Image Acquisition

1. 100X APO TIRF objektif üzerine daldırma yağ küçük bir damla (NA 1.49) yerleştirin.
2. Ters mikroskop sahnede görüntüleme çanak monte ve iletilen ışık kullanarak odak noktası haline getirmek hücreleri. Bu kayıt sırasında hareket etmesini önlemek için görüntüleme çanak sabitlemek için önemlidir.
3. Yüksek hızlı EMCCD kamera kullanılarak yayılan floresan (λ> 510 nm) Cal-520 heyecanlandırmak ve toplamak için bir 488 nm lazer ile hücreleri aydınlatın.
   NOT: mikroskop faaliyet yazılım paketi kullanıcı lazer ışını ya ("WF" uyarma için) daha merkezi ya da (TIRF uyarma için) objektif arka diyafram aşırı kenarında tanıtılacak sağlayan bir odaklama lens çevirmek için izin verir.
4. EMCCD yazılımı kullanarak, yerel Ca ^{2 +} olayları yakalamak için gerekli zamansal çözünürlükte veri toplamak için tam 512 x 512 piksel görüntüleme alanını azaltır.
   NOT: Örneğin, orta dörtlü256 x 256 piksel edinimi 66 fps'ye satın alma oranını hızlandırır. Bundan başka, bir izole edilmiş Bitki Mod fonksiyonu kullanılarak 500 fps EMCCD kameranın kare hızını arttırmak için de mümkündür.
5. Otomatik, bazal aktivite birkaç saniye kayıt hücrelere UV flaş teslim ve başka 10-30 saniye kayıt devam etmek yazılım yapılandırın.
   NOT: UV flaş mikroskop arka limanında dikroik ayna yansıtan bir UV ile tanıtıldı Xenon ark ışık kaynağı kullanılarak teslim edilir. UV flaş süresi ve yoğunluğu yerel Ca ^{2 +} olayların İstenen frekansı uyandırmak için ampirik ayarlanır.
6. Görüntü off-line analiz için yığılırken dosyaları kaydedin.

5. Otomatik Ca ²⁺ Görüntü Analizi

NOT: Bu görüntülemek, süreç ve birçok ticari yazılım paketleri kullanılarak yakalanan verileri analiz etmek mümkündür. Ancak, hızla tanımlanması bir otomatikleştirmek için bir algoritma geliştirdikYerel Ca ^{2 +} sinyalleri d analizi. Bu algoritma, mekansal ve zamansal filtre ayrıntılı bir tarifi, mesafe kadar taşınmış / F ₀ ve kimlik / analiz rutinleri üretimi ¹¹ bulunabilir. Bu algoritma, açık kaynak kodlu bir yazılım platformu Python üzerinde çalıştırmak için geliştirilmiştir, tarafından, birlikte örnek deneysel verilere ve detaylı kullanıcı talimatları ile elde edilebilir, e-posta gelen yazar (ismith@uci.edu).

1. Dosyalarını dönüştürme çoklu uçağın .tiff dosya formatına özel yazılmış algoritma ithal edilecek.
2. Analiz algoritması içeren klasörü bulun ve çift tıklayın RUN.EXE.
3. .tiff Dosyayı seçin analiz edilecek.
4. Açık iletişim kutusunda analiz parametrelerini seçin. Örnek verileri için varsayılan parametreleri Şekil 2A bakın.
5. Siyah seviyesini belirlemek ya n yapar görüş alanının bir kısmına imleci hareket ettirerek görüntü yığını ofset edilecekot hücreyi içerirler (Şekil 2B bakınız) veya elle 'Set Siyah Seviye' istemini kullanarak siyah seviyesi girerek.
6. Yazılım (Şekil 2C-F) tarafından analiz aşağıdaki ekranda dört pencere gözlemleyin. C hücrelerinden floresan istirahat bir tek renkli görüntü analiz ediliyor. Bu resmin üzerine bindirilmiş Beyaz kareler olaylara takılı iki boyutlu Gauss fonksiyonları sentroid pozisyonları olarak belirlenen etkinlik konumları vardır.
7. Her olay yere tıklayın ya da olaylar arasında dolaşmak için imleç tuşlarına basın. Bunu yaparken üzerine arka plan çıkarılır, Gauss penceresi D. bu siteler güncelleme her floresan oranı değişiklikleri (mesafe kadar taşınmış / F ₀₎ düzeltti
   NOT: Kırmızı olayları komşu sitelere lokalize faaliyetten 'sızdırma-through' o belirli sitesinden kaynaklanan ve kararlı olduklarını vurguladı. Seçilen yerinde floresan sinyal algılama aştı nerede alt mavi iz gösterirSiyah çizgi söz konusu sitesinden kaynaklanan olayları tanımlar ise eşik, (kırmızı karşılık gelen olayları vurgulanan).
8. Bir kırmızı tıklayın olayın zamansal evrimi görüntüler pencere E, ve birlikte takılan Gauss fonksiyonu mekansal profili ile, olayın mekansal profil zamanı boyunca ortalama görüntüler pencere F güncellemek için olay vurgulanır.
9. El eserler analiz reddedilmesi, böylece tespit edilmiştir olaylarını. Sağ kırmızı tıklayarak tür olayları silmek olayları vurgulanır.
   NOT: Bizim ellerde, Ca tek bir IP ₃ R kanallardan ²⁺ akı kadar taşınmış / F ₀ yaklaşık 0.11 ile sinyalleri çağrıştırıyor, bu nedenle bu ölçüde daha küçük herhangi bir tespit 'etkinlikleri' yanlış pozitif olması muhtemeldir.
10. Kaydet CellR ilgi hücrenin etrafında çizim ve 'seçerek hücre bazında bir veri veya ihracat' Excel kaydet 'seçerek İhracat verileri17 ;.
    NOT: Veriler, orijinal görüntü yığınıyla aynı klasöre kaydedilir.

Sonuçlar

Şekil 1A, CI-IP ₃ yüklü insan nöroblastoma SH-SY5Y hücrelerinin Cal-520 floresan dinlenme bir WF görüntüsünü gösterir. Fotoğraf-sürüme 100 milisaniye UV flaş bu hücrelerin Pozlama i-IP ₃ (Şekil 1A beyaz çevreler tarafından not) ayrık siteleri geçici Ca ^{2 +} ponponları ortaya çıkardı. Bu sitelerde ölçülen Floresan izleri yavaş yavaş bırakma sitesinden yayılan ²⁺ Ca gibi bir çok yavaş düşen faz (Şekil 1B ve 1C) i...

Tartışma

Biz burada açıklamak floresan Ca ^{2 +} göstergeleri kullanarak kültürlü memeli hücrelerinde yerel Ca ^{2 +} olayları görüntüleme için protokolleri. Ayrıca, kimlik ve elde edilen verilerin analizi otomatik bir sezgisel kullanıcı arayüzü ile bir algoritma tanımlamaktadır. Burada tarif edilen prosedür floresan Ca ^{2 +} göstergesi Cal-520 kullanmak, ancak Flu-3, Flu-4, Flu-8 ve Oregon Yeşil BAPTA-1 gibi diğer birçok Ca ^{2 +} duyarlı boyalar görüntü Ca yeterince iyi performans ²⁺...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnsan Nöroblastomu SH-SY5Y hücreleri	ATCC	CRL-2266
Cal-520 /	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-İzopropiliden-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoksi)benzil-myo-İnositol 1,4,5-trisfosfat-Hexakis(propionoksimetil) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/%20 çoğul F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/	Invitrogen	E-1219
35 mm cam tabanlı görüntüleme plakaları	MatTek	P35G-1.5-14-C